Name: 민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 배우세요 LC-MS를 활용한 배양 세포의 극성 대사체 추출 및 분석 방법을 통해 대사 프로파일링을 수행하는 기법입니다. 이 프로토콜은 건강과 질병 관련 대사 변화 연구에 활용됩니다.

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저자는 질량 교정 및 데이터 처리에 대한 가치있는 토론을위한 데틀 레프 슈만, 제니퍼 서튼 (써모 피셔 과학)와 나다니엘 스나이더 (펜실베니아 대학)을 인정하고 싶습니다. 이 책에서보고 된 연구는 상 수 R00CA168997에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. LC-MS 시약, 크로마토 그래피 방법의 설립 준비 및 장비 운영 절차 수립 <ol><li> LC 용제의 제조 <ol><li> 500 ㎖의 이동 단계를 준비​​합니다. 20 mM의 아세트산 암모늄 및 3 % 아세토 니트릴 / 물에 15 mM의 수산화 암모늄, 최종 pH 9.0이고; B는 100 % 아세토 니트릴이다. </li><li> 느슨하게 병을 모자 물 목욕 초음파 분쇄기에 배치하고, 별도의 난방없이 10 분 동안 초음파 처리. (이 단계는 암모늄염의 모두가 완전히 용해 있고 잔류 기포가 없다는 것을 보장하는 것이다.) </li><li> LC-MS 사용을위한 250 ㎖의 유리 병에 용매, 4 ℃에서 나머지를 계속 전송 250 ML </li></ol></li><li> 낮은 질량 범위의 보정 용액을 준비합니다. 그것은 그 정확한 질량이 낮은 분자량에 감지하기 위해 대사 체학 응용 프로그램에 대한 사용자 정의 낮은 질량 범위의 보정 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다. <ol><li> 소디 모두 5 ㎎의 무게를UM fluoroacetate 및 homovanillic 산 및 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 만들어 5 ml의 물에 그들을 용해. 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 만들기 위해 메탄올에 녹여 디아 지논. </li><li> 음의 낮은 질량 교정 액 1 ㎖를 제조하고 나트륨 fluoroaceate homovanillic 믹산 용액 20 ㎖와 함께 항온 마이너스 보정 용액 960 ㎖를 혼합한다. 양의 낮은 질량 보정 용액 1 ㎖를 만들려면, 열 양의 보정 용액 990 ㎖ 및 10 ㎖ 다이아 지논 솔루션을 섞는다. (낮은 질량 교정 솔루션은 4 ° C에서 보관해야하고 2 개월마다 신선한 준비합니다.) </li></ol></li><li> 낮은 질량 범위에서 QE-MS의 교정 <ol><li> 낮은 질량 범위의 보정을 수행하기 전에, 제조업체의 지침에 따라 긍정과 부정 두 가지 모드에서 표준 질량 교정 (M / Z, 150-2,000)을 수행한다. </li><li> 일반 대중의 교정이 통과되면, 인스트루먼트 컨트롤 패널에서 60~900m / Z까지 검색 범위를 조정긍정적 인 모드와 음의 모드에 대한 35 eV의 25 EV의 소스 CID이 적용됩니다. (이것은 카페인 조각 이온과 황산 이온의 강력한 신호를 제공 할 것입니다. 여기에 스캔 범위가 고정되어, 마지막 m / z는 시작 M / Z의 15 배 이상 클 수 없습니다해야하기 때문에) </li><li> 이온 소스가 안정되면, 다음 사용자 정의 교정을 수행합니다. 참고 : 안정된 소스는 포지티브 모드에서 총 이온 전류 변화의 10 % 미만으로 정의하고, 네거티브 모드에서의 15 % 미만. 맞춤형 교정 이온 및 대응하는 m / z를 표 1에 나타내었다. </li></ol></li><li> 극성 대사 산물 분석을위한 LC-MS 계측을 설정합니다. LC는 대사 산물의 분리 및 검출을 위해 QE-MS에 연결된다. <ol><li> 온수 전기 분무 이온화 프로브 (H-ESI)와 QE-MS 장비. 