GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

이 실험 절차의 전반적인 목표는 해마 뉴런에서 gabaa 수용체의 표면 국소화 및 세포내섭취를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 태그가 지정된 gabaa 수용체 서브유닛을 통해 해마 뉴런을 형질전환하고, 배양된 뉴런을 배양기에서 성장시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 형광 Alexa 염료가 결합된 alpha bungalow toxin으로 표면 gabaa 수용체를 표지하는 것입니다.

다음으로, 표지된 수용체가 내세포작용(endocytosis)을 일으킬 수 있도록 뉴런을 다양한 시간 동안 배양합니다. 마지막 단계는 적절한 시점에 시료를 고정하고 anti-GFP를 이용한 면역 염색을 수행하여 전체 표지 수용체 풀을 관찰하는 것입니다. 최종적으로, 고정 또는 살아있는 세포 이미징 접근법을 통해 공초점 현미경을 사용하여 표지된 gabaa 수용체의 세포 표면 국소화 및 내세포작용의 변화를 보여줍니다.

이 방법은 리간드 결합이 수용체 엔도시토시스 및 삽입 속도에 어떤 영향을 미치는지, 그리고 서로 다른 리간드와 조절제가 수용체 재활용 및 분해에 영향을 줄 수 있는지와 같은 수용체 트래픽킹 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법은 주로 신경계 맥락에서 리간드가 결합된 이온 통로와 G-단백질 결합 수용체를 연구하는 데 사용되어 왔지만, 세포 배양 및 다양한 조직의 일차 세포 내에서 다른 막 단백질의 동적 국소화 및 트래픽킹을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 두 가지 이유로 어려움을 겪게 됩니다.

첫째로, 기능적 컨스트럭트를 제작하고, 둘째로 여러 시점을 동시에 처리하는 데 필요한 실습과 경험을 쌓기 위함입니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 3.5 centimeter 조직 배양 접시 내에 poly de lysine이 코팅된 4~5개의 원형 유리 커버슬립을 준비하십시오. 그 다음, 배양 당일에 갓 해리된 뉴런에 1~4 µg의 maxi prepped 컨스트럭트 DNA 플레이트를 트랜스펙션하십시오.

poly-D-lysine이 코팅된 커버슬립 위에 최종 밀도가 3.5 cm 디시당 약 200,000개의 뉴런이 되도록 형질전환된 뉴런을 분주합니다. 뉴런 배양 준비 후 4~24시간이 지나면 배지를 교체합니다. 그 후 인큐베이터에서 뉴런을 in vitro 14~17일 또는 엔도사이토시스 분석을 수행하기 위해 원하는 단계까지 성장시킵니다.

먼저 벤치탑 냉각 가열 장치를 16 °C로 설정합니다. 수조(water bath)에서 extracellular heaps, buffered saline 또는 HBS를 16 °C로 냉각합니다. 뉴런 디쉬를 16 °C의 알루미늄 플레이트로 옮겨 5분 동안 냉각합니다.

배지를 제거하고 16 °C의 HBS 1 mL와 150 µM 2-Bo Rine을 추가하여 2분 동안 처리합니다. 다음으로, 배지를 라벨이 부착된 폐기물 용기에 제거하고, 16 °C의 HBS 1 mL에 2-bo kerine과 alpha bungalow toxin Alexa 594를 추가하여 16 °C에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 배지를 라벨이 부착된 폐기물 용기에 옮기고, 유리 바닥 3.5 centimeter 배양 접시를 사용하여 수용체 엔도사이토시스 이후의 라이브 이미징 시계열 실험을 위해 16 degrees Celsius HBS 2 milliliters로 접시를 세 번 세척합니다. 접시를 현미경의 가열 스테이지로 옮기고 공초점 현미경 또는 turf 현미경으로 이미징을 시작합니다. 고정된 커버슬립을 위해 설정합니다.

T=0 시점의 커버슬립을 실온의 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 포함된 배양 접시에 넣고, 다른 시점의 경우 20분 동안 처리합니다. HBS를 37°C로 평형화된 조건화 배지로 교체하고, 필요한 시점에 따라 37°C 인큐베이터로 옮겨 내포 작용(endocytosis)을 유도합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내어 실온의 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 2 mL로 빠르게 2회 세척합니다.

그 다음 4% paraform aldehyde, 4% sucrose에서 20분 동안 표본을 고정합니다. 20분간의 고정 후, 4% paraform aldehyde, 4% sucrose를 폐기물 컨테이너에 버리고 상온의 DPBS 2 mL로 디쉬를 두 번 세척합니다. 이어서 커버슬립을 상온에서 10분 동안 배양합니다.

