Name: 유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 학습하세요 유동 세포 계측법을 이용하여 형광 나노 입자와 주요 면역 세포 모집단의 상호 작용을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 비부착 세포 집단에서 나노 입자 내재화를 측정하여 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 폰다 치오있는 Istituto 이탈리아어 디 Tecnologia에 의해 지원되었다. 저자는이 원고의 후원에있는 Miltenyi Biotec은 GmbH의 (베르 기슈 글 라트 바흐, 독일) 인정하고 싶습니다 박사 파올로 Petrucciani 인간 버피 코트를 제공하는 (면역 혈액학 및 수혈 서비스, 병원 LOTTI 폰테 데라, 이탈리아의 피사 현)의 교수 마시모 Pasqualetti (생물학과 - 세포 단위 및 발달 생물학, 피사, 피사, 이탈리아의 대학) 주택 마우스 식민지.

윤리 선언문 인간과 동물의 샘플이 건강의 이탈리아 교육부의 지침에 따라 처리 된 법 92분의 116 및 유럽 공동체위원회 지침 86/609/EEC. 1. 단핵구 세포 배양 <ol><li> 10 % 인간 혈청, 50 U / ㎖ 페니실린 및 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 5 % CO 2에서 37 ° C에서 0.05 MM의 β-머 캅토 에탄올로 보충 RPMI-1640 배지가 포함 된 T-75 플라스크 문화 인간 THP-1 세포. </li><li> 분리 배양 할 때 합류 (매 3-5 일). </li></ol> 2. 버피 코트에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 분리 <ol><li> 분리 프로토콜을 시작하기 전에 인산 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2의 용액을 준비하고, 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 버퍼 (세척 1 95 ml로 5 ㎖ BSA 스톡 용액을 첨가 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), : (20) 희석). 버퍼 가스를 제거하고 2-8 (차가운 곳에 보관° C). 중요 : 거품이 분리 컬럼 (단계 3.2 참조)를 차단할 수 있기 때문에 버퍼가 최적이보다 결과가 발생할 수 있습니다 가스를 제거하지 못하면. 참고 : 항응고제 시트르산 덱 스트로스 식-A (ACD-A) 또는 시트 레이트 포스페이트 덱 스트로스 (CPD)가 대안 적으로 사용될 수있다. 반대로, 다른 종의 다른 알부민 단백질이나 혈청 BSA를 대체 할 수있다. 칼슘 + 마그네슘 또는 2 +를 포함하는 버퍼를 사용하지 마십시오. </li><li> (20~60년 이전 세) 건강한 기증자 버피 코트를 얻습니다. </li><li> 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 혈액을 처리 (각 관 희석 혈액의 35 ML을 처리 할 수​​ 있습니다) 각각의 빈 튜브에 피콜-Paque 15 ㎖를 추가 할 필요 튜브의 수를 결정합니다. </li><li> PBS / BSA / EDTA 용액 (1:4 희석) 24 ㎖의 혈액 8 ㎖를 희석. </li><li> 조심스럽게 (밀도 = 1.077 g / ㎖) 50 ML 원뿔 튜브의 각 피콜-Paque 위에 희석 된 솔루션을 계층. 혼합하지 마십시오혈액과 피콜-Paque. 중요 : 혈액과 피콜-Paque의 혼합을 방지하기 위해 45 ° 각도로 튜브를 잡고 천천히 혈액 혼합물 층. </li><li> 4 ℃에서 30 분 400 XG에 원심 분리기 단핵 세포 (다국적 기업) 과립구 및 적혈구 침전물 반면 인해 피콜-Paque의 삼투압에 높은 밀도, 플라즈마 피콜-Paque 인터페이스에 남아있을 것입니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 PBS / BSA / EDTA와 원심 분리기로 가득 찬 새로운 50 ㎖ 튜브에 계면 세포 (말초 혈액 단핵 세포, PBMC를)을 전송 </li><li> 혈소판을 제거하는 PBS / BSA / EDTA로 두 번 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 10 분 동안 200 XG에 스핀 </li><li> 10 % 인간 혈청과 항생제 또는 단핵 세포 정화를 진행 완료 RPMI-1640 문화가 세포. </li></ol> 3. PBMC를 차에서 단핵구의 정화 <ol><li> 험을 사용하여 자기 비드 분리가 된 PBMC에서 단핵 세포를 분리팬 단핵구 분리 키트 : <ol><li> 