나열된 프로브 관련 조정 매개 변수 설정 : 히터 온도 120 ° C를; 시스 가스, 30; 보조 가스, 10; 가스, 3을 청소; 전압 3.6 kV의 스프레이긍정적 인 모드와 음의 모드 2.5 kV의. 55에서 320 ° C에서 모세관 온도, S 렌즈를 설정합니다. </li><li> 전체 검색 범위 : 다음과 같이 전체 검사 방법을 구축 60-900 (M / Z)를; 해결책 : 70,000; 최대 주입 시간 : 50 밀리 초 정도의 전형적인 주입 시간이 200 밀리 초; 자동 이득 제어 (AGC) : 3,000,000 이온. 이러한 설정은 양 및 음 양쪽 모드에서 스캔을 수행하기 위해 주변의 550 밀리의 듀티 사이클을 초래한다. </li><li> 크로마토 그래피 방법을 설정합니다. 실내 온도 13, 15의 화합물 분리 아미드 칼럼 (100 × 2.1 mm 내경 3.5 mm)를 사용한다. 전술 한 바와 같이 이동상이고, 이동상 B는 아세토 니트릴이다. 다음과 같이 선형 그라데이션을 사용하여 0 분, 85 % B를; 1.5 분, 85 % B, 5.5 분, 35 % B; 10 분, 35 % B, 10.5 분, 35 % B, 14.5 분, 35 % B, 15 분, 85 % B, 20 분, 85 % B. 유속 0.15 ㎖ / 분 0-10 분 및 15의 20 분, 10.5에서 14.5 분에 0.3 ㎖ / 분이다. </li></ol></li></ol> 2. 홍보대사 산물의 샘플의 eparation <ol><li> 추출 용매를 준비합니다. 50 ML 튜브에 40 ㎖의 메탄올 (LC-MS 급) 및 10 ㎖의 물 (LC-MS 급)를 혼합하고, 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 -80 ° C 냉동고에 보관합니다. 참고 :이 절차와 다음 단계는 생체 조직과 유체 샘플의 추출을 위해 변경 될 수있다. <ol><li> 전체 성장 매체와 세 10cm 접시 6 - 웰 플레이트에 문화 대장 암 HCT 8 세포는 RPMI 1640 10 % 열 불 활성화 태아 혈청과 10 만대 / L 페니실린 및 100 ㎎ / L 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 세포가 80 %의 합류에 도달하면, 신속하게 미디어를 제거하고, 드라이 아이스 (13, 15)의 상단에있는 접시 또는 접시를 놓습니다. 즉시 (80 % 메탄올 / 물) 용매 1 ㎖의 추출을 추가하고, -80 ° C 냉동고에 플레이트를 전송합니다. 10cm 접시를 들어, 각 웰에 추출 용매 3 ㎖를 추가합니다. (중간 길이 중간에서 잔류 염에 의한 이온 억제 효과를 피하기 위해 가능한 한 많이 제거하십시오.)</li><li> 15 분 동안 접시를 둡니다. 냉장고에서 제거하고, 드라이 아이스의 용매에 세포를 다 쳤어요. 1.7 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 대한 해결책을 전송하고, 10 분 동안 4 ° C에서 20,000 XG의 속도로 원심 분리기. (세 개의 복제 샘플을 만들기 위해 별도의 세 가지 요리에서 세포 대사를 준비합니다. 두 개의 튜브를 유지의 목적은 백업으로 한 것입니다.) </li><li> 두 개의 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 전송하고, 속도 진공을 건조. 이 사용 속도 진공에 따라 약 3-6 시간이 걸립니다. (샘플은 질소 하에서 밤새 건조 될 수있다.) </li><li> -80 ° C 냉동고에 각 시료의 건조, 저장 튜브 후. 준비가되면, 20 ㎖의 물 (LC-MS 등급)에 하나의 샘플을 재구성 및 분석을위한 LC-QE-MS에 5 ㎖를 주입. </li></ol></li></ol> 샘플 시퀀스 3. 설치 <ol><li> 교정이 적절 QE-MS상에서 수행되면, 유동에서 85 %와 5 분 동안 LC 컬럼을 평형화LC의 그라데이션의 시작 조건입니다 0.15 ㎖ / 분의 속도. </li><li> 무작위로 샘플 순서를 설정합니다. 주 :이 방식으로, 각 샘플에 LC-MS에 의해 도입 변동을 분배하고 상이한 샘플 사이의보다 정확한 비교를 보장한다. LC 구배를 10 분 동안 95 %이고, 0.15 ㎖ / 분의 유속으로 85 %에서 5 분 칼럼 평형화 하였다 제외한 모든 6 샘플은, 동일한 MS 방법을 주 워쉬 실행을 추가. 