유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

이 실험 절차의 전체적인 목적은 유세포 분석법을 통해 형광 나노입자와 일차 면역 세포 하위 집단 간의 상호작용을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 분석 대상 세포를 나노입자로 처리함으로써 수행됩니다. 다음 단계에서는 세포 특이적 표면 마커에 대한 항체로 세포를 염색한 후, 유세포 분석법으로 분석합니다.

최종적으로, 나노입자와 개별 면역 세포 집단 간의 상호작용을 측정할 수 있습니다. 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 나노입자로 인해 유도된 형광 강도의 변화를 부착되지 않은 세포 집단에서 정량화할 수 있다는 점입니다. 혈액 백혈구 또는 정제된 단핵구의 나노입자 내부화를 확인하려면, 12-웰 플레이트의 각 웰에 관심 세포 5×10⁵개를 1 mL의 배지에 분주하여 배양을 시작하십시오.

그런 다음, 각 실험 웰에 갓 준비한 형광 실리카 나노입자 작업 현탁액 10 µL를 첨가하며, 이때 처리하지 않은 대조군 웰에도 동일한 부피의 완전 배지를 첨가합니다. 37 °C에서 1시간 동안 세포 내 흡수를 유도한 후, 샘플을 각각의 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 실온에서 6,000 ×g로 3분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다. 각 세포 현탁액 100 µL를 러닝 버퍼 내에서 인간 항체 10 µL와 1:11 비율로 혼합하여 4 °C에서 10분 동안 배양함으로써 CD 14를 염색합니다. 1 mL의 러닝 버퍼로 결합하지 않은 항체를 세척해 낸 후, 유세포 분석을 위해 세포를 200 µL의 신선한 러닝 버퍼에 다시 현탁합니다.

다음으로, 스펙트럼 스필오버 보정을 설정하기 위해 유세포 분석 소프트웨어에서 기기 설정 상자를 열고, 항체가 표지되지 않은 나노입자 제거 시료를 낮은 유속에서 획득합니다. 형광 나노입자가 존재하는 상태에서 보정 설정을 조정하는 것은 나노입자가 측방 산란에 간섭할 수 있어 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 성공적인 결과를 위해 관심 세포 집단의 게이트를 정의해야 합니다. 전압 채널을 조절하여 전방 및 측방 산란을 수동으로 조정합니다. 그런 다음 원하는 세포 집단 주변에 적절하게 큰 게이트를 그립니다.

라벨이 지정되지 않은 다른 샘플을 로딩하고, 기기 설정 창에서 보정(compensation) 탭을 엽니다. 형광색소 양성 집단과 음성 집단의 스필오버 채널 내 형광 강도가 거의 동일해질 때까지 획득 과정 중에 보정 계수를 조정하십시오. 마지막으로, 단일 염색된 각 형광색소 대조군 튜브에 대한 보정을 조정한 후, 나노입자 처리된 샘플을 측정합니다. 나노입자에 반응하는 백혈구의 거동을 더 잘 특성화하기 위해, 방금 시연한 것과 같이 내부화 분석(internalization assays)을 수행하였습니다.

예를 들어, 이 대표적인 실험에서 PBMC 분리 후 전방 및 측방 산란을 통해 세 가지 주요 혈액 백혈구 하위 집단이 명확하게 식별되었습니다. 또한, fz silicon dioxide 처리 후, 림프구, 단핵구 및 과립구는 형광 강도로 나타난 바와 같이 서로 다른 나노입자 내면화 속도를 보였습니다. 이 이미지들에서는 pbmc에서 정제된 일차 CD 14 양성 단핵구의 나노입자 내면화가 입증되었습니다.

이 산점도들은 fitz의 이산화규소 나노입자가 존재하는 환경에서의 CD 14 양성 단핵구들을 보여줍니다. 히스토그램은 형광 강도로 표시된 fitzy 양성 세포의 정량화 결과를 나타냅니다. 처리되지 않은 세포를 음성 대조군으로 하여, 증가하는 농도의 fitz 이산화규소 나노입자를 처리한 TP one 단핵구를 대상으로 유사한 내부화 실험을 수행하였습니다.

도트 플롯(dot plot)은 나노입자 내재화 후 TP one 세포주에서 전방 산란(forward scattering)은 변하지 않은 반면, 측방 산란(side scattering)은 농도 의존적으로 증가함을 보여줍니다. 이 그래프의 데이터는 fitz의 이산화규소 나노입자 처리가 단핵구에서 세포 내 과립도(intracellular granularity)의 증가로 나타나는 농도 의존적 내재화를 유도한다는 것을 시사합니다. 면역 세포와 나노입자 간의 상호작용에 대한 추가적인 통찰을 얻기 위해, 미세아교세포를 in vitro에서 7일 동안 배양한 후 나노입자와 1시간 동안 함께 배양하였습니다. 형광 현미경 관찰 결과, 다수의 GFP 음성 비부착성 성상교세포와 일부 GFP 양성 세포가 혼합된 일차 글리아 세포 배양 상태임을 확인하였습니다.

본 대표 실험에서는, 단일 CD 11 B 항체 염색을 통한 유세포 분석으로 세 가지 글리아 세포 하위 집단을 구분할 수 있었습니다. 구체적으로 CD 11 B 음성 및 GFP 음성인 성상세포와 기타 글리아 세포, CD 11 B 양성 및 GFP 음성인 미세아교세포, 그리고 CD 11 B 양성 및 GFP 양성인 하위 집단입니다. 후자의 두 하위 집단은 나노입자를 내부화할 수 있으며, GFP 양성 집단에서 그 효율이 약간 더 높게 나타납니다. 나노입자의 내부화는 로드 도미네 이산화규소 나노입자를 사용한 본 이미지에서와 같이 공초점 현미경으로 추가 검증할 수 있습니다.

이 실험 절차를 수행할 때, 형광 염료의 퇴색을 방지하기 위해 샘플을 암소에 보관하고 항체 배양 단계 동안 샘플을 4°C로 유지하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 나노입자의 세포 내 국소화에 관한 추가적인 질문을 해결하기 위해 공초점 현미경 관찰과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.