세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

이 절차의 전반적인 목표는 저농도 세포 표면 막 단백질을 풍부하게 하는 것입니다. 이것은 먼저 막 단백질을 변성시키고 소화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 글라이칸을 산화시키고 수지 표면에서 글리코실화 펩타이드를 포획하는 것입니다.

그런 다음 비 글리코펩티드를 수지에서 씻어냅니다. 마지막 단계는 lc MS 분석을 위해 수지에서 N-Linked Glycopeptides를 방출하는 것입니다. 궁극적으로 식별된 펩타이드 염기서열은 식별 및 정량화를 위해 단백질에 다시 매핑될 수 있습니다.

오늘은 Geico 펩타이드 포획 ral이 어떻게 작동하는지 보여 드리겠습니다. 이 기술의 주요 장점은 당단백질 포획과 같은 기존 과다 투여의 경우 막 단백질이 먼저 소화되고 글리코펩타이드의 포획이 하나의 용기에서 수행될 수 있다는 것입니다. 이 기술의 적용은 질병 바이오마커의 발견으로 확장될 수 있습니다.

악어 단백질은 혈액 및 기타 체액에서 배출될 수 있고 병리학적 과정에 특이적인 혈액 내 순환 당단백질은 예후 및 진단 바이오마커로 사용될 수 있습니다. 먼저, 1-100 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 4ml의 하이텐닉 완충액을 준비합니다. 약 10-8 번째 세포를 포함하는 세포 펠릿에 1 ml의 hypotonic buffer를 첨가하고 15-30 분 동안 혼합물을 배양합니다.얼음 위에서 세포를 2 ml 바이알로 옮기고 주사기 바늘을 통해 샘플을 5-10 회 통과시켜 세포를 이빨을 만듭니다.

그런 다음 혈구 분석기와 트리안 블루 염색을 사용합니다. 용해의 효율성을 확인하려면 1ml의 용해물을 3ml의 남은 저장성 완충액과 결합하십시오. 섭씨 4도에서 3000배 G로 튜브를 15분 동안 돌립니다.

초상층액을 초원심분리기 튜브로 옮기고 펠릿을 섭씨 80도의 음의 냉동고에 보관합니다. 초원심분리기 튜브를 섭씨 4도에서 100, 000회 G로 2시간 동안 돌립니다. 다음으로, 200 마이크로 리터의 변성 완충액에 마이크로 솜 분획을 용해 한 다음 용액을 섭씨 100도에서 10 분 동안 끓입니다.

가열된 용액을 실온으로 냉각한 후 초고순도 요소 분말을 첨가하여 8몰 최종 농도를 제공하고 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후 500 밀리 몰을 추가합니다. 15 millimolar의 최종 농도를 제공하기 위해 샘플에 Acetamide 원액을 투여합니다.

그런 다음 용액을 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 배양하여 샘플의 유리 티올을 알킬화합니다. 그런 다음 샘플에 하나의 몰 DTT 스톡 용액을 추가하여 최종 농도 10밀리몰을 제공하고 실온에서 용액을 10분 더 배양합니다. 과도한 I oto Acetamide를 소멸시키기 위해 얻어진 용액을 PH 8에서 40 밀리몰 트리스 완충액으로 10 회 희석한 다음 총 단백질 양에 대한 트립신의 1 대 20 비율로 샘플에 트립신을 첨가합니다.

Bradford 분석을 사용하여 총 단백질의 양을 구합니다. 반응이 완료되도록 섭씨 37도의 오븐에서 하룻밤 동안 소화 반응을 유지합니다. 완료되면 샘플 용액을 10 밀리몰 염산으로 pH 1로 산성화하여 분해를 종료하는데, 이는 가장 빠르게 분해되는 조건입니다.

그런 다음 세제는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 가장 빠르게 분해됩니다. 배양 후, 원심분리 후 원심분리에 의해 개발된 침전물을 제거한다. 샘플 펩타이드가 포함된 SUP natin을 C 18 고체상 추출 카트리지로 세척하고 얻은 샘플을 스피드 백으로 건조시킵니다.