시스템의 배경을 평가 레벨에 수행하는 각 세척 실행 후 빈 샘플 (100 % 물)를 추가합니다. </li><li> 순서를 저장하고 LC 열이 400 PSI 정도 안정 압력을 표시하면, 시퀀스 실행을 시작합니다. 다른 샘플은이 시퀀스 이후에 실행되도록 거기 없으면 끝나면 다음 그라데이션의 끝에서 0 ml / 분의 유량을 갖는 시퀀스의 끝에서 정지 주행을 추가하고 &quot;대기&quot;를 선택 순서. </li><li> 다시 실행 동일한 샘플을 보정 한 후에 12 시간을 설정합니다. (이 전보정 후의 질량 에러 변동을 평가하는 발.) </li></ol> 4. 포스트 분석 기기 청소 및 유지 보수 <ol><li> 시퀀스의 끝에서, 0.2 시간 동안 2 ml / 분의 유속으로 95 %로 컬럼을 세척하고, 필요한 경우, 세척하기 전에 열을 역방향. </li><li> LC 열을 제거하고 직접 조합하여 이온 소스에 LC를 연결합니다. 용매, 물 / 메탄올 / 포름산 청소 준비 (v를 : V : V, 90:10:0.2), 대기 모드에있는 MS를 설정하고, 0.1의 유속으로 세척 LC-MS 시스템 ㎖ / 분에서 1 시간 동안 제거 잔류는 염 또는 다른 불순물을 침전. 너무 많은 시스템 압력이 있으면 유량을 낮추. </li><li> 50 ° C에서 모세관 온도를 설정하고, 이온 케이지를 제거합니다. 모세관 온도가 50 ° C로 인하 한 후 조심스럽게 이온 청소 콘 및 이온 전달 튜브를 꺼내 이온 스위프 콘의 표면에 남아있는 불순물을 제거하기 위하여, 샌드페이퍼로서, 거친 메쉬를 사용. </li><li> 이온의 이동 배치0.1 % 포름산 10 ml의 90 % 물 / 메탄올을 함유하는 15 ㎖의 팔콘 튜브에 관. 20 분 동안 수욕에서 초음파 분쇄기의 튜브를 초음파 처리 한 후, 내부에 용매를 가만히 따르다 10 ㎖의 순수 메탄올로 교체하고 또 다른 20 분 동안 초음파 처리. (필요한 경우, 초음파는 40 °의 C 또는 더 나은 청소 결과를 달성하기 위해 더 높은 온도에서 수행 될 수있다.) </li></ol> LC-MS 데이터 5. 분석 <ol><li> 샘플 서열을 확인하기 위하여 시퀀스에서 첫 번째 두 개의 샘플을 마친 후 불명 대사에 대한 피크를 검사, 원활하게 실행. 대사 이름, 중립 화학식 및 탐지 모드 (양수 또는 음수), 입력 파일로, 출력 파일을 압축 해제 한 봉우리와 ppm의 질량 오류가있는 목록을 CSV 파일을 사용합니다. 피크 형태는 비정상 또는 질량 오차가 5ppm 이하로 떨어져 있다면, 시퀀스의 나머지를 정지하고, 문제가 수행되어야 할 필요가있다. </li><li> &quot;피크 정렬 방법을 선택합니다및 상용 소프트웨어에 프레임 추출 &quot;. LC-MS와 그룹들을 원시 데이터를 선택합니다. 피크 정렬을위한 크로마토 그래피 기준 샘플과 실행 시퀀스의 중간에 샘플을 선택합니다. 수집 된 데이터와 표적 대사 산물 분석 및 해당 프레임 시드 공지 대사 산물을 포함하는 프레임을 올려 시드. </li><li> 개별적으로 긍정과 부정 모드에서 데이터 분석을 수행합니다. 다른 매개 변수에 대한 기본 설정을 사용합니다. 데이터베이스 검색 기능을 해제하고 워크 플로를 실행합니다. 모든 프레임의 피크 면적을 포함하는 엑셀 시트로 처리 된 데이터를 내 보냅니다. 프레임의 첫 번째 세트는 타겟 목록의 대사에 대응한다. 참고 : 표적 대사 분석을 위해 대사 산물 정보는 이전 연구 13,15에 기초하여 획득된다. </li><li> 타겟이 불분명 한 대사 산물 분석을 위해, &quot;구성 요소의 추출&quot;의 방법을 선택합니다. 배경 빼기 빈 샘플을로드합니다. 설정된 피크 세기 임계t 10 5, 3의 잡음 비율 10 PPM 신호의 M / Z 폭. </li><li> 알 수없는 화합물의 식별을 위해 인간의 대사 체 데이터베이스를 사용합니다. 복제 샘플에서 큰 CVS를 사용하여 구성 요소를 제거하기 위해 CV 필터를 사용합니다. 수동으로 각 구성 요소를 통과하고 잘 정의 된 피크 또는 데이터베이스 검색을위한 다양한 샘플 종류의 비교적 큰 차이를 가진 사람을 선택합니다. 데이터베이스의 히트 곡 데이터를 내 보냅니다. (피크 정렬 점수가 너무 낮은 경우 픽 배향이 무시 될 수있다.) </li></ol>

