Name: 세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 세포 표면 막 단백질을 풍부하게 하는 글리코 펩타이드 캡처 방법을 LC-MS 분석과 함께. 이 기술은 저발현 단백질 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 사이먼 프레이저 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다.

1. 수확 막 <ol><li> 세포 펠렛 (~ 10 8 셀)에 프로테아제 억제제 칵테일 저장성 버퍼 (10 MM 트리스 - 염산, 10 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 산도 8.0)을 추가하고 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어. 를 Lyse 주사기 바늘 (5 ~ 10 패스)를 통해 샘플을 통과하거나 다운스 호모 게 나이저 (15 ~ 30 타)로 샘플을 균질화하여 세포. 용해의 효율을 확인하는 혈구와 트리 판 블루 염색법을 사용합니다. </li><li> 3000 GX 15 분에 용해 액의 차등 원심 분리하여 미세 소체 분획을 확보 한 다음에 10 GX 2 시간. 우선 원심 분리 핵 분획 인 펠렛을 취득하고, 상층 액의 원심 분리 이후의 원형질막뿐만 아니라 막 - 결합 세포 기관 (8)를 포함 마이크로 솜 분획 인 제 펠릿을 생성한다. 최종 상층 액을 세포질 부분입니다. 더 분​​석가를위한 -80 ° C의 냉동고에 미세 소체 분수를 저장아래와 같습니다. </li></ol> 2., 용해 변성, 소화 막 단백질 <ol><li> 변성 버퍼 (40 MM 트리스, 10 mM의 EDTA, 10 mM의 TCEP, 0.5 % Rapigest, 산도 8)에서 마이크로 솜 분획을 용해 후 10 분 동안 100 ° C에서 솔루션을 품어. </li><li> 실온으로 가열 된 용액을 냉각 에이트 M의 최종 농도로 용액에 초 고순도 우레아 분말을 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 배양한다. </li><li> 15 mM의 최종 농도에 샘플에 요오도 아세트 아미드 스톡 용액을 추가하고, 시료에 자유 티올을 알킬화 실온에서 30 분 동안 어두운 용액을 배양한다. 10 mM의 최종 농도 시료에 DTT 주식 솔루션을 추가하고 과도한 요오도 아세트 아미드를 해소하기 위해 실온에서 또 다른 10 분 동안 솔루션을 품어. </li><li> pH를 8에서 40 mM 트리스 완충액으로 얻어진 용액을 10 배 희석하고,이어서 trypsi 1:20의 비율로 샘플을 트립신을 쓰총 단백질 명. 반응이 완료 될 수 있도록 37 ° C 오븐에서 밤새에서 소화 반응을 유지한다. </li><li> 즉 Rapigest 염산, 또한 세제를 분해 조건으로 pH 1로 시료 용액을 산성화하여 소화를 종료합니다. 1 시간 동안 37 ° C에서 Rapigest을 저하하고, 원심 분리에 의해 개발 된 침전을 제거합니다. </li><li> C-18 고체상 추출 (SPE) 카트리지에 의해 샘플 펩티드를 포함하고를 Speed​​vac에 의해 얻어진 샘플을 건조 뜨는을 청소합니다. </li><li> 이전과 소화 효율을 확인하는 트립신 분해 된 후 샘플의 SDS-PAGE 분석을 수행합니다. </li></ol> 3. 글리코 펩티드 캡처 <ol><li> 결합 완충액 (100 mM의 아세트산 나트륨, pH를 5.5)에서 세정 펩티드를 용해. 실온에서 어두운 곳에서 30 분 동안 10 mM의 최종 농도에서 펩티드 용액에과 요오드 산 나트륨을 추가. 