가능한 세포 덩어리를 제거하기 위해 30 μm의 나일론 메쉬 (preseparation 필터, 30 μM)을 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다. </li><li> 실온 (RT)에서 10 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는. </li><li> 10 7 전체 세포 당 PBS / EDTA / BSA 버퍼 30 μL의를 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 10 7 전체 세포 당 차단 시약 10 μL의 FcR를 추가합니다. </li><li> 10 7 전체 세포 당 비오틴 항체 칵테일의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 혼합하고 2-8 ℃에서 5 분 동안 품어 </li><li> 10 7 전체 세포 당 버퍼의 30 μl를 추가합니다. </li><li> 10 7 전체 세포 당 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 잘 혼합하고 2-8 ℃에서 10 분 동안 배양 </li><li> PBS / EDTA / BSA 버퍼 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁. </li></ol></li><li> 자기 저전압 회로 차단기ATION <ol><li> 이에 따라 총 세포 수에 적절한 MACS의 기둥 및 MACS 분리기 (MACS 열 시트를 참조하십시오)를 선택합니다. </li><li> MACS 분리기의 자기장에 열을 놓습니다. </li><li> PBS / EDTA / BSA 버퍼의 적절한 양의 세척에 의해 열을 준비 (MS 열 : 500 μL, LS 열 : 3 ㎖). 참고 : 열은 &quot;흐름 정지&quot;하고 건조 실행되지 않습니다. </li><li> 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 풍부한 단핵구 분율을 나타내는 레이블이없는 세포를 포함하는 흐름을 통해 수집합니다. </li><li> PBS / EDTA / BSA 버퍼 (MS 500 μL 및 세척 당 LS 3 ml)로 열 배를 씻으십시오. </li><li> 풍부한 단핵구 세포를 대표하는, 통과 레이블이없는 세포를 수집하고, 3.2.4 절에서 흐름을 통해 추가 할 수 있습니다. 참고 : 열 저수지가 비어있는 경우에만 PBS / EDTA / BSA 버퍼 분주을 추가하여 열을 씻으십시오. </li><li> (선택 사항)에서 열을 제거구분과 적절한 포집 관에 놓습니다. 칼럼에 버퍼를 피펫 (1 ㎖를, LS 열 : MS 열 5 ㎖). 즉시 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표시 nonmonocyte 세포를 세척하십시오. </li><li> 문화는 10 % 인간 혈청과 항생제로 완전한 RPMI-1640 단핵 세포를 정제. </li></ol></li></ol> 4. 전체 혈액에서 단핵구 차의 정화 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 전체 혈액 단핵 세포 분리 키트를 사용하여 전혈에서 단핵 세포를 정화. </li></ol> 5. 혈액 백혈구 및 정제 된 단핵 세포에 나노 입자의 국제화 <ol><li> 12 - 웰 플레이트에 고립 된 PBMC 또는 정제 된 CD14 양성 단핵 세포 접시 5 × 10 5 세포 / ㎖ (1 ㎖ / 웰). </li><li> 100 nm의 작업 농도에 완전 배지에서 소용돌이 FITC-그런가 2 나노 입자 원액과에 resuspend. </li><li> 작업 nanop의 10 μl를 추가합니다1 nm의 나노 입자의 최종 농도에 도달하는 처리 샘플 문서 서스펜션 (100 NM). 각 웰에 처리되지 않은 컨트롤에 대한 완전한 매체의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 1 시간의 내면화는 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 샘플을 수집하고 RT에서 6,000 XG에서 3 분을 원심 분리 한 후. </li><li> RT에서 6,000 XG에서 버퍼 3 분의 실행 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 버퍼를 실행 200 μL에 펠렛을 Resuspend. 세포는 이제 유동 세포 계측법에 의해 읽기위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 6. 주 혼합 된 아교 문화의 절연 (Bertero보기 등. 7) 7. 