뉴런을 투과시켜 세포 내 수용체 풀의 anti-GFP 면역 염색 및 기타 관심 단백질의 표지를 가능하게 하기 위해 0.2% Triton X 100이 포함된 면역형광 블로킹 용액을 사용합니다. 그 후, 투과성 블로킹 용액을 제거하고 커버슬립을 Triton X 100이 없는 면역형광 블로킹 용액에서 20~30분 동안 반응시킵니다. 이어서 블로킹 용액 내의 커버슬립을 대상으로 실온에서 수 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체 반응을 수행합니다.

커버슬립을 DPBS에 5분 동안 담가 세척하며, 이를 총 3회 반복합니다. 그 후, 블로킹 용액에 희석된 2차 항체와 함께 커버슬립을 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 이전과 마찬가지로 DPBS를 사용하여 커버슬립을 3회 세척합니다.

다음으로, 커버슬립 뒷면의 과잉 액체를 실험용 티슈로 제거한 후, 유리 슬라이드 위에 4 µL의 마운팅 용액을 떨어뜨리고 그 위에 커버슬립을 덮어 마운팅합니다. 실험 조건을 알지 못하는 맹검 상태에서 60 x 오일 수치구경 1.49 침수 렌즈를 사용하여 공초점 현미경으로 이미지를 획득합니다.

동일한 이미지 획득 설정을 사용하여, 신경세포체와 여러 수지상 돌기가 초점에 들어온 단일 Z-섹션 이미지를 획득합니다. 모든 엔도사이토시스 데이터 분석에 동일한 임계값을 적용하여, 뉴런당 3~4개의 근위 수지상 돌기에서 20 µm 구간을 따라 alpha bungalow toxin, Alexa 형광 신호 및 GFP 면역 염색 강도를 정량화합니다. 각 시점당 10~12개의 뉴런 데이터를 분석합니다. 이 실험을 여러 개의 독립적인 신경세포 배양액으로 반복합니다.

GABA 작동성 축삭은 피라미드 뉴런의 수지상 돌기에 억제성 접촉을 형성합니다. 시냅스 소포로 GABA와 글라이신을 운반하는 소포성 억제성 아미노산 운반체(vesicular inhibitory amino acid transporter)를 통해 시냅스 전 억제성 말단을 식별합니다. GABA$_A$ 수용체는 포스트시냅스 억제성 스캐폴드 단백질인 gephyrin에 결합되어 신경전달물질 방출 부위와 밀접하게 마주 보고 있습니다. 여기에 제시된 것은 $\alpha 2$ phg F-P-B-B-S를 발현하는 뉴런으로, 표면 GABA$_A$ 수용체는 Alexa 594 bungarotoxin으로 표지하였고, 전체 수용체 집단은 anti-GFP 항체(녹색으로 표시)를 사용하여 면역 염색하였으며, 포스트시냅스 억제성 스캐폴드 단백질인 gephyrin 또는 소포성 억제성 아미노산 운반체를 함께 염색하였습니다.

여기서는 alpha bungalow toxin을 이용한 in vitro 15일 차 해마 뉴런의 alpha two 함유 GABA A 수용체의 내세포작용이 나타나 있습니다. 패널에 표시된 개별 수지상 돌기의 형광 측정값은 GFP 항체를 통한 구성체 발현 수준으로 정규화되었습니다. 시점 간의 최종 비교는 T = 0 측정값으로 정규화하여 수행되었습니다.

시간 경과에 따른 형광 신호 변화로부터 60분 동안의 수용체 내면화를 정량화한 결과, 단일 지수 함수로 가장 잘 설명되었습니다. 대안적인 방법으로는 라이브 이미징 타임랩스 공초점 현미경을 통해 단일 뉴런에서의 수용체 엔도사이토시스를 관찰하는 것이 있습니다. 실험 시작 시 P-H-G-F-P가 태깅된 GABA A 수용체와 표면 alpha bungalow toxin으로 라벨링된 수용체의 점상 및 중첩 형광이 관찰되며, 시간 경과에 따라 수용체가 엔도사이토시스됨에 따라 alpha bungalow toxin으로 라벨링된 GABA A 수용체 신호가 감소합니다.

새로운 수용체의 삽입으로 인해 P-H-G-F-P 신호가 높게 유지되는 반면, 이 절차 이후 P-H-G-F-P 신호의 최소 감소는 세포 표면 수용체 분포의 변화와 광퇴색(photobleaching)으로 인해 발생합니다. 다른 처리 조건에서의 수용체 삽입 속도와 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 벙갈로톡신(bungalow toxin) 삽입 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 세포 활성, 특정 단백질 도메인, 작용제 및 기타 조절 인자들이 살아있는 뉴런, 기타 세포 및 조직에서 수용체 회전(turnover)을 어떻게 변화시키는지 평가할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 표준 면역형광 기법과 결합된 Alexa-염색 alpha bungalow toxin을 사용하여 해마 뉴런의 표면 수용체 국소화를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.