Name: 에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별 녹농균 사용 미니 himar1 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 배우세요 미니 himar1 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발을 사용하여 녹농균에서 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자를 식별하는 방법을. 이 기술은 미생물학 및 유전학 연구에서 유전자 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 바이오 메디컬 연구 우수 웨스트 버지니아 아이디어 네트워크에 미국 항공 우주국 웨스트 버지니아 공간 부여 컨소시엄 (NASA WVSGC), 낭포 성 섬유증 재단 (CFF-YU11G0)와 NIH P20RR016477 및 P20GM103434에 의해 지원되었다. 우리는이 작업과 기술 지원을 Vonya M. Eisinger 감사합니다.

1. 균주의 제조 및 Biparental 활용 <ol><li> E.에게 접종 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양기에서 겐타 마이신과 장소의 15 ㎍ / ㎖로 보충 루리아 국물 (LB) 5 ㎖의 대장균 SM10/λpir/pFAC </li><li> P.에게 접종 녹농균 변형 LB 5 ㎖의 PAO1, 그리고 흔들리는 인큐베이터에있는 장소 하룻밤 42 ℃에서 </li><li> OD 하룻밤 문화 (600)를 측정하고 PAO1와 E 같은 양을 혼합 콜라이 pFAC은 최종 부피는 1-1.4 ML 사이 그러한된다. </li><li> 5 분 6,000 XG에 원심 분리기의 혼합물. </li><li> 한편, 활용을 위해 LB 플레이트를 건조 : 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 열려있는 판을 둡니다. </li><li> 세포 혼합물로부터 상층 액 50 μL를 제외한 나머지를 모두 제거합니다. </li><li> 하나의 컴팩트 한 방울에 건조 LB 판에 뜨는 피펫의 나머지 50 μL의 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 조심스럽게 (IMPO 건조 흄 후드에서 플레이트를 배치RTANT 참고) 접시에 걸쳐 세포가이 크게 활용의 효율성을 감소 할 수 있도록하지 마십시오. </li><li> 물방울이 건조되면, LB 플레이트를 거꾸로하고 4-6 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 세포 혼합물을 배양하는 동안, 겐타 마이신 300 μg / ㎖로 큰 (150 OD × 15 ㎜) PIA 판을 준비합니다. 사용하기 전에 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하여 잔류 수분을 제거합니다. </li><li> 세포 혼합액의 배양이 완료된 후, 멸균 접종 루프를 사용하여 세포를 수집하고 1 ㎖ LB와 소용돌이 또는 피펫을 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브에서 충분히 섞고. </li><li> 큰 PIA 플레이트가 300 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함에 균등하게 세포를 확산. (중요은 : 등), 500 μL 10 μL, 플레이트 2 : 50 μL, 플레이트 3 : 100 μL, 플레이트 4이 단계의 경우, 예를 들어 플레이트 1 (플레이트를 분리하는 세포 혼합물의 증가 볼륨을 추가하는 것이 가장 좋습니다 . </li><li> 37에서 하룻밤을 품다° C. </li></ol> 2. 감지 및 점액 식민지의 분리 <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 점액 식민지에 대한 검사. </li><li> 작은 판 PIA 겐타 마이신 300 μg / ㎖로 (100 OD × 10 ㎜)에 격리에 대해 하나의 점액 식민지 행진을 분리합니다. