민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포의 대사 프로파일링을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 세포에서 극성 대사 산물을 추출하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포 추출물을 물에서 재구성하고 샘플을 lc 바이알로 옮기는 것입니다.

다음으로, 샘플을 보정된 lc QE MS 기기에 주입하고 최종 단계에서 원시 데이터를 컴퓨터에 기록합니다. 대사 산물 피크는 상용 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터에서 추출되며, 알려지지 않은 피크는 고해상도 질량 데이터베이스에서 검색됩니다. 이 마스터는 SARS의 상대적 대사 산물 수준에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 혈청이나 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

먼저 20밀리몰 아세테이트인 500밀리리터의 이동상 A와 15밀리몰 수산화암모늄을 3% 아세토, 니트릴 및 물에 준비합니다. 병을 느슨하게 뚜껑을 씌운 후 수조에서 용액을 가열하지 않고 10 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 5 밀리그램의 플루오로 아세테이트 나트륨과 산을 5 밀리리터의 물에 용해시켜 밀리리터당 1 밀리그램의 최종 농도를 만듭니다.

그런 다음 디아지논을 메탄올에 용해시켜 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도를 만듭니다. 1ml의 negative low mass calibration solution을 준비하려면 960μl의 thermo negative calibration solution을 20μl의 sodium fluoro acetate 및 homovanillic acid solution과 혼합합니다. 1 밀리리터의 포지티브 저 질량 교정 용액을 만들려면 990 마이크로 리터의 열 포지티브 교정 용액과 10 마이크로 리터의 디아 지논 용액을 혼합하십시오.

포지티브 모드에서 표준 질량 보정을 수행한 후 기기 제어 패널에서 스캔 범위를 60-900 질량 대 전하 비율로 조정하고 25전자 볼트의 소스 충돌 유도 해리를 적용합니다. 맞춤형 보정 이온을 입력하고 이온 소스가 안정되면 튜닝 페이지에서 사용자 지정 보정을 시작합니다. 네거티브 모드에서 표준 질량 교정을 수행한 후 극성을 네거티브 모드로 전환하고, 기기 제어판에서 스캔 범위를 60-900 질량 대 전하 비율로 조정하고, 35전자 볼트의 소스 충돌 유도 해리를 적용합니다.

맞춤형 보정 이온을 입력하고 이온 소스가 안정되면 맞춤형 보정을 시작합니다. 튜닝 페이지에서 QE MS 기기를 레벨 C에 고정한 다음 질소 가스 주입구, 기화기 케이블 및 전압 케이블에 연결하여 가열된 전기 분무 이온화 또는 HESI 프로브를 장착합니다. 컴퓨터 튜닝 페이지에서 프로브에 대한 관련 튜닝 매개 변수를 설정합니다.

모세관 온도를 섭씨 320도로 설정하고 S 렌즈를 55도로 설정합니다. 다음으로 메소드 프로그램에서 다음 값을 사용하여 전체 스캔 메소드를 빌드합니다. 선형 그래디언트 정보를 입력하여 크로마토그래피 방법을 설정합니다.

실온에서 화합물 분리를 위해 amid 컬럼을 사용합니다. 이 시점에서 50ml에 40ml의 메탄올과 10ml의 물을 수동으로 혼합하여 추출 용매를 준비합니다. 2. 이전에 대장암을 배양했을 때 H CT 8개의 세포가 80%의 합류점에 도달합니다.

매체를 빠르게 흡입하고 6웰 플레이트를 드라이아이스 위에 놓습니다. 그런 다음 즉시 각 웰에 1ml의 추출 용매를 추가하고 플레이트를 섭씨 80도의 음의 냉동고로 옮깁니다. 냉동실에서 플레이트를 꺼낸 후 15분 후 드라이아이스 위에 올려놓고 셀을 솔벤트로 긁어냅니다.