혼합 된 아교 플루 세포 배양을 Replating <ol><li> 다음 센과 10 ㎖를 추가하고 5-7 분 동안 37 ° C에서 알을 품다, (W / CA 2 + / 마그네슘 2 + O) PBS 10 ㎖로 한 번 T-75 플라스크를 씻으십시오. </li><li> T-75의 표면에서 세포를 분리하고 해산하기 위해 위아래로 여러 번 뜨는을 피펫세포 집합체. </li><li> 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 혈구와 세포를 세는 세포 현탁액의 소량을 모은다. </li><li> RT에서 300 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 상등액을 제거하고 신경교 완전 배지에서 5 × 105 세포 / ml의 최종 농도로 펠렛을 재현 탁. </li><li> 24 웰 플레이트에 0.5 ㎖ / 잘 플레이트 및 세포 나노 입자 치료 전 2-4 시간 동안 정착하자. </li></ol> 8. 소교 세포에 나노 입자 국제화 <ol><li> 각 웰 (치료 컨트롤에 대한) 완전한 아교 세포 배양 배지 500 μL 또는 (처리 샘플에 대한) 완전한 아교 배지에서 2 배 로다 민 - 그런가 2 나노 입자 현탁액 500 μl를 추가합니다. </li><li> 선택한 시점에서 nonrapid 고착 세포의 분리를 허용하고 2 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브를 수집하는 세포를 피펫. </li><li> 500 μl를 추가합니다센과의 각 웰에 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 나머지 세포 분획을 분리하고 이전 단계의 해당 nonadhering 세포를 각각의 샘플을 수집합니다. </li><li> RT에서 300 XG에서 3 분 동안 원심 분리. </li><li> 버퍼를 실행 AutoMACS 100 μL에 펠렛을 Resuspend. </li></ol> 9. 는 CD11b-VioBlue로 염색 <ol><li> 버퍼를 실행에 세포 현탁액 (1시 11분 비율) 100 μL에 VioBlue-CD11b를 인간 / 마우스 항체의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 10 분 알을 품다 </li><li> 버퍼를 실행의 1 ML을 추가하고 세포 현탁액을 섞는다. </li><li> 300 X g에서 3 분 동안 원심 분리기 각 샘플. </li><li> 뜨는을 취소하고 버퍼를 실행하는 100 ~ 150 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 사이토에 샘플을보기 (마지막 두 단계 사이에 4 ° C에서 샘플을 저장). 중요 : 샘플을 분석하기 전에, 중복 신호의 보상을 진행 난N 방출 스펙트럼은 서로 다른 형광 색소 (fluorochrome가 공역 나노 입자 또는 항체) 사이에서 관찰. </li></ol> 10. 보상 이상의 스펙트럼 유출 <ol><li> &quot;기기 설정&quot;상자 (모든 기기의 소프트웨어 프로그램에 존재)를 엽니 다. 주 : 자료 표에보고 된 것과 다른 악기를 사용하는 경우, 수집 정보의 악기 별 설명서를 참조하십시오. </li><li> 낮은 유체 속도 (기기에 의해 허용 된 경우)에서 (나노 입자없이) 처리되지 않은 샘플을 획득. 획득 동안, 수동으로 채널 전압을 조절함으로써 조절 전방 및 측면 산란 (각각 FSC와 SSC,). 참고 : 최상의 음모에 전체 세포 인구를 시각화하기 위해 SSC와 FSC 축 스케일을 수정합니다. 그 각각의 세포 유형에 대한 템플릿을 설정하는 계기가 만들어 저장하고 미래의 인수를 사용할 수 있습니다. </li><li> 특정를 엽니 다소프트웨어의 &quot;지역&quot;탭을 선택합니다. 원하는 인구의 주위에 적절한 큰 지역 ( &quot;문&quot;)을 그립니다. 참고 : 나노 입자의 국제화가 세포의 SSC 변화를 유도한다. 게이트가 너무 밀접 그 세포 집단의 주위에 제한되는 경우에, 취득 된 데이터가 아마도 검출 될 셀 부분을 놓칠 것이다. </li><li> 두 흠 샘플, 빈 샘플로 사용하기 위해 하나 PI 염색 (선택 사양)에 대한 보상을위한 하나, 보상 될 각 형광 채널에 적합한 형광 색소와 하나의 스테인드 샘플을 사용합니다. 참고 : 실험 라벨에 사용되는 각 형광 색소 - 공액 항체 다른 1.5ml의 샘플 튜브를 사용한다. </li><li> &quot;기기 설정&quot;상자에서 &quot;보상 탭&quot;을 엽니 다. 증가 또는 유출 채널에서 형광 강도는 형광 색소 POS 대해 대략 동일 할 때까지 수집하는 동안 보상 계수를 감소을 직관적이고 부정적인 인구. </li><li> 보상이 조정 된 후 나노 입자 처리 된 샘플을 획득. </li></ol>

