Name: GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 α-bungarotoxin 형광 표지를 이용하여 해마 뉴런에서 GABA_A 수용체의 막 표면 현지화와 내재화를 측정하는 방법을. 이 기술은 수용체 동역학 연구에 활용됩니다.

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지원은 의학의 피츠버그 대학의 학교에서 약리학 및 화학 생물학과에서 시작 - 기금에 의해 제공되었다. 니콜라스 그라프 : 비디오 제출에 기여 야곱 실험실 구성원의 확인.

아래에 설명 된 모든 프로토콜은 IACUC 의학의 피츠버그 대학의 대학의 IRB 제도 평가 보드에 따른다. 1. 조직 문화 후드에있는 해마 신경 세포 배양의 준비 주 : 1 프로토콜에 걸쳐 사용 멸균 기술과 시약. <ol><li> 신경 세포의 배양 기질로 폴리-D-라이신 (0.1 ㎎ / ㎖의 H 2 O) 코팅 된 유리 커버 슬립을 준비합니다. <ol><li> 각 3.5 cm 조직 배양 접시 안에 4-5 라운드 유리 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 각 12mm의 coverslip에 위에 자리 70 ㎕의 폴리-D-라이신. 참고 : 라이브 영상을 위해, 유리는 3.5 cm의 조직 배양 접시 (내장 14mm 유리 커버 슬립에 200 ㎕의 폴리-D-라이신 자리)를 사용할 수 있습니다 바닥. </li><li> 조직 문화 후드의 O / N.에 준비된 요리를 남겨 폴리-D-라이신 증발을 최소화하고 조직 문화 후드에서 멸균 표면을 유지, 창틀을 닫고 일을 해제하려면전자 송풍기 O / N. 참고 : UV 빛은 O / N 배양 중에 사용되지 않습니다. </li><li> 다음날 아침 씻어 요리 H 2 O 2 ㎖로 3 배 </li><li> 2 O 세척 마지막 H를 제거한 후, 각 3.5 cm 접시에 미디어 2 ㎖를 추가하고 단계 1.4에 신경을 도금 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 접시를 둡니다. </li></ol></li><li> 해마 신경 세포는 배아 일 18-19 (Goslin 22에서 수정) (E18-19) 쥐에서 준비가되어 있습니다. </li><li> maxiprepped 구조의 DNA의 1-4 μg과 배양의 날에 갓 해리 신경 세포를 형질. 참고 : 일반적으로 DNA의 3 μg 50 %의 생존과 2 백만 신경 세포로 시작하는 60 %의 형질 전환 효율 (예 :와, 1-2000000 신경 세포로 형질 전환된다 : ((2 × 10 6 뉴런 × 0.5) 0.6)를 제공합니다 약 1 백만 신경;..의 잠재적 인 문제를 해결할 때 1을 형질 600,000있는 구조의 DNA의 다른 양의 형질 전환 될 수있다구조의 현지화 및 기능의 적절한 특성 다음에 표현. </li><li> 3.5 cm 접시 당 약 20 만 뉴런의 최종 밀도 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 슬립에 형질 전환 된 뉴런을 접시. 참고 : 유리 접시를 바닥에, 14mm 유리 지역에 4 만 ~ 5 만 신경을 접시. </li><li> 미디어에게 연결을 문화의 준비 후 4-24 시간을 교체 한 후 뉴런은 체외 (DIV) 또는 원하는 단계에서 14~17일 때까지 인큐베이터에서 개발할 수 있습니다. </li></ol> 2. 엔도 시토 시스의 분석 주의 : α-bungarotoxin 및 tubocurarine 폐기물 및 취급시주의 사항 : <ol><li> 모든 펩타이드 신경 독소의 처리는 바이오 안전성 레벨 2 (BL-2) 연구 프로토콜의 가이드 라인에 좋습니다. 모든 적절한 개인 보호 장비를 착용해야한다. 동결 건조 독소 분말은 제조 업체의 지침에 따라 재구성해야한다. 독소 폐기물 수오LD는 통치 기관의 환경, 보건 및 안전 지침을 준수하여 폐기 될 수있다. </li><li> 저장 중에 형성 할 수있는 잠재적 인 펩티드 응집물을 제거하고, α-bungarotoxin 분취 량은 사용 전에 잠깐 원심 분리되어야하고, 상청액은 실험을 위해 사용되어야한다. </li><li> α-bungarotoxin (BGT) 주식은 -20 ℃에서 멸균 H 2 O 1 ㎎ / ㎖의 농도로 재현 탁하고 10 ㎕의 분취 량에 저장됩니다 형광 결합 BGT의 주식은 3 ㎍ / ml로 사용된다. Tubocurarine 150 μM의 최종 농도로 사용된다. </li></ol><ol><li> 위에 얇은 알루미늄이나 스테인리스 강판 차가운 방에서 16 ° C로 설정 벤치 탑 히터 블록. 