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 배양한다 </li><li> 이전 하룻밤 문화에 2.2 단계를 반복합니다. </li><li> 반복 점액 분리의 안정성을 결정하기 위해 2.2-2.4 두 번 더 반복합니다. </li><li> 최종 분리 단계 후, 하나의 점액 식민지와 LB의 4.5 ㎖를 접종하고 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양 </li><li> 다음날, 각 점액 돌연변이 레이블 3 마이크로 원심 튜브. </li><li> 게놈 DNA의 추출 및 트랜스포존 삽입 부위의 식별을위한 2 관 (프로토콜 3 참조)에 하룻밤 문화의 두 1.25 ㎖를 분취를 준비합니다. </li><li> 또한, appropriat에 1 ㎖ 하룻밤 문화를 피펫으로 각 점액 돌연변이를 보관10 % 탈지 우유를 동일 부피를 함유 엘리-표지 cryovial. -86 ° C.에 저장 </li></ol> 3. gDNA를 제한 소화 및 결찰 <ol><li> 어떤 선호하는 방법 (예를 들면. 페놀 - 클로로포름, 스핀 열 등)를 사용하여 점액 돌연변이 체에서 gDNA를 압축을 풉니 다. </li><li> gDNA를의 농도를 결정, 제한 효소 SalI으로 2 μg 1 μL의 전체를 소화, 소 혈청 알부민, SalI로 효소 완충액 (100 mM의 염화나트륨, 50 mM 트리스 - 염산, 10 mM의 MgCl2를 5 μL의 0.5 μL , 1 mM의 Dithiothrietol (DTT), 실온에서 pH를 7.9) 및 50 μL의 총 부피를 달성하기 dH보다 2 O의 적절한 볼륨. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 DNA 다이제스트 (중요 :. 제한 효소의 효율에 따라서는 하룻밤 다이제스트에 추가 1 μl를 추가하고 1 ~ 2 시간 동안 37 ° C에서 배양 할 필요가있다이 밤새 다이제스트에 추가됩니다.) </li><li> DIGE 정화어떤 선호하는 방법 (예를 들어, 아가 로스 젤 정화, 스핀 열) 및 버퍼의 25 μL로 용출을 사용 STED DNA. </li><li> ~ 10-20 NG / μL의 바람직한 농도, 라이 게이션 완충액 1.5 μL (330 mM 트리스 - 아세테이트 pH를 7.5, 660 mM의 아세트산 칼륨, 100 mM의 아세트산 마그네슘, 5 mm의 정제 된 DNA의 11 μL를 혼합하여 소화 DNA를 결찰 DTT), 100 mM의 ATP의 1.5 μL, 1 μL의 DNA 리가 아제. </li><li> 실온에서 15 분 동안 혼합물을 부화 한 후 70 ℃에서 15 분 동안 배양하여 효소를 실활 (주 : 이상 동안 실온에서 혼합물을 배양하는 결찰의 성공을 증가시킬 수있다). </li></ol> 4. 역 PCR (iPCR을) 및 시퀀스 분석 <ol><li> 앞으로 다음과 역방향 프라이머와 조건을 열 순환을 이용하여 결찰 제품에 iPCR을을 수행합니다 : - 포워드 프라이머 (Gm3OUT) : GGGCATACGGGAAGAAGTGA - 역방향 프라이머 (Gm5OUT) : GACTGCCCTGCTGCGTAACA 열 순환기 콘돌리자tions : 1. 1 분 동안 94 ° C에서. 2. 1 분 동안 94 ° C에서. 3. 2 분 동안 58 ° C에서. 4. 2 분 72 ° C에서. 5. 8 분 72 ° C에서. 6. 10 ° C에서 개최. 반복 34 회 2-4 단계를 반복합니다. (참고 : 증폭 된 iPCR 제품은 4 ℃에서 저장 될 수 있습니다) </li><li> 성공하는 iPCR 증폭을 확인하는 아가로 오스 겔 전기 영동을 수행합니다. </li><li> Gm3OUT 및 Gm5OUT 프라이머를 사용하는 iPCR 제품에 대한 시퀀싱을 수행합니다. 삽입 부위와 himar1의 방향이 밖으로 매핑됩니다. </li></ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
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<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

저자 훙 웨이 D. 유 최고 과학 책임자 Progenesis 기술의 공동 설립자, LLC입니다.