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</ol>

저자는있는 Miltenyi 생명 공학 GmbH의이 원고의 제출을​​ 후원하는 것을 선언합니다. HIQ 나노 회사 ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> )는 나노 기술 IIT에서 생겨 회사를 분사합니다.

실험 프로토콜을 고려해야하는 매우 중요한 점을 제시한다. 그것은 높은 온도와 조명에 부정적인 염색 수율에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 모든 염색 단계에서 (얼음) 4 ° C에서 아마도 어둠 속에서 작업을 정말 중요합니다. 나노 입자는 더 나은 사용 직전에 재현 탁 할 초음파 처리 할 수​​ 있습니다. 세포 계측법 분석 정확한 흐름은 서로 다른 채널의 정확한 교정이 필요합니다. 장비의 교정은 모든 실험 세션 전에 수행해야합니다. 장비와 기술적 인 문제 외에, 또한 항체 라벨에 문제가있을 수 있습니다. 그것은 적절한 농도로 항체를 사용하는 것이 필수적이다. 농도가 너무 높거나 너무 낮은 경우, 불만족 신호 강도가 결과 될 수있다. 이 기술 우려의 단점 단 분산 샘플 작업의 필요, 무능력 집중하는신호 (즉, 다른 세포 구획)의 기원의 사이트. 병용하는 형광 색소의 선택에 어떤 제한도있다 : 여기 및 방출 파장 대역은 충분히 그들의 적절한 측정을 허용하도록 구분되어야한다. 사용 된 항체 스펙트럼이 겹치는 경우, 정확한 보정이 필요합니다. 유동 세포 계측법은 존재 또는 나노 입자의 부재에서 세포 분석을위한 강력한 방법입니다. 이 기술은 세포의 multiparametric 연구, 조사 이벤트의 높은 숫자를 허용, 분석 (1000 개 이상의 셀 / 초), 재현성 및 통계 수치의 신속성. 샘플은 세포 생존 능력을 상실하지 않고 처리 될 수있다. 형광 표지 된 나노 입자를 사용하여이 세포막에 노출되는 특정 마커에 의해 식별되는 셀 모집단, 그들의 내재화를 한정하고 정량화 할 수있다. 세포 매개 변수의 존재에 변경할 수 있습니다<html> pecific 나노 입자. 연구의 목적에 따라 이러한 변화는 비례 적으로 증가하는 나노 입자 내재화 율 증가 셀의 측면 산란으로서, 특정 현상을 식별하기 위해 사용될 수있다. 세포 표면의 나노 입자 - 유도 변형은 기술의 한계를 나타낼 수있다. 이러한 이유로, 세포막 수용체 회전율 항상 고려하여주의해야하고 아마도 정확하게 그 세포 집단의 특성을 사전에 알. 나노 입자의 오버로드 된 샘플에서 막 삼투의 극단적 인 손상은 세포의 죽음으로 이어질 수 있습니다. 나노 물질의 용량 의존적 독성은 경험적으로 각 세포 인구에 대한 검사를해야한다. 명확하게 정의 된 죽은 세포는 형광 정량에서 제외해야합니다. 예를 들어, 아 넥신 V / PI 염색은 일반적으로 괴사 및 사멸 두 세포를 감지하는 데 사용되는 여러 가지 방법 중 하나입니다. &quot;&gt; GFP - 표현 일차 전지는 또한 특정 세포 모집단을 선택하고 prelabeling없이 데이터를 수집 할 수있는 강력한 도구입니다. 보완 형광 나노 입자와 결합은 세포 나노 입자의 상호 작용의 매우 빠르고 정확한 정량화. 약물이나 유전자 전달이 생각됩니다 수 있습니다 선택된 조직으로 특정 약물 부하를 해제 할 수 나노 입자의 응용 프로그램에 의해 미래에 개선 될 수있다. 나노 입자 조제 용으로 납품 사업자 별 및 / 또는 면역 조절제의 고용 세포 나노 입자의 상호 작용을 연구하는 생물 환경의 지식 (즉, 유동 세포 계측법을 통해)가 필요합니다.