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</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜을 이용하여 세포의 성공적인 대사 산물 프로파일 링을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 성장 배지와 세포의주의 추출을 제어하는​​ 단계; 2) 정량 피크 걸쳐 충분한 (보통 적어도 10) 데이터 포인트가되도록 MS 방법 설정에 근거 LC 방법을 조정하는 단계; 3) 샘플을 실행하기 전에 낮은 질량 교정을하고; 4) 이동 유지 시간을 피하기 위해 더 이상 5 이상 ㎖에 주입 피크 폭이 넓어 물에 의해 발생합니다; 5) 배치의 영향을 최소화하기 위해 동일한 배치의 비교를 위해 샘플을 준비하고 실행. 표준 낮은 질량 범위 교정 여기를 선택 (표 1)을 교환 할 수있다. 대량의 스캔 범위에 속하는 M / Z의 알려진 화합물은 잘 H-ESI 소스의 행동 및 교정 표준에 대한 합리적인 후보 물, 메탄올, 아세토 니트릴에 용해된다. 그것은 매우 모든 교정 솔루션을 저장하는 것이 좋습니다t 4 ° C의 카페인을 안정하고 또한 보정 성능이 ...

동시에 여러 대사 산물을 측정하는 실험으로 정의 대사는 강렬한 관심의 영역이었다. 대사는 분자 생리학의 직접 판독을 제공하고 암 1-4으로 개발 및 질병에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR) 및 가스 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (GC-MS)은 가장 일반적으로 사용되는 악기 5-9들이다. NMR, 특히 13 C라는 대사 무거운 동위 원소 표지 화합물, 이후 플럭스 실험에 사용 된 10, 11 NMR 활동이다. 그러나,이 전략은 대사에서 해당 응용 프로그램을 제한하는, 상대적으로 높은 샘플의 순도와 큰 샘플의 양을 필요로한다. 한편, NMR에서 수집 된 데이터를 집중 분석하고 복잡한 NMR 스펙트럼의 복합 할당이 곤란합니다. GC-MS는 광범위 극성 지질 대사 연구를 위해 사용되었지만, 그것은 휘발성 compoun을 필요DS 때로는 시간이 소요될 수 있습니다 복잡한 화학을 포함하고 실험적인 노이즈를 소개 대사 때문에 자주 유도체. 셋째 중극은 특성상 단편이나 딸 이온을 선택하는 데 사용되는 동안 삼중 사중 극 질량 분석계에 연결된 액체 크로마토 그래피 (LC)은, 다음 제 중극 조각화되어 본래 부모 이온을 선택하기위한 제 중극을 사용한다. 특정 딸 이온에 부모 이온의 전환을 기록하는이 방법은, 여러 반응 모니터링 (MRM)으로 불린다. MRM은 작은 분자와 단백질 정량 12-15,21 모두에게 매우 민감한 특정하고 강력한 방법입니다. 그러나, MRM은 한계가 있습니다. 높은 특이성을 달성하기 위해 MRM 방법은 각각의 대사에 구축 할 필요가있다. 이 방법은 특정 단편을 식별하고 prope의 사전 지식을 필요로 최적 충돌 에너지를, 대응 이루어져이러한 화학 구조 정보로서 그 대사 산물의 rties. 따라서, 일반적인 조각의 중립적 인 손실을 포함하는 몇 가지 예외를 제외하고,이 방법으로 알 수없는 대사를 식별 할 수 없습니다. 최근 몇 년 동안, 고해상도 질량 분석 (HRMS) 악기는 LTQ-orbitrap 및 Exactive 시리즈, QuanTof로 발표 및 TripleTOF 5600 16-18,22되었습니다. HRMS는 수 ppm의 오차 내에서 그대로 이온의 비율 (M / Z)를 충전하는 질량을 제공 할 수 있습니다. 따라서 모든 프리 커서 이온 (즉, 풀 스캔 모드)를 검출하여 조작 HRMS 악기 정확한 질량 분석의 결과 원소 조성으로부터 직접적인 구조 정보를 얻을 수 있고,이 정보는 잠재적 인 대사를 식별하기 위해 사용될 수있다. 실제로, 화합물에 대한 모든 정보는 구조적 이성질체의 레벨까지, 정확한 질량으로 얻을 수있다. 또한, 전체검사 방법은 대사 산물의 이전 지식을 필요로하지 않습니다 및 방법의 최적화가 필요하지 않습니다. m / z는 스캔 범위에 떨어지는 모든 이온을 분석 할 수 있기 때문에 또한, HRMS는 MRM 방법에 비해 단일 ​​실행 정량화 할 수있는 대사 산물의 수의 측면에서 거의 무제한의 용량을하고있다. HRMS 인해 스캔 전체 MS에서 얻어 질 수있는 데이터 포인트의 수를 비교 결과로 짧은 듀티 사이클에 또한 정량적 용량 삼중 사중 극 MRM에 대등하다. 따라서, HRMS 양적 대사에 대한 대체 방법을 제공합니다. 최근 HRMS의 개선 된 버전 (QE-MS)가 검출 영역 (19)을 확장 한 방법으로서, 충분히 빠른 사이클 시간과 양 및 음의 모드 사이의 전환에 따라 동작 될 수 Q-Exactive 질량 분석법을 칭했다. 여기서 우리는 QE-MS를 사용하여 우리의 대사 전략을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>포지티브 캘리브레이션 믹스</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88323</td><td>빛에 민감합니다. 4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>음성 보정 혼합물</td><td>Thermo Scientific</td> <td># 88324</td><td>4 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>Diazinon</td><td>Sant Cruz Biotechnology</td><td>#C0413</td><td>눈에 자극을 일으키므로 후드에서 작업하십시오. 4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>H-ESI 바늘 삽입</td><td>Fisher Scientific</td><td>#1303200</td><td>막힌 경우 5% 포름산/물(고무 링 제거)로 교체하거나 청소할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Xbridge 아미드 컬럼</td><td>Waters</td><td>#186004860</td><td>Guard 컬럼은 컬럼 수명을 늘리는 것이 좋습니다.</td></tr></tbody></table>