또한이 방법은 이러한 변경과 다른 슈도모나스 종에서 사용할 수 있음을주의하는 것이 중요하다 : P.보기 부화 의 fluorescens와 P. 30 ° C에서 푸티하고, P. 42 ° C에서 stutzeri, P. stuzeri은 겐타 마이신 150 ㎍ / mL의 보충 LB 플레이트에서 배양되어야한다 단계 1.11, P.에 stutzeri 세포는 LB 500 ㎕를 대신 1 ㎖로 전송해야한다. 또한이 프로토콜에 대한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째,받는 사람의 부담은 적절한 온도에서 배양해야한다. 예를 들어, PAO1 재조합 (15)의 주파수를 증가시키기 위해 42 ° C에서 배양해야한다. 수신자 부담이 올바른 온도에서 배양하지 않을 경우 경우 돌연변이 체 라이브러리의 효율이 크게 감소 하였다. 둘째, iPCR을 높게 재현성이지만, gDNA를 완전히 원형 공유 클로즈 DNA가 DNA 라이 게이션을 통해 이루어...

알긴산 염을 과잉 생산하는 기회, 그람 음성 병원균 녹농균의 능력은 생물막을 확립하는 기능의 주요 요인이다. 알긴산의 과잉 생산은 종종 mucoidy 언급 표현형이다. 낭포 성 섬유증 (CF)로 고통받는 개인의 가래에서 점액 콜로니의 절연은 만성 감염 나타낸다 직접 환자의 건강 하나의 전체적인 감소와 연관된다. 현재는 것이 이해된다 P.있는 알긴산의 규제 및 생산 녹농균은 주로 두 오페론에서 발생한다. 에서 알긴산 고분자의 합성 및 수출에 대한 책임이 있습니다 (조류 - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - algI - algJ - - algF algD) 첫 번째는 12 유전자를 포함하는 알긴산 생합성 오페론이다 세포 environme에 페리 플라 즘NT 2-5. 두 번째 오페론은 대체 시그마 인자에게도 누군가 / T로 시작 mucA, mucB 및 MUCD 계속 유전자의 클러스터입니다. mucAB-D는 알긴산 생산 6-8의 부정적인 규제로 분류하는 동안 당신에게도 누군가 / T는, 긍정적 인 레귤레이터이다. 또한, 전사 등 ALGB, AlgQ, AlgR 및 RpoN 등의 규제뿐만 아니라, 전사 후 및 이화 억압 제어, 키나제 활성 (KinB) 및 intramembrane 단백질 분해에 의해 번역 후 변형은 또한 알긴산에 관여하는 것으로 밝혀졌다 규제 9-14. pFAC로 알려진 미니 himar1의 트랜스포존 벡터는 원래 하버드 의과 대학 (15) 박사 Mekalanos &#39;실험실에서 만들어졌습니다. pFAC 플라스미드는 두 개의 27 비트로의 반전 반복 중간에 겐타 마이신 저항 카세트 테이프 (aacC1 : 534 BP)에 의해 형벌 인자 (transposable element)로 구성되어, hyperact를 코딩하는 유전자선원 트랜스 포사 (16) 및 코딩하는 유전자 β-락타 마제 (BLA) (그림 1) 필자. DQ366300 13 : pFAC의 인자 (transposable element)의 시퀀스 정보는 GenBank 액 번호로 사용할 수 있습니다. pFAC에서, 역 PCR을 사용하여 염색체의 삽입 부위의 식별을 위해 사용된다 aacC1 유전자 뒤에 다중 클로닝 부위 (MCS)가있다. 미니 himar1의 트랜스포존을 사용하여 하나의 큰 장점은 특정 호스트 요인 트랜스 (돌연변이) 필요하지 않습니다이다. 또한, P.의 게놈에 걸쳐 발견 TA 디 뉴클레오티드 삽입 사이트의 높은 풍부가있다 녹농균. 각각의 게놈을, 예를 들어, TA 디 ​​뉴클레오티드 삽입 사이트는 PAO1에 94404과 100229 번 발생 (6264404 BPS, GenBank 액 번호 NC_002516.2) 및 PA14 (GenBank 등록 액세스 번호 NC_008463 6537648 BPS). 때문에 게놈, 미니 himar1에서 TA 디 뉴클레오티드의 풍요 </em&gt; 트랜스포존 독성 유전자의 분석 및 고도로 조절되는 유전자에 특히 적합하다 고밀도 및 무작위 돌연변이 유발을 일으킬 수있다. 이론적으로, 미니 himar1의 트랜스포존은 P.의 게놈 내에서 중요하지 않은 유전자에 삽입 할 수있는 녹농균. 이 PAO1 게놈의 오픈 리딩 프레임 당 약 18 TA 삽입 사이트를 제공합니다. 여기, 우리는 P.에 mucoidy의 새로운 규제를 식별하는 미니 himar1의 트랜스포존 매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 녹농균. 보다 구체적으로, 우리 biparentally E.부터 미니 himar1 트랜스포존을 함유 pFAC 벡터를 접합 nonmucoid prototrophic 변형 PAO1에 대장균 SM10/λpir. 트랜스포존은 게놈에 통합 된 후, 수신자 균주는 슈도모나스 분리 한천 E.