가능한 경우 또는, 벤치 탑 냉각 / 가열 장치는 16 ° C를 필요로하는 각 단계에 사용할 수 있습니다 </li><li> 밀리미터에 포함 쿨 세포 헤 페스 완충 식염수 (HBS : 135의 NaCl, 4.7 KCl을, 10 HEPES, 11 포도당, 1.2 MgCl2를, 2.5염화칼슘, 물을 욕조에 16 ° C에 산도 7.4). </li><li> 16 ° C에서 알루미늄 판에 전송 신경 세포의 요리를 5 분 동안 차가운. </li><li> 용지를 제거하고 (단계 2.8, 엔도 시토 시스의 시간을 분석 포인트를 인큐베이터에서 에어컨 미디어 및 예비 유지) 2 분 동안 16 ° C HBS +의 tubocurarine (150 μM)의 1 ㎖로 대체합니다. </li><li> 라벨 표시 한 폐기 용기에 HBS + tubocurarine를 제거하고 알렉사 594 [3 ㎍ / ㎖의], 15 분 동안 16 ° C에서 배양 1 ㎖ 16 ° C HBS +의 tubocurarine (150 μM) + α-bungarotoxin로 교체. </li><li> 제거 HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin 알렉사 594 (세척 50 % 표백제 50 ㎖를 포함하는 진공 플라스크에 흡입을 통해 수집 할 수 있습니다) 폐기물 컨테이너를 표시하고 요리를 16 ° C HBS의 2 ㎖로 3 배 세척합니다. </li><li> 유리를 사용하여 수용체 엔도 사이토 시스를 따르는 라이브 영상 시계열 실험은 3.5 cm 배양 접시 바닥의 경우, 단계 2.1-2.6를 수행 가열 단계로 요리를 전송(펠티어 소자) 현미경과 공 초점 또는 TIRF 현미경 설정으로 촬영을 시작한다. </li><li> 2.9 단계로 다른 커버 슬립을 계속, 20 분 동안 RT 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 접시에 T = 0 시점의 coverslips을 전송합니다. </li><li> 다른 시간 지점의 경우와 HBS 교체 37 ° C 미디어 (단계 2.4에 예약) 및 37 ° C. 주에서 엔도 사이토 시스를위한 인큐베이터에 반환이 평형 에어컨 : 추가 시간 T = 15 점, 30, 60를 제안했다. </li><li> 시점에서 필요한, ​​인큐베이터에서 접시를 취할 RT DPBS 2 ㎖로 빠르게 두 번 세척 (더 칼슘, 마그네슘을 DPBS 없음) 한 후 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당에 고정합니다. </li><li> 20 분 고정 후, 용기를 낭비하고 2 ㎖ RT DPBS로 두 번 설거지를 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 %의 자당을 제거합니다. </li><li> 면역 형광 블록 용액에 10 분 동안 RT에서 커버 슬립을 배양한다 (블록 용액 = DPBS에 5 % 말 혈청, 0.5 % BSA) permeabil 위하여 0.2 % 트리톤 X-100을 함유신경이지는 세포 내 수용체 수영장 및 / 또는 관심의 다른 단백질의 라벨의 안티 GFP 면역 염색을 가능하게합니다. </li><li> 블록 + 0.2 % 트리톤 X-100을 제거하고 20 ~ 30 분 동안 트리톤 X-100하지 않고 면역 블록 솔루션의 coverslips을 품어. </li><li> 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 몇 시간 동안 블록에 커버 슬립의 기본 항체 배양을 수행 참고 : 4 ° CO / N에서 예비 선거와 커버 슬립의 배양이 일상적으로 향상된 면역 결과를 얻을 수 있습니다. </li><li> 워시 DPBS (각 세척 단계에 대한 5 분)와 함께 배를 커버 슬립. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 차단 솔루션 차 항체와의 coverslips을 품어. </li><li> 워시 DPBS (각 세척 단계에 대한 5 분)와 함께 배를 커버 슬립. </li><li> 개별적으로 커버 슬립을 처리 마운트 커버 슬립이 : 실험실 조직과 커버 슬립의 뒷면에서 물기를 제거한 다음 유리 슬라이드에 장착 매체의 4 μL에 커버 슬립을 반전. </li><li> 실온에서 건조 슬라이드 생 후 30 분 동안 적용 허용4 ° C에서 광석 현미경을 수행 할 준비가 될 때까지. </li><li> 이미지 수집 및 공 초점 현미경 (실험 조건에 블라인드)와 실험의 분석. 60X 오일 NA 다음 레이저와 1.49 침수 목적 : 아르곤 가스를 488 나노 미터, 561 다이오드, 640 다이오드. <ol><li> 동일한 화상 취득 설정을 사용하여, 신경 세포의 세포체 및 포커스 몇개 수지상 프로세스와 단일 Z 단면 이미지를 얻기. </li><li> 모든 엔도 시토 시스 데이터의 분석에 대해 동일한 임계 값을 사용하여, 신경 세포 당 3 ~ 4 근위 수상 돌기의 20 μm의를 따라 α-bungarotoxin 알렉사 형광 신호 및 GFP의 면역 염색을 정량화. </li><li> 여러 독립적 인 연결을 문화와 실험을 반복, 각 시점에 10-12 뉴런에서 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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<li>Bogdanov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+GABAA+receptors+are+directly+recruited+from+their+extrasynaptic+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts.</a> EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).</li>