트립 및 분해 전후에 샘플에 대한 SDS 페이지 분석을 수행하여 분해 효율성을 확인합니다. 이 시점에서 세척된 펩타이드를 200마이크로리터의 커플링 버퍼에 용해시킵니다. 펩타이드 용액에 퓨리에이트나트륨을 첨가한 후 10밀리몰의 최종 농도를 제공합니다.

실온에서 암흑 속에서 30 분 동안 샘플을 배양하십시오.배양이 완료되면 실온에서 10 분 동안 배양 한 후 20 밀리 몰의 최종 농도와 5의 pH를 제공하기 위해 아황산나트륨으로 과도한 prate를 냉각하고, 200 마이크로 리터의 hydrocyte 유도체 수지 용액을 주입하고, pree 평형 및 커플 링 버퍼를 펩타이드 용액에 주입합니다. 완전한 결합을 위해 종단 간 회전으로 섭씨 37도에서 1-2일 동안 반응을 배양합니다. 완료되면 탈이온수 1ml, 1.5몰 염화나트륨 1ml, 메탄올 1ml, 80% 아세토 니트릴 1ml로 수지를 두 번 세척하여 결합되지 않은 펩타이드를 제거합니다.

다음으로, 결합되지 않은 펩타이드의 분석을 위해 상층액과 세척제를 수집합니다. 분석할 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관하십시오. 그런 다음 pH 8에서 100밀리몰의 중탄산암모늄 1밀리리터로 수지를 세 번 세척합니다.

마지막으로 300마이크로리터의 중탄산암모늄을 샘플 바이알에 추가합니다. 수지에서 N 글리코 펩티드를 방출합니다. PNG ACE F를 추가하고 종단 간 회전으로 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다.

그런 다음 원심분리로 방출된 펩타이드를 수집한 다음 80%아세틸 니트릴 1밀리리터로 수지를 세척합니다. 세탁물을 이전에 수집 한 것과 결합하십시오. 마지막으로 lc MS 분석을 위해 얻어진 용액을 속도 VAC에서 건조시킵니다.

농축 방법 후에 취한 비정형 글리코펩티드 스펙트럼이 수득된 글리코펩타이드에 여기에 나타나 있습니다. n 글리칸을 제거하고 폄하하는 부착 된 글라이칸을 P-N-G-A-F에 의해 스파르트산으로 전환시켰다. 그러므로, 스펙트럼은 일반적인 단백질 서열 데이터베이스에 대해 모든 단백질체학 검색 엔진에 의해 쉽게 검색될 수 있습니다.

비정형 lc MS. 포획된 n 글리코펩티드의 결과는 세포 마이크로솜 분획의 단일 lc MS 실행에서 100개 이상의 당단백질을 식별할 수 있는 결과를 보여줍니다. 당단백질과 글리코펩타이드 모두에 대한 농축 선택성은 일반적으로 90% 이상입니다.성공적인 분석은 SCX 컬럼과 계단식 그래디언트를 사용하여 추가 분획을 위해 95%의 농축 선택성을 가질 수 있습니다. LCMS 분석 전의 샘플은 일반적으로 당단백질 식별 횟수를 두 배로 늘립니다.

때때로 얻어진 글리코펩티드의 양이 적을 때 바이알에서 축적된 불순물이 최종 샘플에서 관찰될 수 있습니다. 이러한 오염 물질은 MCX 컬럼으로 제거할 수 있습니다. 따라서 이 비디오를 시청한 후 당사의 글리코펩타이드 포획 방법을 사용하여 셀프 서비스 멤브레인 단백질을 연구하는 방법을 잘 이해하셨기를 바랍니다.

이 프로토콜을 시도하는 동안 문제 해결을 위해 각 단계에 대한 샘플을 따로 설정하는 것도 중요합니다. 시약의 부피는 특정 연구에 맞게 최적화할 수도 있습니다.