의 성장을 억제 (PIA) 덴타에 배양 대장균. 따라서,의 돌연변이 체 라이브러리 <em&gt; P. 녹농균은 겐타 마이신 및 유 점액 표현형의 존재로 보충 PIA 접시에 성장에 의해 선택 될 수있다. 진정한 트랜스포존 매개 통합 돌연변이 대 겐타 마이신 내성 및 실린 민감한 표현형을해야합니다 유의하십시오. 본 연구에서는 PAO1 약 80,000 삽입 돌연변이 체는 네 개의 별도의 활용형을 분리 하였다. 우리는 그 점액 분리에 대한 검사를하고, 제한 효소 소화, 결찰 및 역 PCR에 의한 삽입의 위치를​​ 결정. 우리는 게놈 당 삽입의 수를 볼 프로브로 겐타 마이신 저항 카세트를 사용하여 서던 블롯 분석을 수행 하였다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 접합 당 얻은 돌연변이의 90 % 이상이 게놈에 himar1의 단 하나의 사본을 가지고 있었고, 겐타 마이신 내성 및 실린 민감한 표현형을 표시 것으로 판단. 32 점액 분리의 총이 확인되었으며, 그 중 22 P.의 다른 궤적에 매핑 된 녹농균 PAO1염색체. 삽입이 비율은 알긴산 과잉 생산의 몇 가지 새로운 규제를 식별하기 위해 적절한 범위를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas Fisher</td><td></td><td></td><td>Scientific</td></tr><tr><td>Small Plates (100 O.D. x 10 mm)</td><td>를 통한 Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Large Plates (150 O.D. x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 쉐이킹 인큐베이터</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>200rpm에서 쉐이크</td></tr><tr><td>캐비닛 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr> Fisher Scientific <tr><td>SmartSpec Plus 분광광도계</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>또는 선호하는 방법/공급업체</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>를 통한 벤치탑 마이크로원심분리기 Sorvall 75-003-287</tr><tr><td>분할 가능한 접종 루프</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml 극저온 바이알</td><td>Corning</td><td></td><td>430659 via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>탈지 우유</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy 혈액 및 조직 (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>또는 선호 방법/공급업체</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>또는 선호 방법/공급업체</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>또는 선호하는 방법/공급업체</td></tr><tr><td>FastLink II DNA 결찰 키트</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td>Sal1을 통한 <td>Labnet</td><td>NC0205808</td></tr>, <tr><td>제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE 아가로스</td><td>Fisher Scientific을 통한</td> <td>Genemate</td><td>3120-500</td></tr><tr><td>황산 겐타마이신 Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0ml 극저온 바이알</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>Fisher Scientific을 통해</td></tr></tbody></table>

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별<em&gt; 녹농균</em&gt; 사용 미니<em&gt; himar1</em&gt; 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

