레이저 유도 내역 분광학 : 장기 조직에 나노 입자의 매핑 및 정량을위한 새로운 접근

본 절차의 전체적인 목표는 일반적인 광학 현미경과 완전히 호환되는 탁상형 기기를 사용하여 생물학적 조직 내의 유기 및 무기 원소를 매핑하고 정량화할 수 있는 간단하고 견고한 방법을 제공하는 것입니다. 이는 관심 샘플에 레이저 펄스를 집중시켜 재료의 분해와 스파크를 유도함으로써 달성됩니다. 이때 생성된 플라스마는 방사선을 방출하며, 이는 이후 분광계에 의해 분석됩니다.

두 번째 단계는 관심 원소에 해당하는 스펙트럼 선을 선택 및 식별하고 시료의 표면을 스캔하는 것입니다. 다음으로, 원소 농도를 결정할 수 있도록 교정 측정을 수행합니다. 마지막 단계는 상대 강도 또는 농도 척도를 사용하여 기록된 모든 스펙트럼으로부터 시료 조직의 원소 매핑을 구축하는 것입니다.

결과적으로, 레이저 유도 붕괴 분광법(Laser Induced Breakdown Spectroscopy)은 별도의 표지 없이 다양한 원소의 조직 내 분포를 보여주는 데 사용됩니다. 마이크로 X선 형광 분석이나 질량 분석 기반 기술과 같은 기존의 다른 방법들과 비교했을 때, 레이저 유도 붕괴 분광법(LIBS)은 구현이 간단하고 대기압에서 작동하며 대부분의 광학 현미경 시스템과 호환됩니다.

또한, 이 방법은 마이크론 단위의 해상도로 PPM 수준의 감도를 달성할 수 있게 합니다. 이 방법은 나노입자 표지 없이도 조직 샘플 내 금속 원소를 포함하는 나노입자의 분포와 같이 생물학적 연구에 적용된 나노기술의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 신체의 여러 장기, 특히 뇌에 존재할 수 있는 구리, 철, 알루미늄과 같은 비정상적 금속 원소를 검출하는 낮은 검출 한계 덕분에 병리학 분야로 확장될 수 있습니다. 이 방법을 통해 나노입자 검출 및 식별에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

또한 TCU 내 무기 원소 검출이나 불균일 원소 분포와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이러한 실험을 수행해야 하는 연구자들은 샘플에 과도한 손상을 주지 않으면서 가능한 한 많은 신호를 얻기 위해 획득 설정(acquisition settings)을 조정하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜에서 연구할 샘플 슬라이드를 준비하며 실험을 시작하십시오.

슬라이드 제작을 위해 가돌리늄 나노입자 용액을 주입한 종양 보유 마우스로부터 장기를 적출합니다. 장기를 100 µm 두께로 절편하여 쿼츠 슬라이드 또는 페트리 접시에 놓습니다. 슬라이드는 항상 -80 °C에서 보관하십시오.

다음으로, 검정(calibration)을 위한 시료를 준비합니다. 0 nM부터 5 mM까지의 농도가 표시된 여러 개의 바이알에 라벨을 붙입니다. 각 바이알에 해당 농도의 gadolinium 수용액을 100 µL씩 준비합니다.

이 과정이 끝나면 슬라이드를 준비합니다. 첫 번째 바이알에서 5 µL를 취해 쿼츠 슬라이드나 페트리 접시를 따라 떨어뜨립니다. 나중에 사용할 수 있도록 해당 방울을 반드시 표시해 두십시오.

원주를 따라 3mm 이동한 후, 다음 농도의 용액 5µL를 슬라이드 위에 점적하십시오. 나머지 모든 용액에 대해서도 동일하게 반복하십시오. 슬라이드 위의 내용물을 상온에서 20분 동안 건조하십시오.

이 립 설정은 1064 nm 파장의 빔을 생성하는 나노초 네오디뮴 알루미늄 가넷 레이저를 사용합니다. 빔의 일부를 사용하여 분광계 시스템을 동기화하십시오. 나머지 부분은 컴퓨터로 제어되는 감쇄기를 통해 보내어 전체 실험 동안 레이저 펄스 에너지를 조정하고 안정화하십시오.

다음으로, 빔을 해당 샘플 영역으로 유도합니다. 소프트웨어로 제어되는 이동 스테이지에 빔을 초점 맞춥니다. 이곳에 샘플 마운트가 고정되며, CCD 카메라 한 대가 샘플 표면 마운트를 모니터링합니다.

또 다른 장치는 플라즈마 플룸을 모니터링하는 데 사용됩니다. -26 °C로 유지되는 ICCD 카메라가 장착된 터닝 분광계(turn turner spectrometer)를 사용하여 시료 붕괴에서 발생하는 빛을 분석하십시오. 측정을 위해 레이저를 안정화하고 카메라를 -26 °C로 냉각하기 시작하십시오.