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 그러나, 현재의 플랫폼은 노동 집약적 샘플 준비, 낮은 검출 한계, 느린 검색 속도, 각 대사 산물에 대한 집중적 인 방법의 최적화 및 긍정적를 모두 측정 할 수 없다는 단일 실험에서 음으로 하전 된 이온과 같은 다른 제한 요인을 보유하고 있습니다. 따라서, 새로운 대사 프로토콜은 대사 체학 연구를 앞당길 수있다. 아미드 계 친수성 ​​크로마토 그래피는 화학 유도체없이 극성 대사 산물 분석을 가능하게한다. Q-Exactive (QE-MS)를 사용하여 고해상도 MS는 이온 광학 향상된 스캔 속도 (해상도 70,000 256 밀리 초)을 증가하고, 양 / 음 전환을 수행하는 기능을 가지고있다. 냉 메탄올 추출 전략을 사용하고, QE-MS와 아미드 열을 결합하는 동시에 추가 기능의 168 대상 극성 대사 물질 및 수천의 강력한 탐지 할 수 있습니다. DAT가공이 매우 효율적인 방식으로 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 수행되고, 질량 스펙트럼에서 추출 불명의 특징 데이터베이스에 쿼리 할 수​​있다.

대사 체학 데이터의 정확성이 높은 LC-QE-MS 기기의 성능에 따라 달라집니다. 악기가 좋은 상태에서 작동 여부를 평가하고, 그림 1과 같이 적용 방법은 적절한인지, 몇 가지 알려진 대사 LC 피크, 총 이온 크로마토 그래피 (TIC)에서 추출됩니다. 아미노산을 포함하여 극지 대사, 작용의 중간체 , TCA 중간체, 핵산, 비타민, 등등 ATP, NADP +와 현재 LC 조건 하에서 아미드 열에서 열 및 좋은 피크 모양에 잘 보존되어 있습니다. 한편, 질량 오류 테스트는 세중의 샘플 6 개의 농도가 보정 한 후에 두 번 실행됩니다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, 낮은 질량 교정 후 24 시간 내에서 수행, 전체 시간 범위는 거의 24 시간을 다루고있다. 질량 오차 표적 대사 산물의 이론적 m / z에 검출 된 m / z을 비교함으로써 평가된다. 여기에 대상으로 대사 m / z가74 (글리신)에서 (NADP +) (744)에 이...