녹농균은 다양한 대사 기능이있는 그람 음성, 환경 세균이다. P. 녹농균은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 만성 폐 감염을 확립 기회 세균성 병원체이다. 또한 mucoidy로 알려진 알긴산이라는 캡슐 다당류의 생산 과잉은 항생제 화학 요법과 호스트 방어에 플랑크톤 세포보다 더 많은 저항 점액 바이오 필름의 형성을 촉진한다. 또한, 점액 표현형 nonmucoid의 변환은 CF 만성 감염의 발병에 대한 임상 마커입니다. P.에 의해 알긴산 과잉 생산 녹농균은 크게 세포 에너지를 세금을 에너지 흡수성 과정이다. 따라서, 알긴산 생산은 매우 P.에서 규제 녹농균. 더 알긴산 규제를 이해하기 위해, 우리는 신규 알긴산 레귤레이터의 식별을위한 미니 himar1 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명프로토 타입의 변형 PAO1에서의. 이 절차는 두 가지 기본 단계로 구성됩니다. 첫째, 우리는 호스트 E.에서 미니 himar1의 트랜스포존 (pFAC)을 전송 받는 사람 P.에 대장균 SM10/λpir 겐타 마이신으로 보충 슈도모나스 분리 아가 플레이트상에서 선택 하였다 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기 biparental 공액 통해 녹농균 PAO1. 둘째, 우리는 검사 및 겐타 마이신 카세트 및 DNA 염기 서열에서 바깥쪽으로 가리키는 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 역을 통해 삽입 사이트를 매핑하는 점액 식민지입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 (22 σ AlgT) 야생형 mucA 마스터 알긴산 레귤레이터에게도 누군가의 안티 - 시그마 인자 MucA을 인코딩 변형 PAO1 두 ​​소설 알긴산 조절기, MUCE (PA4033) 및 kinB (PA5484)를 확인했습니다 . 이것은 높은 처리량 돌연변이 유발 프로토콜은 깔깔 변화를 일으키는 다른 병원성 관련 유전자의 식별을 위해 수정 될 수있다뉴욕의 형태.

도 1에 도시 된 바와 같이, 미니 himar1 마리너 트랜스포존 벡터 pFAC는 TA 삽입 위치가 σ 70-의존성 프로모터 및 다중 클로닝 부위 (MCS)와 aacC1의 겐타 마이신 내성 카세트를 플 랭킹 두 27 bp의 반전이 반복을 포함한다. 또한, pFAC 벡터는 높은 활성 himar1의 트랜스 포사, β-락타 마제 (BLA) 및 육 차원 속의 전송 오페론을 코딩하는 유전자를 포함하고 있습니다. TA 삽입 사이트는 P.의 게놈에 효율적으로 통합 할 수 녹농균의 변종. 식별 및 점액 돌연변이를 선택하는 정확도는 알긴산 규제와 관련된 유전자의 궤적을 결정하는 전반적인 성공에 중요합니다. 뮤코 이드 및 nonmucoid 균주의 예는도 1에 나타낸다. 더 정확하게 점액 돌연변이를 확인하...

