유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

이 절차의 전반적인 목표는 유세포 분석을 통해 1차 면역 세포 하위 집단과 형광 나노 입자 상호 작용을 검출하는 것입니다. 이것은 먼저 관심 세포를 나노 입자로 처리함으로써 달성됩니다. 다음 단계에서는 세포 특이적 표면 마커에 대한 항체로 세포를 라벨링한 다음 유세포 분석으로 분석합니다.

궁극적으로 나노 입자와 개별 면역 세포 집단의 상호 작용을 측정할 수 있습니다. 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 나노 입자에 의해 유도된 형광 강도의 변화를 비부착 세포 집단에서 정량화할 수 있다는 것입니다.혈액 백혈구 또는 정제된 단핵구의 나노 입자 내재화는 웰당 1밀리리터에서 관심 세포의 5배에서 5배의 도금으로 시작합니다. 12 웰 플레이트의 각 웰에서.

그런 다음 새로 준비된 작업 형광 이산화규소 나노입자 현탁액 10마이크로리터를 각 실험 웰에 추가하고, 이때 처리되지 않은 대조군 웰에도 동일한 부피의 완전한 배지를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 내재화 후 샘플을 개별 1.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 옮긴 다음 6, 000 회 G 및 실온에서 3 분 동안 샘플을 스핀 다운하여 섭씨 4도에서 10 분 동안 실행 버퍼에서 1:11 비율로 인간 항체의 10 마이크로 리터에서 각 세포 현탁액의 각 세포 현탁액 100 마이크로 리터를 CD 14로 염색합니다. 1ml의 러닝 버퍼에서 결합되지 않은 항체를 씻어낸 후, 유세포 분석을 위해 200마이크로리터의 새로운 러닝 버퍼에 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 스펙트럼 스필오버 보상을 설정하려면 유세포 분석 소프트웨어에서 기기 설정 상자를 연 다음 낮은 유체 속도에서 표지되지 않은 항체 나노입자 자유 샘플을 획득합니다. 형광 나노 입자가 있는 상태에서 보상 설정을 조정하는 것은 나노 입자가 측면 산란을 방해할 수 있으므로 절차의 가장 까다로운 부분이며, 성공을 보장하기 위해 관심 세포 집단의 게이트를 정의해야 합니다. 전압 채널을 조절하여 순방향 및 측면 산란을 수동으로 조정해야 합니다. 그런 다음 원하는 세포 집단 주위에 적절하게 큰 게이트를 그립니다.

라벨링되지 않은 다른 샘플을 로드하고 기기 설정 상자에서 보정 탭을 엽니다. 스필오버 채널의 형광 강도가 형광 색소 양성 및 음성 모집단에 대해 거의 동일해질 때까지 획득하는 동안 보상 계수를 조정합니다. 마지막으로, 염색된 형색소 조절관 각각에 대한 보상을 조정한 후, 나노 입자에 대한 반응으로 백혈구 거동을 더 잘 특성화하기 위한 노력의 일환으로 처리된 나노 입자 시료를 판독한 후, 내재화 분석이 방금 시연된 바와 같이 수행되었습니다.

예를 들어, 이 대표적인 실험에서 3개의 주요 혈액 백혈구 하위 집단은 PBMC 분리 후 전방 및 측면 산란에 의해 명확하게 식별되었습니다. 또한, fz 이산화규소 처리 후 림프구, 단핵구 및 과립구는 형광 강도에 의해 표시된 바와 같이 다른 나노 입자 내재화 속도를 나타냈습니다. 이 이미지에서 나노 입자 내재화는 pbmc에서 정제된 1차 CD 14 양성 단핵구에서 입증되었습니다.

이러한 산점도는 fitz의 이산화규소 나노입자가 있는 상태에서 CD 14 양성 단핵구를 표시합니다. 히스토그램은 형광 강도로 표현된 fitzy positive cells의 정량화를 보여줍니다. 유사한 내재화 실험을 수행했으며, 치료되지 않은 세포를 음성 대조군으로 하여 Fitz의 이산화규소 나노입자의 농도를 증가시켜 처리한 TP one 단핵구를 사용했습니다.

점도표는 나노입자 내재화 후 TP one 세포주에서 변경되지 않은 전방 산란과 함께 측면 산란의 선량 의존적 증가를 보여줍니다. 이 그래프의 데이터는 Fitz의 이산화규소 나노 입자를 사용한 처리는 면역 세포와 나노 입자 간의 상호 작용에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 세포 내 입도의 향상으로 강조된 단핵구의 용량 의존적 내재화를 유도한다는 것을 시사하며, 마이크로 아교 세포는 체외에서 7 일 동안 배양되고 1 시간 동안 나노 입자로 배양되었습니다. 형광 현미경 검사는 많은 수의 GFP 음성, 비부착성 성상세포와 일부 GFP 양성 세포가 혼합된 1차 신경교세포 배양을 나타냈습니다.

이 대표적인 실험에서, 3개의 신경교세포 하위집단은 단일 CD 11 B 항체 염색 CD 11 B, 음성 GFP 음성 성상교세포 및 기타 신경교세포 미세아교세포 CD 11 B 양성 GFP 음성 세포 및 CD 11 B 양성 GFP 양성 하위집단을 사용하여 유세포 분석으로 구별할 수 있었습니다. 후자의 2개의 subpopulation는 GFP 긍정적인 모집단에 의하여 경미하게 증가한 결핍을 가진 nanoparticles를 internalized 할 수 있습니다. 나노 입자 내재화는 막대 도민 이산화규소 나노 입자를 사용하여 이 이미지에서 설명된 것처럼 컨포칼 현미경으로 추가로 확인할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 형광 염료의 표백을 방지하기 위해 샘플을 어두운 곳에 보관하고 항체 배양 중에 샘플을 4도로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 컨포칼 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 나노 입자의 세포 내 국소화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.