각 우물에서 3개의 1.7 밀리리터 einor 관으로 해결책을 옮기고 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 G 시간의 속도로 표본을 원심 분리하십시오. 원심분리 후 상층액을 두 개의 새로운 einor 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 진공 상태에서 샘플을 건조시킵니다.

샘플이 건조되면 섭씨 80도의 냉동고에 보관하십시오. 분석을 위해 냉동실에서 샘플을 꺼낸 후 얼음 온도에 도달하도록 합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 얼음물을 넣고 샘플을 와류로 만들어 대사 산물을 용해합니다.

다음으로, 20, 000 번 G에서 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리하십시오. 2분 동안 SUPERNAT를 lc 바이알로 옮기고 분석을 위해 5마이크로리터의 시료를 lc QES 기기에 주입합니다. QE MS 기기에서 보정이 적절하게 수행되면 분당 0.15ml의 유속으로 85%의 이동상 B로 lc 컬럼을 5분 동안 평형을 이룹니다.

다음으로, LCMS에 의해 도입된 변동을 각 샘플에 분배하고 서로 다른 샘플 간의 보다 정확한 비교를 보장하기 위해 샘플 시퀀스를 무작위 순서로 설정합니다. 6개의 샘플마다 세척 실행을 추가한 다음 빈 샘플을 추가하여 시스템 배경 및 캐리오버 수준을 평가합니다. 시퀀스를 저장하고 시퀀스 실행을 시작합니다.

염기서열의 처음 두 샘플이 실행된 후 lc 컬럼이 400PSI에 가까운 안정적인 압력을 나타내면 이러한 크로마토그램의 피크에서 미확인 대사 산물을 확인하여 샘플 염기서열이 원활하게 실행되는지 확인합니다. 시퀀스의 모든 샘플이 완료된 후 별도의 컴퓨터에서 데이터 분석을 수행합니다. 시판되는 소프트웨어에서 small molecule에 대한 피크 정렬 및 프레임 추출 방법을 선택하십시오.

그런 다음 lc ms 원시 데이터를 로드하고 샘플 유형에 따라 그룹화합니다. 피크 정렬을 위한 크로마토그래피 참조 샘플로 실행 시퀀스 중간에 있는 샘플을 선택하고, 비율 그룹 또는 전체 변화 계산으로 그룹을 선택합니다. 그런 다음 수집된 데이터와 해당 프레임 시드와 함께 표적 대사 산물 분석을 위해 알려진 대사 산물을 포함한 프레임 시드를 업로드합니다.

그런 다음 포지티브 또는 네거티브 모드에서 전체 스펙트럼 스캔을 선택하고 이 데이터 처리 파일을 원시 데이터와 동일한 폴더에 저장합니다. 데이터베이스 검색 기능을 끄고 워크플로우를 실행합니다. 그런 다음 프로세스 데이터를 모든 프레임의 피크 영역을 포함하는 Excel 시트로 내보냅니다.

비표적 대사 산물 분석의 경우 성분 추출 방법을 선택합니다. 배경 빼기를 위해 샘플 원시 데이터와 3개의 빈 샘플을 로드합니다. 이 그룹 다음에는 원시 데이터를 사용하고 앞에서 설명한 대로 참조 샘플을 설정합니다.

구성 요소 임계값을 10에서 5번째 값으로 설정합니다. 미지 화합물 식별을 위해 인간 대사체 데이터베이스를 사용합니다. 이 처리 파일을 저장한 후 데이터베이스 검색 기능을 끄고 워크플로를 시작합니다.

데이터 처리가 완료되면 변동 계수 또는 CV 필터를 사용하여 반복 샘플 및 강도 필터 내에서 CV가 큰 구성 요소를 제거합니다. 노이즈 수준에서 감지된 성분을 수동으로 제거하려면 각 성분을 살펴보고 잘 정의된 피크 또는 데이터베이스 검색을 위한 다양한 샘플 유형에서 상대적으로 큰 차이가 있는 성분을 선택합니다. 마지막으로, 데이터베이스에서 히트가 있는 데이터를 내보냅니다.