여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 mini-Hamar1 트랜스포존 매개 돌연변이 유발법을 사용하여 Pseudomonas aerogen의 엑소-다당류(exo polysaccharide)인 알지네이트(alginate) 생성과 관련된 새로운 유전자를 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 PAC 플라스미드를 보유한 공여자 균주인 E. coli Lambda P와 수용 세포인 Pseudomonas aerogen PAO1을 각각 하룻밤 동안 배양합니다. 그 다음, E. coli Lambda P와 Pseudomonas aerogen을 함께 배양하여 PAC 플라스미드를 접합시킵니다.PAO1 및 trans 접합체들을 pseudomonas isolation agar에서 선별한 후, 변이 군락들을 식별하여 PIA 플레이트로 분리합니다. 마지막으로, pseudomonas aerogen PAO1 게놈 내의 삽입 부위에서 mini-Tn5 transposon의 위치와 방향을 확인합니다. 최종적으로, mini-Tn5 transposon 매개 돌연변이 유발을 통해 pseudomonas aerogen의 알지네이트 생성과 관련된 유전자들을 식별하고 특성을 분석합니다.이 방법은 세포의 다양한 기능 조절에 관여하는 유전적 궤적을 식별하는 것과 같이 미생물학 및 세균 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 해당 절차의 실행 과정을 입증할 것입니다. 저희 실험실의 대학원생인, mini-Tn5 Mariner 전이 인자를 포함하는 벡터 pFAC는 다중 클로닝 사이트 상류에 Sigma 70 의존성 프로모터를 가진 Gentamycin 내성 카세트를 양옆에서 둘러싼 TA 삽입 부위를 포함하는 27 bp 역반복 서열을 포함하고 있습니다. pFAC 벡터는 또한 활성이 높은 Tn5 전이 효소, beta-lactamase 및 TRA 전이 작동 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함하고 있습니다.TA 삽입 부위는 pseudomonas aerogen 균주의 게놈으로의 효율적인 통합을 가능하게 합니다. OID 돌연변이체를 정확하게 식별하고 선택하는 것은 알지네이트 조절과 관련된 유전자 유전자좌를 결정하는 전체적인 성공에 매우 중요합니다. 세균 균주를 준비하려면, 15 µg/mL의 Gentamycin이 첨가된 5 mL의 lb 배지에 e coli SM 10 Lambda peer P fac를 접종하고, 같은 날 37 °C의 진탕 배양기에 넣어 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작하십시오.P. aeruginosa strain PAO1을 5 mL의 LB 배지에 접종하고, 42 °C의 진탕 배양기에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액의 OD 600을 측정하고, 최종 부피가 1 mL에서 1.4 mL 사이가 되도록 PAO1과 E. coli P fac를 동일한 양으로 혼합합니다. 혼합물을 6,000 ×g에서 5분 동안 원심 분리합니다.그동안 접합(conjugation)을 위해 LB 플레이트를 37 °C 인큐베이터에 10~15분 동안 열어 두어 건조시킵니다. 세포 혼합물에서 상층액을 50 µL만 남기고 모두 제거합니다. 그런 다음 재현탁(Resus)합니다.남은 50 µL의 상층액에 세포 펠릿을 현탁시킨 후 건조된 LB 플레이트에 피펫으로 분주합니다. 하나의 조밀한 방울 형태가 되도록 하여 흄 후드 내에서 조심스럽게 플레이트를 건조시킵니다. 세포가 플레이트 전체로 퍼지지 않도록 주의하십시오.이는 접합 효율을 크게 감소시킬 것입니다. 물방울이 마르면, 세포 혼합물이 배양되는 동안 LB 플레이트를 뒤집어 37 °C에서 4~6시간 동안 배양하십시오. 300 µg/mL의 gentamycin이 함유된 Pseudomonas isolation agar 또는 PIA 플레이트를 준비하십시오.배양 후, 멸균된 백금이를 사용하여 세포가 포함된 이 단일 방울을 1 mL의 lb가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 볼텍스 또는 피펫을 사용하여 충분히 혼합한 후, 세포를 대형 PIA 플레이트에 균일하게 도말합니다. 플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 OID 콜로니가 형성되었는지 확인합니다.단일 moid 콜로니를 분리하여 PIA와 300 µg/mL의 Gentamycin이 포함된 소형 플레이트에 분리 도말합니다. 다음 날, 단일 moid 콜로니를 다시 분리하여 도말 과정을 반복합니다. 초기 분리 후 moid 분리주의 안정성을 확인하기 위해 단일 콜로니 분리를 두 번 더 반복합니다.LB 배지 4.5 mL에 단일 OID 콜로니를 접종하고, 37 °C 진탕 배양기에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 각 OID 돌연변이체당 3개의 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 붙입니다. 게놈 DNA 추출 및 트랜스포존 삽입 부위 확인을 위해 하룻밤 배양한 배양액 1.25 mL씩 두 개의 분주액을 준비합니다.또한, 적절하게 라벨이 부착된 10% skim milk가 동일한 부피로 들어있는 cryo vial에 overnight 배양액 1 mL를 피펫팅하여 각 OID 돌연변이체를 보존하십시오. -86 °C에서 보관하십시오. MOID 돌연변이체에서 GDNA를 추출한 후.선호하는 방법을 사용하여 농도를 측정한 후, 총 2 µg의 DNA를 1 µL의 제한 효소 S one과 함께 총 부피 50 µL로 맞추어 37 °C에서 하룻밤 동안 제한 효소 절단을 수행합니다. 절단된 DNA를 선호하는 방법으로 정제하여 총 부피 25 µL로 만든 다음, DNA 약 11 µL를 사용하여 라이게이션 반응액을 준비하고 혼합물을 실온에서 최소 15분 동안 배양합니다. 그 후 70 °C에서 15분 동안 열불활성화시키고, 다음과 같은 정방향 및 역방향 프라이머와 열 순환 조건을 사용하여 라이게이션 생성물에 대해 IPCR을 수행합니다.그 다음 AROS 겔에서 증폭 여부를 확인한 후, 최종적으로 GM three out 및 GM five out 프라이머를 사용하여 반응물을 시퀀싱합니다. MOID 및 non MOID 분리주의 예가 이 그림에 나타나 있습니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜에 따르면, 알긴산의 과잉 생산으로 인해 각 접합은 15~20개의 대형 플레이트에 걸쳐 약 20,000개의 돌연변이 뱅크를 생성해야 합니다.모이드(moid) 콜로니는 투명하거나 흰색이어야 하며, 크림 같거나 끈적거리는 외관을 가져야 합니다. 돌연변이 유발 및 DNA 증폭이 성공적이라면, 이 그림에 표시된 바와 같이 적절한 크기의 단일 앰플리콘이 나타나야 합니다. PAO one에서는 IPCR 앰플리콘이 나타나지 않습니다.하지만, PA O one VE two와 PA O one VE 13에서는 각각 약 1, 400 base pairs와 약 1000 base pairs의 단일 앰플리콘이 검출되었습니다. 이 앰플리콘들의 크기는 PA oh one VE two에서는 PA 4 0 3 3의 프로모터 영역에, PA oh one VE 13에서는 PA 5 4 84의 내부로 HE R one mariner 트랜스포존이 삽입된 것과 일치합니다. 제한 효소 절단 및 라이게이션 과정을 거친 PA oh one 게놈 DNA는 음성 대조군으로 사용할 수 있습니다.따라서 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 3~4일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 바이오 부모 접합(bio parental conjugation) 이전에 박테리아 균주를 적절한 온도에서 배양해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