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

이 절차의 전반적인 목표는 배양된 세포의 대사 프로파일링을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 세포에서 극성 대사 산물을 추출하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포 추출물을 물에서 재구성하고 샘플을 lc 바이알로 옮기는 것입니다.다음으로, 샘플을 보정된 lc QE MS 기기에 주입하고 최종 단계에서 원시 데이터를 컴퓨터에 기록합니다. 대사 산물 피크는 상용 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터에서 추출되며, 알려지지 않은 피크는 고해상도 질량 데이터베이스에서 검색됩니다. 이 마스터는 SARS의 상대적 대사 산물 수준에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 혈청이나 조직과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.먼저 20밀리몰 아세테이트인 500밀리리터의 이동상 A와 15밀리몰 수산화암모늄을 3% 아세토, 니트릴 및 물에 준비합니다. 병을 느슨하게 뚜껑을 씌운 후 수조에서 용액을 가열하지 않고 10 분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 5 밀리그램의 플루오로 아세테이트 나트륨과 산을 5 밀리리터의 물에 용해시켜 밀리리터당 1 밀리그램의 최종 농도를 만듭니다.그런 다음 디아지논을 메탄올에 용해시켜 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도를 만듭니다. 1ml의 negative low mass calibration solution을 준비하려면 960μl의 thermo negative calibration solution을 20μl의 sodium fluoro acetate 및 homovanillic acid solution과 혼합합니다. 1 밀리리터의 포지티브 저 질량 교정 용액을 만들려면 990 마이크로 리터의 열 포지티브 교정 용액과 10 마이크로 리터의 디아 지논 용액을 혼합하십시오.포지티브 모드에서 표준 질량 보정을 수행한 후 기기 제어 패널에서 스캔 범위를 60-900 질량 대 전하 비율로 조정하고 25전자 볼트의 소스 충돌 유도 해리를 적용합니다. 맞춤형 보정 이온을 입력하고 이온 소스가 안정되면 튜닝 페이지에서 사용자 지정 보정을 시작합니다. 네거티브 모드에서 표준 질량 교정을 수행한 후 극성을 네거티브 모드로 전환하고, 기기 제어판에서 스캔 범위를 60-900 질량 대 전하 비율로 조정하고, 35전자 볼트의 소스 충돌 유도 해리를 적용합니다.맞춤형 보정 이온을 입력하고 이온 소스가 안정되면 맞춤형 보정을 시작합니다. 튜닝 페이지에서 QE MS 기기를 레벨 C에 고정한 다음 질소 가스 주입구, 기화기 케이블 및 전압 케이블에 연결하여 가열된 전기 분무 이온화 또는 HESI 프로브를 장착합니다. 컴퓨터 튜닝 페이지에서 프로브에 대한 관련 튜닝 매개 변수를 설정합니다.모세관 온도를 섭씨 320도로 설정하고 S 렌즈를 55도로 설정합니다. 다음으로 메소드 프로그램에서 다음 값을 사용하여 전체 스캔 메소드를 빌드합니다. 선형 그래디언트 정보를 입력하여 크로마토그래피 방법을 설정합니다.실온에서 화합물 분리를 위해 amid 컬럼을 사용합니다. 이 시점에서 50ml에 40ml의 메탄올과 10ml의 물을 수동으로 혼합하여 추출 용매를 준비합니다. 2. 이전에 대장암을 배양했을 때 H CT 8개의 세포가 80%의 합류점에 도달합니다.매체를 빠르게 흡입하고 6웰 플레이트를 드라이아이스 위에 놓습니다. 그런 다음 즉시 각 웰에 1ml의 추출 용매를 추가하고 플레이트를 섭씨 80도의 음의 냉동고로 옮깁니다. 냉동실에서 플레이트를 꺼낸 후 15분 후 드라이아이스 위에 올려놓고 셀을 솔벤트로 긁어냅니다.각 우물에서 3개의 1.7 밀리리터 einor 관으로 해결책을 옮기고 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 G 시간의 속도로 표본을 원심 분리하십시오. 원심분리 후 상층액을 두 개의 새로운 einor 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 진공 상태에서 샘플을 건조시킵니다.샘플이 건조되면 섭씨 80도의 냉동고에 보관하십시오. 분석을 위해 냉동실에서 샘플을 꺼낸 후 얼음 온도에 도달하도록 합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 얼음물을 넣고 샘플을 와류로 만들어 대사 산물을 용해합니다.다음으로, 20, 000 번 G에서 섭씨 4도에서 샘플을 원심분리하십시오. 2분 동안 SUPERNAT를 lc 바이알로 옮기고 분석을 위해 5마이크로리터의 시료를 lc QES 기기에 주입합니다. QE MS 기기에서 보정이 적절하게 수행되면 분당 0.15ml의 유속으로 85%의 이동상 B로 lc 컬럼을 5분 동안 평형을 이룹니다.다음으로, LCMS에 의해 도입된 변동을 각 샘플에 분배하고 서로 다른 샘플 간의 보다 정확한 비교를 보장하기 위해 샘플 시퀀스를 무작위 순서로 설정합니다. 6개의 샘플마다 세척 실행을 추가한 다음 빈 샘플을 추가하여 시스템 배경 및 캐리오버 수준을 평가합니다. 