이 알데히드를 글리 칸의 시스 - 디올기를 산화 할 것이다,하는 하이 드라 지드 화학을 통해 수지 커플 글리 칸이 있습니다. 실온에서 10 분 동안 20 mM의 최종 농도 및 pH를 5로 황산나트륨으로 과도한 요오 담금질. </li><li> 수지에 커플 글리코 펩타이드 1:4 (용액에 수지)의 비율 펩티드 용액에 히드라 지드 - 유도 된 수지를 소개한다. 완전한 연결을위한 엔드 - 투 - 엔드 회전 1-2 일 동안 37 ° C에서 반응을 품어. </li><li> 다음의 각 1 ㎖로 두 번 수지를 세척하여 언 바운드 펩티드를 제거 DI 물, 1.5 M 염화나트륨, 메탄올 80 % 아세토 니트릴. 마지막으로, 100 ㎜ NH 4 HCO 3 시스템의 완충액을 교환하고 pH를 8에서 100 ㎜ NH 4 HCO 3 1 ㎖와 수지 3 회 세척 하였다. <ol><li> (옵션) 언 바운드 펩티드의 분석을위한 뜨는 세척을 수집합니다. </li></ol></li><li> 와 37 ° C에서 하룻밤 배양에 인, PNGase F로 수지에서 N-글리코 펩타이드를 해제N 엔드 - 투 - 엔드 회전. 원심 분리 및 80 % 아세토 니트릴 세척에 의해 방출 된 펩티드를 수집합니다. LC-MS 분석을 위해를 Speed​​vac에서 얻어진 용액을 건조시켰다. </li></ol> 4. 또한 분별 (선택 사항) 상기 샘플의 복잡성을 단순화하기 위해, 얻어진 N-글리코 펩티드 분획. 예를 들어, 10 mM의 암모니아 메이트, 20 % 아세토 니트릴을 사용하여 pH 3으로 건조 펩티드를 재용 및 펩티드 분획 강한 양이온 교환 (SCX)을 크로마토 그래피를 사용한다. 얻어진 용출액을 건조하고 역상 LC-MS 8,17,18에 의해 얻어진 펩티드 분수를 분석 할 수 있습니다. 출시 N-글리코 펩티드 5. 청소 (옵션) 문제는 펩티드의 잠재적 인 오염 상승하면 0.1 % 포름산으로 건조 된 펩티드를 재용하고 추가 할 수 역상 LC-MS 분석 이전에 펩티드를 청소 MCX SPE 열을 사용합니다. <stronG&gt; 참고 : 데이터베이스 검색 매개 변수를. 수지 오프 N-글리코 펩타이드를 선택적으로 절단하는 동안, 인, PNGase F는 아스파르트 산에 N-글리 칸 연결 아스파라긴을 변환합니다. 따라서 해방 된 N-글리코 펩타이드의 0.9840 다 질량 변화가있다. 정확하게이 펩티드를 확인하려면,이 수정은 메티오닌, 시스테인 산화의 carbamidomethylation 일반적인 수정과 함께 검색 매개 변수를 추가해야합니다.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에서 우리는 세포 표면 단백질 프로파일에 대한 글리코 펩타이드 캡처 전략을 소개합니다. 방법은 분비 된 혈액에서와 단백질뿐 아니라 기타 체액 또는 세포 배양 배지에서 연구에 적용될 수있다. 방법의 성공은 샘플의 완전 분해에 의존한다; 따라서 소화 효율의 SDS-PAGE 특성화 특히 시료의 처음 분석을 위해 필요하다. 완전한 소화는 막 단백질에 대한 도전 할 수 있고, 단지 막 분획의 철저한 가용화 후 가능할 수있다. 가용화 처리는 세제가 도입 될 때 시작하고 우레아의 배양 후 종료한다. 구름 양이 요소를 추가하기 전에 샘플로 제시하지만, 요소 배양 후에 사라 따라서, 가용화 충분하다. 막 분획이 녹기 어려운 경우에는, 사용되는 세제의 양을 증가시킨다. 막 풍부한 조직 샘플에 대한뇌 및 지방 조직으로, 5 % Rapigest가 이용 될 수있다. 때때로, 강수량은 이전에 더 자주 인간 혈청 샘플에서 관찰 된 트립신 소화에 샘플을 희석하는 동안 나타날 수 있습니다. 이러한 침전...