실험 시작 10분 전입니다. 준비가 되면 감쇠기를 사용하여 펄스 에너지를 5 mJ로 고정하십시오. 다음으로, 연구할 샘플 슬라이드를 가져와 샘플 스테이지에 장착할 준비를 하십시오.

전동 샘플 홀더에 샘플을 고정하십시오. 고정이 완료되면 컴퓨터로 돌아갑니다. 샘플의 위치를 잡기 위해 스테이지를 이동시켜 샘플의 일부가 레이저 빔에 위치하도록 합니다.

레이저 초점을 시료 표면에서 약 100 micrometers 아래로 조정합니다. 이렇게 하면 레이저로 인해 50 micrometers 이하의 크레이터가 형성됩니다. 컴퓨터를 사용하여 분광계의 입사 슬릿 값을 40 micrometers로 설정하고, 매핑 측정을 위한 ICCD 파라미터를 설정합니다.

샘플의 대상 영역을 겨냥하여 홀더 위치를 조정하십시오. 광범위 스펙트럼 광원을 사용하여 샘플의 고해상도 파노라마 이미지를 촬영하십시오. 그런 다음, 소프트웨어와 캡처한 이미지를 사용하여 LIBS 스캔 영역과 해상도를 설정하십시오.

여기서 그리드는 100 by 100이며, 지점 간의 간격은 100 µm입니다. 그리드의 각 지점에서 데이터의 자동 수집을 시작하십시오. 스펙트럼이 측정되어 파일로 기록됩니다.

약 30분 후 측정이 완료되면, 샘플 슬라이스의 두 번째 이미지를 촬영한 다음, 나중에 사용할 수 있도록 모든 스펙트럼을 하나의 데이터 파일로 통합하십시오. 다음으로, 샘플 슬라이드를 제거하고 교정 샘플을 장착할 준비를 하십시오. 교정 샘플이 놓인 쿼츠 슬라이드를 컴퓨터 쪽의 이동 스테이지에 고정하십시오.

첫 번째 보정 시료의 중심을 레이저 경로에 위치시킵니다. 실험 파라미터를 유지하며 스펙트럼을 기록합니다. 서로 다른 가돌리늄 농도의 각 시료에 대해서도 동일하게 수행합니다.

이것들은 신장 조직의 서로 다른 영역에서 기록한 단일 샷 스펙트럼의 예시입니다. 파란색 스펙트럼은 신장의 중앙 영역에서 기록되었습니다. 빨간색 스펙트럼은 신장 막에 해당하며, 초록색 스펙트럼은 주변 영역에 대한 것입니다.

주입된 가돌리늄 기반 나노입자는 폴리슬란(polysilaane) 매트릭스로 구성되어 있으며, 표면에는 doca 리간드에 의해 킬레이트화된 가돌리늄 이온이 결합되어 있습니다. 286 nanometer에서 320 nanometer 사이의 스펙트럼 범위에서는 가돌리늄, 칼슘, 철, 실리콘 및 알루미늄을 검출할 수 있습니다. 시료의 서로 다른 영역에서 강도가 어떻게 변하는지 확인하면, 조직 내 이러한 원소 농도의 상당한 불균질성을 알 수 있습니다. 마우스 신장 절편 내 가돌리늄, 실리콘 및 철의 조직 매핑은 약 100 micrometers의 분해능을 가진 LIBS 데이터를 사용하여 수행되었습니다.

스케일 강도는 임의 단위(arbitrary unit)로 표시됩니다. 이것은 자연광 이미지입니다. 비교를 위해, 종양 샘플에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다.

가돌리늄과 SQ 20 B 종양 조직의 이 지도와 마찬가지로, 자연광 사진 위에 거짓 색상 척도가 겹쳐져 있습니다. 본 실험에서는 나노입자를 종양에 직접 투여하였습니다. 1시간 후, 종양을 제거하여 분석을 위해 준비하였습니다.

종양 부피의 약 절반에 일부 입자가 포함되어 있음에 유의하십시오. 이 기술을 적절하게 수행하면 100 $\mu\text{m}$의 해상도로 $1\text{ cm}^2$ 크기의 시료를 1시간 이내에 분석할 수 있습니다. LIBS를 수행할 때는 측정이 레이저 유도 플라즈마로부터 이루어진다는 점을 기억하는 것이 중요하며, 절차에 따라 전체 실험 과정 동안 모든 매개변수를 제어하는 것이 필수적입니다.

관심 있는 공정의 진행 이후 관여하는 세포의 유형과 같은 추가적인 의문점을 해결하기 위해 인접 절편에 대한 면역조직화학염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 생물학 및 의학에 적용된 나노기술 분야의 연구자들이 생체 조직 내 금속 원소를 포함하는 화합물의 분포를 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 생체 조직 내 다중 원소를 매핑하기 위해 LA-ICP-MS 기술을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.