대사체학 데이터의 정확도는 기기가 양호한 상태로 작동하고 있는지, 적용된 방법이 적절한지 여부를 평가하기 위해 lc QEMS 기기 성능에 크게 좌우됩니다. 여기에 표시된 바와 같이 총 이온 크로마토그래피에서 여러 알려진 대사산물 lc 피크가 추출됩니다. 아미노산, 해당과정, 중간체, TCA, 중간체, 뉴클레오티드, 비타민A, TP 및 NADP를 포함하는 극성 대사 산물은 현재 lc 조건에서 컬럼에 우수한 머무름과 우수한 피크 모양을 가지고 있습니다.

한편, 질량 오류 테스트는 그림과 같이 저질량 교정 후 24시간 이내에 수행됩니다. 여기서, 질량 오류는 검출된 질량 대 전하 비율을 표적 대사 산물의 이론적 질량 대 전하 비율과 비교하여 평가됩니다. 여기서, 표적 대사 산물은 74에서 744 범위의 질량 대 전하 비율을 갖습니다.

여기서 Y축은 특정 질량 오차 범위 내에서 대사 산물의 누적 백분율을 나타냅니다. 파란색 곡선은 0시간에서 12시간까지의 결과를 보여주고, 빨간색 곡선은 보정 후 12시간에서 24시간 사이에 수집된 데이터를 보여줍니다. 대사 산물의 90% 이상이 5ppm 질량 오차 이내이며, 이는 여기에서 개발된 낮은 질량 범위 보정 방법이 낮은 질량 범위 검출을 위해 5ppm 질량 오류를 유지하기에 충분하다는 것을 의미합니다.

해결해야 할 또 다른 문제는 현재 방법 및 기기 설정을 사용하는 기기의 감도입니다. 10cm 페트리 접시에서 3 배 샘플의 연속 희석을 6의 희석 계수로 5 번 수행하여 6 개의 다른 농도의 샘플을 생성했습니다. 표적 목록은 다양한 농도의 샘플에서 검출된 대사 산물의 수를 평가하는 데 사용됩니다.

여기에 나타난 결과는 검출된 표적 대사산물의 최적 수가 5번째 세포의 2.78 곱하기 10과 6개의 세포에 대해 1.67 곱하기 10 사이인 반면, 7개의 세포에 대해 1 곱하기 10 곱하기 더 적은 수의 검출된 대사 산물을 제공하는 것을 나타내며, 이는 이온 억제 효과에 기인합니다. 이 결과는 이 분석을 위해 추출할 최적의 세포 수가 대략 6개의 웰 플레이트에 있는 웰의 양임을 나타냅니다. 비표적 대사 산물 분석의 경우 CV 컷오프 20%와 평균 강도 값 10에서 7번째 값을 사용하여 성분 테이블을 필터링합니다.

CV 컷오프 값은 증가할 수 있지만 더 많은 피크를 포함하기 위해 평균 강도 값을 줄여야 합니다.피크를 수동으로 확인한 후 양호한 모양의 성분을 선택하고 인간 대사체 데이터베이스에서 검색합니다. 포지티브 모드에서 수집된 데이터의 결과는 여기에 나열되고 네거티브 모드의 결과는 여기에 나열됩니다. 여기에서 확인된 대사 산물 중 일부는 글루타티온 및 프롤린과 같은 표적 목록의 대사 산물과 겹칩니다.

해당작용에서 파생될 수 있는 메틸 글리옥살과 1개의 pto, 2개의 ELE SN 글리세롤, 3개의 포스포콜린과 같은 표적 목록에 없는 추가 대사 산물도 탐색되며, 이는 3.2분의 머무름 시간으로 양성 모드에서 검출됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배양된 사스에서 폴리 대사 산물을 추출한 다음 RC QES를 사용하여 다른 샘플에서 상대적인 대사 수준을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.