세포 표면 단백질은 세포 외 환경과 상호 작용하는 세포의 외부에서 내부로의 신호를 중계. 따라서, 세포 외 기질 단백질을 포함하여 이러한 단백질은 세포 생물학 및 증식, 성장, 이동, 분화에서 등 노화에 이르기까지 생리학의 모든 측면에서 중요한 역할을한다. 표면 단백질이 다른 세포, 단백질과 작은 분자 1-3와 상호 작용에 의해 작동합니다. 약물의 60 % 이상이 세포 표면 단백질 4를 대상으로하는 등 세포 표면 단백질의 분자 특성은 생물 학자뿐만 아니라, 제약 회사를위한뿐만 아니라 큰 관심입니다. 뛰어난 감도, 정확성 및 단백질과 펩티드의 식별을위한 처리량 텐덤 질량 분석법 (MS)는 글로벌 프로테오믹스 연구 5,6를위한 강력한 도구이다. 그러나, 표면 단백질은, MS-기반 프로테오믹스에 상당한 도전을 제기대부분의 표면 단백질은 낮은 수량과 무거운 수정으로 존재한다. 표면 단백질의 막에 걸친 영역들을 소수성 렌더링; 이것은 특히 다중 경로 막 횡단 단백질에 대한 경우이다. 이 세제의 도움없이 수용액에 막 단백질을 용해하는 것이 곤란하다; 그러나 세제의 사용은 일반적으로 단백질 식별의 HPLC와 MS -1,7,8,8의 성능을 억제한다. 따라서, 막 단백질은 가난 직접 LC-MS 기반 프로테오믹스 특징으로하고 있습니다. 포도당은 세포 표면 단백질 9에서 일어나고있는 가장 중요하고 풍부한 번역 후 변형 중 하나입니다. 글리 칸의 엄청난 복잡성과 이질성은 펩티드 &#39;MS 신호 (10)를 방해. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 프로테오믹스 방법은 표면의 단백질을 풍부하게하기 전에 LC-MS 분석에 단백질에서 설탕 부분을 제거하는이 독특한 변형을 사용했다. 이 방법의 렉틴 기반 선호도 캡처 (11)과 하이 드라 지드 기반 또는 붕산 기반 화학 캡처 (12)뿐만 아니라 친수성 크로마토 그래피 분리 8,13 있습니다. 글리 칸의 제거는 일반 단백질에 막 단백질을 변환하고 크게 MS의 특성을 단순화합니다. 당화 또한 단백질 막에 대비 높은 용해도를 분비 단백질에서 발생하기 때문에, 많은 glycoproteomic 방법은 수용성 단백질에 최적화 된 낮은 글리코 펩티드 선택과 단백질 8,14를 막에 배포되는 감도를 갖는 경향이있다. 다른 방법도 풍부하게 존재한다, 특히, 초 원심 분리 (15) 및 라벨 (16) 전략을 사용하는 것과 같은 세포 표면 단백질. 막 단백질의 특성에 대한 우리의 방법과 기존의 방법과 자세한 비교는 최근 17를 실시하고, 그 결과는 우리의 방법이 동일하게 수행 할 수있는 표시, 경우에 없습니다모든 비교 막 단백질 체학 방법보다 더 나은,하지만 더 소박하고. 연구팀은이 방법을 사용하기 위해, 여기에 우리 세부 일반 프로토콜입니다. 이 방법은 기존의 glycoproteomics 전략의 몇 가지 장점을 통합하고 막 당 단백질을 위해 특별히 고안되어, 아직 방법은 분비 단백질을 동일하게 작동합니다. 이 방법의 특징은 1) 막 단백질의 완전한 용해, 2) 대신에 고체 포집 기판을 사용하는 경우 잠재적 인 입체 장해를 제거하는 당 단백질의 글리코 펩타이드의 농축, 3) 하이 드라 지드 화학의 사용은 공유 결합 사이를 형성하도록 글리코 펩타이드와 캡처 기판 접합 글리코 펩타이드가 높은 glycoselectivity 엄격한 세척을 견딜 수 있고, 4) 능력이 감소 샘플 손실 및 단축 절차 기간 동안 하나의 튜브 전체 포착 절차를 수행 할 수 있도록. VARI 연구에이 방법을 실행 한 후세포와 조직 등의 생체 시료 중의 ety, 우리는 당 단백질 8,17,18에 높은 선택성 (&gt; 90 %)을 관찰했다.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sodium periodate</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz 하이드라지드 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biomedical</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 카트리지</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 카트리지</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 coctail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Amersco</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>아황산나트륨</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>인버타제</td><td>시그마</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&알파;-1 트립신</td><td>시그마</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Ribonulease B</td><td>시그마</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>시그마</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>오브알부민</td><td>시그마</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>콘알부민</td><td>시그마</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 표면 단백질 체학 (proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