나노 물질은 요즘 생물 의약 1 잠재적 인 응용 프로그램을위한 생명 과학자의 관심을 고취하고 있습니다. 무기 및 유기 물질의 다양한 물리적 상이한 형상 및 화학적 특징으로 나노 구조체를 제조하는데 사용될 수있다. 이러한 구조 중, 구형의 설계 나노 입자 진단 및 번역 상 약 2 큰 잠재력을 보여 주었다. 핵심 표면 디자인 가능한 애플리케이션에 의해 구동되고 있으며 나노 접촉과 상호 작용을 다음 표적 세포 반응의 심오한 연구를 의미한다. 의도적으로 인체에 투여 될 것으로 생각되고 나노 입자는 면역 세포의 여러 종류가 직접 닿지 것이다. 몸의 무결성을 유지하기 위해 자신의 책임은 그 나노 의학 3 조사의 중요한 주제 있습니다. 타고난 면역 시스템의 세포 부분은 주로 phago로 표현된다cytes. 그 중에서도, 단핵구 / 대 식세포 계통은 중추 신경계 상주 미세 아교 등 유래 세포는 면역 방어 4,5에서 중요한 역할을한다. 그들은 외국기구와 발생 후 몇 시간 이내에 보호 반응을 트리거 할 수 있습니다. 또한, 단핵 세포는 좌표와 사이토 카인의 방출을 통해 적응 면역 반응을 지시합니다. 이러한 모든 이벤트도 크게 면역 시스템 (6)에 의해 &quot;비 자기&quot;로 인식되는 설계 자료의 존재에 발생합니다. 역사적으로 세포 분석을위한 면역학에서 사용되는 방법 중, 가장 강력한 도구 중 하나를 나타내는 유동 세포 계측법. 또한, (종종 배제 또는 하나의 세포막 단백질의 존재를 악용) 특정 면역 모집단의 확인 또는 정제를위한 기술들은 허용 가능한 특정 일차 CE에 특정 나노 입자의 효과를 정밀 조사LL 형 7. 그러나 세포는 나노 입자에 노출 된 후 생리 및 형태 학적 변화를 제시 할 수있다. 뿐만 아니라, 나노 입자는 얻어진 결과 8에 영향을 미치는 정의 파장에서 같은 빛의 흡수 또는 방출과 같은 특정 광학 매개 변수를 방해 할 수 있습니다. 그래서, 사용 및 새로운 재료의 연구에 고전 면역 학적 분석의 궁극적 인 적응의 한계는 고려되어야한다. 이 작품은 유동 세포 계측법에 의해 기본 면역 세포와 나노 입자의 상호 작용의 검출에 관한 것이다. 이 문제를 해결하기 위해, 50 nm의 FITC-SiO2로 나노 입자는 방법을 설명하기위한 모델 나노 재료로서 사용 하였다. 실리카 입자는 나노 미터 스케일에서 매우 정확한 방식으로 제조 할 수있다. 이러한 전하 또는 소수성과 같은 크기, 모양 및 표면 특성은 미세하게 자신의 생체 적합성 9를 증가하도록 조정 할 수 있습니다. 이 나노 입자들을 사용할 수 있도록 많은 기능의 SiO약물 전달을위한 모델은 10 입자. 또한, 형광 염료 또는 양자점 포획 또는 영상을 목적으로 11 유용한 나노 도구를 제공하는이 입자에 연결 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td>37 &deg에서 따뜻하게; 사용 전 C 수조</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (ATCC 수정)</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>37°C에서 따뜻하게 해; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신, 액체</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼 (lot n&deg; 1131917)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2.5%</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>인간 풀 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue human & mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-336</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA 재고 솔루션&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 헹굼 솔루션&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>러닝 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-747</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 러닝 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Human Pan monocyte 분리 키트&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>전혈 컬럼 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-545</td><td></td></tr><tr><td>보존혈 CD14 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-879</td><td></td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 용액&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터 30 &마이크로; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>MACS퀀트 분석기 유세포 분석기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>MACS퀀트 캘리브레이션 비드</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-607</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>GEH17544202</td><td></td></tr><tr><td>FITC-SiO2 나노 입자(50nm, +45mV)</td><td>HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>로다민-SiO2 나노 입자(50nm, +45mV)</td><td>HiQ-Nano Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트 Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

설계 나노 입자는 치료 및 진단 목적을 위해 매우 유망한 속성이 부여됩니다. 이 작품은 면역 세포와 나노 입자의 상호 작용을 연구하는 유동 세포 계측법에 의한 분석의 신속하고 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 주요 면역 세포는 쉽게 항체 매개 자기 분리에 의해 인간 또는 마우스 조직으로부터 정제 할 수있다. 첫번째 예에서, 플로우 사이토 미터로 실행 다른 세포 집단 내부 복잡도 셀과 관련된 셀의 크기에 비례 전방 산란 광 (FSC), 및 측면 산란 광 (SSC)에 의해 구별 될 수있다. 더욱이, 특정 세포 표면 수용체에 대한 형광 표지 된 항체는 동일한 샘플 내의 여러 모집단의 식별을 허용한다. 세포가 자신의 생리 및 형태 학적 상태를 변경 외부 자극에 의​​해 증폭 될 때 종종 이러한 모든 기능은 다양합니다. 여기서, 50 nm의 FITC-SiO2로 나노 입자 번째를 식별하는 모델로서 이용된다인간의 혈액 면역 세포에 나노 재료의 전자의 국제화. 세포의 형광 및 측면 산란 빛의 증가는 나노 입자와 배양 후 우리는 시간과 나노 입자의 세포 상호 작용의 농도 의존성을 정의 할 수. 또한, 이러한 프로토콜은 기본 미세 아교 세포, 중추 신경계 거주 면역 세포, 특히 단핵구 / 대 식세포 계통의 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 돌연변이 생쥐에서 분리와 로다 민 - 그런가 2 나노 입자의 상호 작용을 조사하기 위해 확장 할 수 있습니다. 세포에 나노 입자의 국제화와 관련된 데이터를 공 초점 현미경으로 확인 된 세포 계측법 마지막으로 흐른다.