세포 생물학의 기본적인 탐구는 진핵 세포를 만드는 organelles의 신원을 기초 메커니즘을 정의하는 것입니다. 여기 형광 현미경과 차세대 시퀀싱 도구를 사용하여 식물 organelles의 형태학의 기능적인 무결성에 대한 책임 유전자를 식별하는 방법을 제안합니다.

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생성 엔테로 박터 SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형  균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

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이것은 버크 홀더리아 유익한 공생에서 후보 곤충 식민지 요인을 식별하기위한 적응 된 방법입니다. 딱정벌레 숙주는 트랜스포슨 돌연변이 발생을 통해 생성된 무작위 돌연변이 라이브러리에 감염되며, 식민지 화 후 라이브러리 복잡성은 시험관내에서자란 대조군과 비교된다.

라그리아 빌로사 딱정벌레의 부르크홀더리아 글래디올리 공생에서 세균 식민지 요인을 해명하는 도구로 트랜스포슨 삽입 시퀀싱

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

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이 프로토콜은 녹색 미세조류 클로렐라 심가리스(Chlorella vulgaris)의 핵 게놈에 관심 유전자를 통합하기 위한 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)의 활용을 간략하게 설명하여 안정적인 형질전환체를 생산합니다.

Agrobacterium tumefaciens-Medited Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris (녹색 미세 조류, 클로렐라 심가리스의 Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris)

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감염 관련 유전자 발현을 연구하기 위한 낭포성 섬유증 응집체 생물막 모델

배우세요 미니 himar1 마리너 트랜스포존 매개 돌연변이 유발을 사용하여 녹농균에서 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자를 식별하는 방법을. 이 기술은 미생물학 및 유전학 연구에서 유전자 기능을 규명하는 데 활용됩니다.

에 알긴산 생산과 관련된 새로운 유전자의 식별

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