세포 외 기질 단백질을 포함한 세포 표면 단백질은, 이러한 성장, 분화, 증식 등의 모든 주요 셀룰러 프로세스 및 기능에 참여합니다. 이 단백질의 포괄적 인 특성은 바이오 마커 발견, 세포 유형 식별 및 약물 표적 선택뿐만 아니라, 세포 생물학 및 생리학에 대한 우리의 이해를 사전에 도움 풍부한 정보를 제공합니다. 표면 단백질은, 그러나, 그들의 본질적으로 낮은 풍부, 소수성, 무거운 번역 후 변형의 중요한 분석 과제를 포즈. 표면 단백질에 널리 당화을 활용, 우리는 여기에 몇 가지 기존의 N-glycoproteomics 수단의 장점을 통합하는 높은 처리량 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다. 우리의 방법은 표면 단백질에서 파생 된 글리코 펩타이드를 풍부하게하고 LC-MS를 사용하여 손쉬운 프로테오믹스에 대한 자신의 글리 칸을 제거 할 수 있습니다. 확인 된 N-glycoproteome는 INF를 포함한다단백질의 정체성과 양뿐만 아니라 포도당의 자신의 사이트의 ormation. 이 방법은 암, 줄기 세포, 약물 독성을 포함한 영역에서 일련의 연구에 적용되어왔다. 방법의 한계는 샘플의 상대적으로 많은 양의 세포질 단백질을 중심으로 연구와 비교하여 본 분석에 필요한되도록 표면 막 단백질의 낮은 풍부에있다.