계측법 다른 셀을 식별하고 특성화하는 유용한 도구이고 그런 단핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 수지상 세포와 같은 특정 면역 세포를 식별하는 선택의 기술이다 ​​흘러 백혈구의 다른 모집단. 더 나은 나노 입자에 대한 응답으로 백혈구 동작을 특성화하기위한 노력의 일환으로, 우리는 (THP-1 세포, 그림 3) 건강한 기증자의 혈액 (그림 1, 2)에서 인간 단핵구 세포주에 고립 된 차 백혈구와 국제화 분석을 수행 . 도 1a에보고 된 바와 같이, 세 가지 주요 혈액 백혈구 모집단 명확 PBMC를 분리 한 후에 전방 및 측면 산란에 의해 확인되었다. 또한, FITC-SiO2를 처리 한 후, 림프구 (회색), 단핵 세포 (파란색)와 과립구 (적색) 다른 N이같은 녹색 형광 강도 (그림 1B)로 표시 anoparticle의 국제화 속도. 설명 프로토콜 된 PBMC에서 기본 CD14 양성 단핵 세포의 정화. 그림 2A는 FITC-그런가 2의 존재 CD14 + 단핵 세포의 도트 플롯 유동 세포 계측법을보고 할 수 있습니다. 그림 2b는 표시 같은 세포에서 계량 및 표현 FITC-SiO2를 내면화 로그 스케일 히스토그램. 유사 내재화 실험은 FITC-SiO2로 나노 입자의 농도 증가로 처리 THP-1 단핵 세포에서 수행 하였다. 처리되지 않은 세포는 대조군으로 사용 하였다. 그림 3a는 THP-1 세포주에서 산란 변경 전방과 측면 산란 용량 의존적 증가를 보여줍니다. 그림 3b에 함께 각 시험 FITC-그런가 2 나노 입자의 농도 SSC와 FSC의 히스토그램, 형광 강도를 의미 (MFI) 정량화가 표시됩니다. 이 데이터는 FITC-그런가 2 나노 입자 치료는 세포 단위의 향상 (측면 산란)과 형광 (녹색 채널)에 의해 강조 단핵 세포에서 농도 의존적 내면화를 유도하는 것이 좋습니다. 면역 세포와 나노 입자 사이의 상호 작용의 타입으로 추가 통찰력을 얻기 위해, 주 혼합 신경교 배양 격리시키고, 미세 아교 세포는 중추 신경계 상주 면역 세포를 정제 하였다. 녹색 형광 미세 아교 세포를 발현하는 형질 전환 마우스 모델의 사용은 다른 신경 염증 기전의 시각화를 허용한다. 이 작품에 사용 된 형질 전환 마우스 B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J는 CX3CR1 프로모터 (12)의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현한다. 시험 관내 (DIV) 7 일 후, 형광 현미경은 성상 세포의 큰 숫자 (GFP 부정적인 자기편 세포와 혼합 차 아교 문화를 보여줍니다들) 및 일부 녹색 세포 (GFP 양성,도 5a). GFP - - (성상 교세포 및 다른 신경 교세포), 미세 아교 세포는 CD11b + GFP + 세포의 제 별개 기 및 제 CD11b를이 마우스 모델에서, 세 가지 폐해 모집단은 단일는 CD11b 항체 염색하여 유동 세포 계측법에 의해 구별 될 수있다 세 번째는 CD11b +의 GFP - 모집단 (그림 4A). 분석 (그림 4B) 유동 세포 계측법에 의해 도시 된 바와 같이이 두 후자의 모집단은 모두 (CX3CR1 프로모터의 전사에 의한 순찰 미숙 미세 아교 세포를 나타내는) GFP + 인구에 의해 약간의 효율성 향상과 나노 입자를 내면화 할 수 있습니다. 발생한 내재화 더욱도 5b에 도시 된 바와 같이 로다의 SiO2 나노 입자의 동일한 최종 농도를 사용하는 공 초점 현미경에 의해 확인 될 수있다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> 그림 1. 세 가지 주요 혈액 백혈구의 고립 된 혈액 백혈구 측면 산란 대 (FSC)을 산란.) 대표 앞으로의 FITC-그런가 2 나노 입자의 내면화 (SSC)는 피콜-Paque 격리 혈액 백혈구의 도트 플롯 유동 세포 계측법. B) 녹색 형광 오버레이 히스토그램 플롯 1 시간 동안 1 nM의 FITC-그런가 2 나노 입자 (+45 MV)의 존재 세포 모집단은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <stronG&gt; 그림 2. 의 존재 정제 된 단핵 세포 모집단의 측면 산란 대 (FSC)를 산란 FITC-그런가 2 나노 입자 CD14의 내면화 + 정제 단핵구.) 대표 전진 (SSC)로 정제하여 CD14 양성 단핵 세포의 도트 플롯 유동 세포 계측법. B) 녹색 형광 히스토그램 플롯 1nM 중에 FITC-그런가 1 시간 동안 2 나노 입자 (+45 MV는). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> 그림 3. THP-1 세포 측 scatterin 대 (FSC)을 산란.) 대표 포워드에 FITC - 그런가 2 나노 입자의 내면화에 미치는 영향G는 (SSC) 앞으로 (FSC)와 녹색 산란, 측면 산란의 농도. B) 농도 의존적 변화 (SSC)를 증가 FITC-그런가 2 나노 입자의 1 시간 노출 다음, THP-1 단핵구 세포 라인의 도트 플롯 유동 세포 계측법 FITC-그런가 1 시간 동안 2 나노 입자 (+45 MV)의 존재 형광. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> 그림 4. 홍보의 도트 플롯 세포 계측법는 CD11b-VioBlue 흐름 대 로다 민 - 그런가 B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J 생쥐에서 분리 된 주요 미세 아교 세포에 2 나노 입자의 국제화.) 녹색 형광 단백질 (GFP)B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J 생쥐에서 분리 imary 혼합 된 아교. 는 CD11b + GFP +와는 CD11b + GFP -. 인구 (30)에 대해 각각 오른쪽 상단과 오른쪽 하단 사분면, B) 1 nM의 로다 민 - 그런가 2 나노 입자 (+45 MV)의 존재에있는 미세 아교 세포의 모집단의 적색 형광 오버레이 히스토그램 플롯에 표시됩니다 분 제어 (회색 막대 그래프) 대 (빨강 막대 그래프). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> 그림 5. 7 DIV와 (B) 공 초점 현미경에 GFP + - 미세 아교 세포의 시각화. (A) 형광 현미경로다 민 - 그런가 2 나노 입자의 내면화 GFP + - 미세 아교 세포 (빨간색 화살표). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 유세포 분석법을 통해 형광 나노입자와 일차 면역 세포 하위 집단 간의 상호작용을 검출하는 것입니다. 이는 먼저 분석 대상 세포를 나노입자로 처리함으로써 수행됩니다. 다음 단계에서는 세포 특이적 표면 마커에 대한 항체로 세포를 염색한 후, 유세포 분석법으로 분석합니다.최종적으로, 나노입자와 개별 면역 세포 집단 간의 상호작용을 측정할 수 있습니다. 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 나노입자로 인해 유도된 형광 강도의 변화를 부착되지 않은 세포 집단에서 정량화할 수 있다는 점입니다. 혈액 백혈구 또는 정제된 단핵구의 나노입자 내부화를 확인하려면, 12-웰 플레이트의 각 웰에 관심 세포 5×10⁵개를 1 mL의 배지에 분주하여 배양을 시작하십시오.그런 다음, 각 실험 웰에 갓 준비한 형광 실리카 나노입자 작업 현탁액 10 µL를 첨가하며, 이때 처리하지 않은 대조군 웰에도 동일한 부피의 완전 배지를 첨가합니다. 37 °C에서 1시간 동안 세포 내 흡수를 유도한 후, 샘플을 각각의 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 실온에서 6,000 ×g로 3분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛화합니다. 각 세포 현탁액 100 µL를 러닝 버퍼 내에서 인간 항체 10 µL와 1:11 비율로 혼합하여 4 °C에서 10분 동안 배양함으로써 CD 14를 염색합니다. 1 mL의 러닝 버퍼로 결합하지 않은 항체를 세척해 낸 후, 유세포 분석을 위해 세포를 200 µL의 신선한 러닝 버퍼에 다시 현탁합니다.다음으로, 스펙트럼 스필오버 보정을 설정하기 위해 유세포 분석 소프트웨어에서 기기 설정 상자를 열고, 항체가 표지되지 않은 나노입자 제거 시료를 낮은 유속에서 획득합니다. 형광 나노입자가 존재하는 상태에서 보정 설정을 조정하는 것은 나노입자가 측방 산란에 간섭할 수 있어 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 성공적인 결과를 위해 관심 세포 집단의 게이트를 정의해야 합니다. 전압 채널을 조절하여 전방 및 측방 산란을 수동으로 조정합니다. 그런 다음 원하는 세포 집단 주변에 적절하게 큰 게이트를 그립니다.라벨이 지정되지 않은 다른 샘플을 로딩하고, 기기 설정 창에서 보정(compensation) 탭을 엽니다. 형광색소 양성 집단과 음성 집단의 스필오버 채널 내 형광 강도가 거의 동일해질 때까지 획득 과정 중에 보정 계수를 조정하십시오. 마지막으로, 단일 염색된 각 형광색소 대조군 튜브에 대한 보정을 조정한 후, 나노입자 처리된 샘플을 측정합니다. 나노입자에 반응하는 백혈구의 거동을 더 잘 특성화하기 위해, 방금 시연한 것과 같이 내부화 분석(internalization assays)을 수행하였습니다.예를 들어, 이 대표적인 실험에서 PBMC 분리 후 전방 및 측방 산란을 통해 세 가지 주요 혈액 백혈구 하위 집단이 명확하게 식별되었습니다. 또한, fz silicon dioxide 처리 후, 림프구, 단핵구 및 과립구는 형광 강도로 나타난 바와 같이 서로 다른 나노입자 내면화 속도를 보였습니다. 이 이미지들에서는 pbmc에서 정제된 일차 CD 14 양성 단핵구의 나노입자 내면화가 입증되었습니다.이 산점도들은 fitz의 이산화규소 나노입자가 존재하는 환경에서의 CD 14 양성 단핵구들을 보여줍니다. 히스토그램은 형광 강도로 표시된 fitzy 양성 세포의 정량화 결과를 나타냅니다. 처리되지 않은 세포를 음성 대조군으로 하여, 증가하는 농도의 fitz 이산화규소 나노입자를 처리한 TP one 단핵구를 대상으로 유사한 내부화 실험을 수행하였습니다.도트 플롯(dot plot)은 나노입자 내재화 후 TP one 세포주에서 전방 산란(forward scattering)은 변하지 않은 반면, 측방 산란(side scattering)은 농도 의존적으로 증가함을 보여줍니다. 이 그래프의 데이터는 fitz의 이산화규소 나노입자 처리가 단핵구에서 세포 내 과립도(intracellular granularity)의 증가로 나타나는 농도 의존적 내재화를 유도한다는 것을 시사합니다. 면역 세포와 나노입자 간의 상호작용에 대한 추가적인 통찰을 얻기 위해, 미세아교세포를 in vitro에서 7일 동안 배양한 후 나노입자와 1시간 동안 함께 배양하였습니다. 형광 현미경 관찰 결과, 다수의 GFP 음성 비부착성 성상교세포와 일부 GFP 양성 세포가 혼합된 일차 글리아 세포 배양 상태임을 확인하였습니다.본 대표 실험에서는, 단일 CD 11 B 항체 염색을 통한 유세포 분석으로 세 가지 글리아 세포 하위 집단을 구분할 수 있었습니다. 구체적으로 CD 11 B 음성 및 GFP 음성인 성상세포와 기타 글리아 세포, CD 11 B 양성 및 GFP 음성인 미세아교세포, 그리고 CD 11 B 양성 및 GFP 양성인 하위 집단입니다. 후자의 두 하위 집단은 나노입자를 내부화할 수 있으며, GFP 양성 집단에서 그 효율이 약간 더 높게 나타납니다. 나노입자의 내부화는 로드 도미네 이산화규소 나노입자를 사용한 본 이미지에서와 같이 공초점 현미경으로 추가 검증할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, 형광 염료의 퇴색을 방지하기 위해 샘플을 암소에 보관하고 항체 배양 단계 동안 샘플을 4°C로 유지하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후, 나노입자의 세포 내 국소화에 관한 추가적인 질문을 해결하기 위해 공초점 현미경 관찰과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