시퀀스를 저장하고 시퀀스 실행을 시작합니다.염기서열의 처음 두 샘플이 실행된 후 lc 컬럼이 400PSI에 가까운 안정적인 압력을 나타내면 이러한 크로마토그램의 피크에서 미확인 대사 산물을 확인하여 샘플 염기서열이 원활하게 실행되는지 확인합니다. 시퀀스의 모든 샘플이 완료된 후 별도의 컴퓨터에서 데이터 분석을 수행합니다. 시판되는 소프트웨어에서 small molecule에 대한 피크 정렬 및 프레임 추출 방법을 선택하십시오.그런 다음 lc ms 원시 데이터를 로드하고 샘플 유형에 따라 그룹화합니다. 피크 정렬을 위한 크로마토그래피 참조 샘플로 실행 시퀀스 중간에 있는 샘플을 선택하고, 비율 그룹 또는 전체 변화 계산으로 그룹을 선택합니다. 그런 다음 수집된 데이터와 해당 프레임 시드와 함께 표적 대사 산물 분석을 위해 알려진 대사 산물을 포함한 프레임 시드를 업로드합니다.그런 다음 포지티브 또는 네거티브 모드에서 전체 스펙트럼 스캔을 선택하고 이 데이터 처리 파일을 원시 데이터와 동일한 폴더에 저장합니다. 데이터베이스 검색 기능을 끄고 워크플로우를 실행합니다. 그런 다음 프로세스 데이터를 모든 프레임의 피크 영역을 포함하는 Excel 시트로 내보냅니다.비표적 대사 산물 분석의 경우 성분 추출 방법을 선택합니다. 배경 빼기를 위해 샘플 원시 데이터와 3개의 빈 샘플을 로드합니다. 이 그룹 다음에는 원시 데이터를 사용하고 앞에서 설명한 대로 참조 샘플을 설정합니다.구성 요소 임계값을 10에서 5번째 값으로 설정합니다. 미지 화합물 식별을 위해 인간 대사체 데이터베이스를 사용합니다. 이 처리 파일을 저장한 후 데이터베이스 검색 기능을 끄고 워크플로를 시작합니다.데이터 처리가 완료되면 변동 계수 또는 CV 필터를 사용하여 반복 샘플 및 강도 필터 내에서 CV가 큰 구성 요소를 제거합니다. 노이즈 수준에서 감지된 성분을 수동으로 제거하려면 각 성분을 살펴보고 잘 정의된 피크 또는 데이터베이스 검색을 위한 다양한 샘플 유형에서 상대적으로 큰 차이가 있는 성분을 선택합니다. 마지막으로, 데이터베이스에서 히트가 있는 데이터를 내보냅니다.대사체학 데이터의 정확도는 기기가 양호한 상태로 작동하고 있는지, 적용된 방법이 적절한지 여부를 평가하기 위해 lc QEMS 기기 성능에 크게 좌우됩니다. 여기에 표시된 바와 같이 총 이온 크로마토그래피에서 여러 알려진 대사산물 lc 피크가 추출됩니다. 아미노산, 해당과정, 중간체, TCA, 중간체, 뉴클레오티드, 비타민A, TP 및 NADP를 포함하는 극성 대사 산물은 현재 lc 조건에서 컬럼에 우수한 머무름과 우수한 피크 모양을 가지고 있습니다.한편, 질량 오류 테스트는 그림과 같이 저질량 교정 후 24시간 이내에 수행됩니다. 여기서, 질량 오류는 검출된 질량 대 전하 비율을 표적 대사 산물의 이론적 질량 대 전하 비율과 비교하여 평가됩니다. 여기서, 표적 대사 산물은 74에서 744 범위의 질량 대 전하 비율을 갖습니다.여기서 Y축은 특정 질량 오차 범위 내에서 대사 산물의 누적 백분율을 나타냅니다. 파란색 곡선은 0시간에서 12시간까지의 결과를 보여주고, 빨간색 곡선은 보정 후 12시간에서 24시간 사이에 수집된 데이터를 보여줍니다. 대사 산물의 90% 이상이 5ppm 질량 오차 이내이며, 이는 여기에서 개발된 낮은 질량 범위 보정 방법이 낮은 질량 범위 검출을 위해 5ppm 질량 오류를 유지하기에 충분하다는 것을 의미합니다.해결해야 할 또 다른 문제는 현재 방법 및 기기 설정을 사용하는 기기의 감도입니다. 10cm 페트리 접시에서 3 배 샘플의 연속 희석을 6의 희석 계수로 5 번 수행하여 6 개의 다른 농도의 샘플을 생성했습니다. 표적 목록은 다양한 농도의 샘플에서 검출된 대사 산물의 수를 평가하는 데 사용됩니다.여기에 나타난 결과는 검출된 표적 대사산물의 최적 수가 5번째 세포의 2.78 곱하기 10과 6개의 세포에 대해 1.67 곱하기 10 사이인 반면, 7개의 세포에 대해 1 곱하기 10 곱하기 더 적은 수의 검출된 대사 산물을 제공하는 것을 나타내며, 이는 이온 억제 효과에 기인합니다. 이 결과는 이 분석을 위해 추출할 최적의 세포 수가 대략 6개의 웰 플레이트에 있는 웰의 양임을 나타냅니다. 비표적 대사 산물 분석의 경우 CV 컷오프 20%와 평균 강도 값 10에서 7번째 값을 사용하여 성분 테이블을 필터링합니다.CV 컷오프 값은 증가할 수 있지만 더 많은 피크를 포함하기 위해 평균 강도 값을 줄여야 합니다.피크를 수동으로 확인한 후 양호한 모양의 성분을 선택하고 인간 대사체 데이터베이스에서 검색합니다. 포지티브 모드에서 수집된 데이터의 결과는 여기에 나열되고 네거티브 모드의 결과는 여기에 나열됩니다. 여기에서 확인된 대사 산물 중 일부는 글루타티온 및 프롤린과 같은 표적 목록의 대사 산물과 겹칩니다.해당작용에서 파생될 수 있는 메틸 글리옥살과 1개의 pto, 2개의 ELE SN 글리세롤, 3개의 포스포콜린과 같은 표적 목록에 없는 추가 대사 산물도 탐색되며, 이는 3.2분의 머무름 시간으로 양성 모드에서 검출됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 배양된 사스에서 폴리 대사 산물을 추출한 다음 RC QES를 사용하여 다른 샘플에서 상대적인 대사 수준을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