실험 절차의 대표적인 흐름도는도 1에 요약되어있다. 라벨 및 상기 분류 단계는 선택적이며 상세는 최근 간행물 (18)에 기재되어있다. 또 다른 옵션은 수지와 반응하지 않는 비 변형 펩티드를 분석하는 것이다. 변형되지 않은 펩티드를 분석의 장점은 단단한 접합부에서 claudins 같은 비 - 글리코 실화 된 펩티드 및 단백질의 가능성 식별을 포함한다; 추가적인 장점은보다 정확한 정량이다. 이러한 장점을 바탕으로, 우리는 불리는이 방법 G lycocapture-ssisted-G의 lobal의 Q uantitative P의 roteomics (gagQP), 그리고 최근의 출판물 (18)에 분석을 자세히 설명합니다. 농축 방법 후에 취한 전형적인 글리코 펩티드 스펙트럼은도 2에 도시된다. 수득 글리코 펩타이드에서 N-글리 칸을 글리 칸 부착 아스파...

세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 저발현 세포 표면 막 단백질을 농축하는 것입니다. 이는 먼저 막 단백질을 변성시키고 소화함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 글리칸을 산화시키고 당화된 펩타이드를 레진 표면에 포획하는 것입니다.그 후 레진에서 비글라이코펩타이드를 세척하여 제거합니다. 마지막 단계는 lc MS 분석을 위해 레진에서 N-결합 글라이코펩타이드를 용출시키는 것입니다. 최종적으로, 확인된 펩타이드 서열을 단백질에 매핑하여 단백질의 식별 및 정량을 수행할 수 있습니다.오늘은 Geico 펩타이드 캡처 방법의 작동 원리를 시연하겠습니다. 당단백질 캡처와 같은 기존 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은 막 단백질을 먼저 소화시킨 후, 하나의 용기 내에서 당펩타이드 캡처를 수행할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 응용 범위는 질병 바이오마커 발굴까지 확장될 수 있습니다.Gator 단백질은 혈액 및 기타 체액으로 방출될 수 있으며, 병리적 과정에 특이적인 혈중 순환 당단백질은 예후 및 진단 바이오마커로 활용될 수 있습니다. 먼저, 1:100 비율의 protease inhibitor cocktail이 포함된 저장성 완충액 4mL를 준비합니다. 약 10⁸개의 세포가 포함된 세포 펠렛에 저장성 완충액 1mL를 첨가하고, 혼합물을 얼음 위에서 15~30분 동안 배양합니다. 세포를 2mL 바이알로 옮긴 후, 시린지 바늘을 통해 샘플을 5~10회 통과시켜 세포를 용해합니다.그 다음 혈구계수기(hemo cytometer)와 트라이판 블루(trian blue) 염색을 사용하십시오. 용해 효율을 확인하려면, 1 mL의 용해물과 3 mL의 남은 저장액(hypotonic buffer)을 혼합합니다. 튜브를 4°C에서 3000 ×g로 15분 동안 원심분리하십시오.상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고 펠렛은 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 초원심분리 튜브를 4 °C에서 100,000 ×g로 2시간 동안 원심분리합니다. 그다음, 마이크로솜 분획을 200 µL의 변성 버퍼에 녹인 후, 용액을 100 °C에서 10분 동안 끓입니다.가열한 용액을 상온으로 식힌 후, 최종 농도가 8 M이 되도록 초고순도 요소(urea) 분말을 첨가하고 시료를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 최종 농도가 15 mM이 되도록 500 mM ioto Acetamide 스톡 용액을 시료에 첨가합니다.그 후, 샘플 내의 자유 티올(free thiol)을 알킬화

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

렉틴 - 복합 POROS 비즈는 HPLC를 위해 고용되었다. 당펩타이드 기준은 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 역임 하였다. MARS - 14 고갈, 트립신 - 소화 인간의 플라즈마는 chromatographed와 흐름 -을 통해 (FT)와 바운드 분수는 ESI-LC-MS/MS 분석을 위해 수집되었다. FT에 비해 Glycopeptides는 바운드 분수에 풍부했다.

복잡한 생물 학적 샘플에서 선택적으로 - glycosylated 펩티드을 풍요롭게하는 렉틴 HPLC 방법

유비쿼터스 두 번째 메신저 c-di-GMP는 많은 박테리아의 성장과 행동을 제어합니다. 당사는 거의 모든 박테리아 종에서 c-di-GMP 결합 단백질을 생화학적으로 식별하고 특성화하기 위해 새로운 Capture Compound Mass Spectrometry 기반 기술을 개발했습니다.

캡처 복합 질량 분석 - 소설의 C 디 GMP 이펙터 단백질을 식별 할 수있는 강력한 도구

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

이 논문은 ECM 단백질 조성물 (1) 분석, 글리코 실화 부위 (2)의 식별 및 당쇄 형태 (3)의 조성 특성을 허용 MS 분석 심혈관 조직 샘플을 제조하는 방법을 설명한다. 이 방법은 다른 조직의 ECM의 연구에, 약간의 수정으로 적용 할 수 있습니다.

세포 외 기질의 Glycoproteomics : 질량 분석을 사용하여 본래 글리코 펩타이드 분석을위한 방법

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

오픈 서닝은 이전에 알려지지 않은 글리칸 조성물로 장식된 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다. 이 기사에서는 Acinetobacter baumannii 를 모델로 사용하여 박테리아 샘플에 대해 공개 검색 및 후속 글리칸 중심의 글리코 펩티드 검색을 수행하기위한 간소화 된 접근 방식을 제시합니다.

Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

바이오마커 프로가스트린 방출 펩타이드(ProGRP)로 예시된 건조 혈청 샘플에서 저농도 바이오마커를 측정하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 항체 코팅된 마그네틱 비드는 프로테오타입 ProGRP 펩타이드의 선택적 클린업 및 농축에 사용됩니다. 포획된 펩타이드는 이후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 분석됩니다.

표적 질량분석법 기반 단백질 분석의 마이크로샘플링 저농도 단백질

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

이 프로토콜은 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 복잡한 종양 미세환경에서 이질적인 당단백질체에 대한 포괄적인 통찰력을 제공하는 통합 오믹스 기술인 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

배우세요 세포 표면 막 단백질을 풍부하게 하는 글리코 펩타이드 캡처 방법을 LC-MS 분석과 함께. 이 기술은 저발현 단백질 연구에 활용됩니다.

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

더 많은 동영상 탐색