이 동영상은 생쥐의 눈에서 유리체강내 전달 후 형광 생체 입자의 미세아교세포 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석을 보여줍니다. 유세포분석법은 CD11b를 발현하는 살아있는 세포를 검출하고 녹색 형광을 보이는 식세포 미세아교세포를 Ly6C 발현 단핵구 및 Ly6G 발현 호중구를 포함한 다른 골수성 세포와 구별합니다.

유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

신경 세포 유형에서 표면 항원 및/또는 세포 내 항원의 유세포 분석을 위한 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 신경생물학자가 이 강력한 기술을 활용할 수 있도록 실험 계획의 중요한 측면, 단계별 방법론적 절차 및 유세포 분석의 기본 원리를 설명합니다.

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

이 원고는 살아있는 세포에서 직접 형광 표지된 나노 입자의 세포내이입 후 세포 내 유전자 발현을 검출할 수 있는 새로운 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포의 조작을 필요로 하지 않으며 표적 유전자 또는 종에 대해 제한되지 않습니다.

형광 표지 된 나노 입자를 사용하여 쥐, 인간과 돼지 유래의 살아있는 세포에서 세포 내 유전자 발현의 검출

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

바이러스 또는 세포외 소포체는 표면 항원을 인식하는 항체에 결합된 15nm 자성 나노입자로 면역포획되었습니다. 포획된 비리온 또는 소포는 다른 표면 항원에 대한 형광 항체로 표지되었습니다. 그 결과로 생성된 복합체는 높은 자기장에서 분리되고 형광에 트리거된 기존 유세포 분석기로 분석되었습니다.

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

학습하세요 유동 세포 계측법을 이용하여 형광 나노 입자와 주요 면역 세포 모집단의 상호 작용을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 비부착 세포 집단에서 나노 입자 내재화를 측정하여 면역 반응 연구에 활용됩니다.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

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