대사 체학 실험 결과의 신뢰성은 시료 준비의 효율성과 재현성에 따라 달라집니다. 이후 화합물의 수천까지 분석, 또는 관심의 단지 화합물의 클래스의 옵션을 사용하여 생체 액에서 대사 산물의 추출을 가능하게하는 엄격하고 심도있는 방법입니다 설명.

심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

포유류 뇌의 신경 화학은 많은 신경 및 전신 질환에서 변화합니다. 대뇌 대사 산물의 특징적인 프로파일은 뇌 조직의 미가공 추출물을 기반으로 효율적으로 얻을 수 있습니다. 이를 위해 고해상도 NMR 분광법을 사용하여 대사 산물 농도(대사체학)에 대한 상세한 정량 분석이 가능합니다.

조직 추출물의 고해상도 핵 자기 공명 분광법에 의한 쥐 뇌의 대사 체 분석

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

우리는 효모 사카로미세스 세레바시아에있는 수용성 대사산물의 주요 클래스의 식별 그리고 양을 위한 프로토콜을 제시합니다. 설명된 방법은 다재다능하고 견고하며 민감합니다. 그것은 서로 수용성 대사 산물의 구조 이소목 및 고정 관형 형태의 분리를 허용한다.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

이 프로토콜에서는 많은 샘플의 효율적이고 빠른 샘플 준비를 결합한 최적화된 워크플로를 제시합니다. 또한, 대사 GWAS 연구의 고처리량 평가를 위한 분석 변형을 줄이기 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

우리는 XY-Meta와 metaX를 함께 통합하는 표적화되지 않은 대사 산물 워크 플로우를 구축했습니다. 이 프로토콜에서는 XY-Meta를 사용하여 오픈 액세스 스펙트럼 참조에서 데코이 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 방법을 표시 한 다음 FDR 제어를 수행하고 대사체 스펙트럼을 확인한 후 metaX를 사용하여 대사 산물을 정량화했습니다.

FDR 제어 기반 비표적 메타볼로임에 대한 식별 및 정량화의 통합 워크플로우

핵자기공명(NMR) 분광법은 다양한 질병을 앓고 있는 환자의 대사 산물에서 조절 장애를 식별하는 데 사용됩니다. 이 기술을 사용하면 정신 나간 대사 산물을 정량화하여 병태 생리학적 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에서는 환자의 대사 특성화를 위한 NMR 기반 접근법의 단계별 절차를 설명합니다.

NMR 기반 대사체학을 사용한 중증 환자의 정신 나간 대사 산물의 식별 및 정량화

이 프로토콜은 휘발성 염 용액 세척, 급속 액체 질소 담금질, 동결 건조 및 -8°C 저장을 결합하여 단일 세포 질량 분석법(SCMS)을 위한 세포 대사 산물을 보존하는 것을 목표로 합니다. 이는 액체 질소 담금질이 대사 산물 프로필을 유지하는 데 필수적이며, 대사 변화를 방지하기 위해 장기간 냉장 보관을 최소화해야 함을 보여줍니다.

단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

배우세요 LC-MS를 활용한 배양 세포의 극성 대사체 추출 및 분석 방법을 통해 대사 프로파일링을 수행하는 기법입니다. 이 프로토콜은 건강과 질병 관련 대사 변화 연구에 활용됩니다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

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