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<li>Anderson, M. J., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+staining+of+acetylcholine+receptors+in+vertebrate+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle.</a> J. Physiol. 237, 385-400 (1974).</li>
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<li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).</li>
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<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+membrane+trafficking+regulates+spine+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에 설명 BBS 기반 고정 라이브 기법 수용체 또는 세포주, 뉴런, 및 다른 프라이 머리 셀의 다른 세포막 단백질 매매를 추적하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 성공적 막 삽입 및 리간드 관문 이온 채널과 GPCR의 제거를 연구 인해 수용체 작용제 및 조절제의 존재로 매매의 변화를 평가하기 위해 사용되었다. 주요 측면은 적절한 세포 위치 태그의 현지화 및 BBS의 추가를 확인하기 위해 컨트롤을 수행 (예 : GFP와 같은 다른 기자들에 대한 표준) 기능 침묵 있습니다. 표시된 바와 같이 니코틴 아세틸 콜린 (nAChR의) 수용체를 발현하는 세포에 사용하기위한, nAChR의 길항제 tubocurarine는 프로토콜에서 사용되어야한다. 추가적인 GFP 태그가 사용되지 않는 경우에는, 전체 BBS 단백질 수준은 고정 및 permeabiliz 후에 다른 형광 물질에 결합 부가 α-bungarotoxin로 염색을 통해 결정될 수있다 태그ATION. 관심의 수용체 / 단백질의 세포 내 이입 속도를 측정하는 시점의 선택은 더 많은 시...

의 형광 수용체 현지화 및 역학을 연구하는 α-bungarotoxin을 결합 사용은 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 13-15, 독소의 내생 대상의 연구에서 개척되었다. 그 후, 최소한의 BGT 바인딩 펩타이드 (BBS)의 결합은 두 흥분성과 억제 리간드 게이트 이온 채널 및 G 단백질 결합 수용체 2,10,16-21의 인신 매매를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 BBS 기반 기술은 표면의 바이오 티 닐화 방법, 세포 항원에 대한 항체와 살아있는 세포의 항체 라벨 및 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구와 같은 인신 매매의 연구에 사용되는 다른 방법에 이점을 제공한다. 세포 표면 동안 바이오 티 닐화 무료 아민이 공유 결합으로 세포 활동에 영향을 미칠 가능성과 함께 수정됩니다. 항체 기반의 연구는 종종 인신 매매 이벤트를 변경할 수있는 표면 항원의 클러스터링이나 모자를 씌우기에 의해 방해되었다. 때문에 FRAP들에 대한 표백 단계에tudies, 중요한 문제는 기본 세포 구조를 손상된다. 추가적인 장점은 BBS는 구조도 바이오틴 결합 엉덩이에 bungarotoxin 수용체 인신 매매와 생화학 적 방법에 사용할 수있는 태그입니다. 이 기술은 세포주 및 일차 전지가 쉽게 적용 가능하다. 표시된 바와 같이 니코틴 아세틸 콜린 (nAChR의) 수용체를 발현하는 세포에 사용하기위한, nAChR의 길항제 tubocurarine는 프로토콜에서 사용되어야한다. tubocurarine의 부재에 형질 감염되지 않은 세포 (엔도 시토 시스 프로토콜 T = 0 시점에 해당) 간단한 표면 BGT 라벨을 수행하면 내생 nAChR의 증거를 제공 할 것입니다. 그것은 또한 단백질이 세포막에 전달되는 세포의 위치에 존재하도록 이러한 기술을 사용하기위한 중요한 고려 사항은 BBS의 적절한 삽입이다. 예를 들어, GABAAR 서브 유닛의 N-말단 도메인은 인신 동안 기공을 갖는 루멘에 상주ficking 및 세포 표면 수용체와 세포 내 이입에 의해 이벤트가 세포 표면에서 그들의 제거의 평가의 구체적인 표시를 허용 세포막에있는 수용체 삽입 후 세포가된다. 우리는 이전에 GFP, MYC, 또는 BBS의 추가 GABAAR 서브 유닛이 도메인에 항원 것으로 나타났습니다 것은 기능적으로 침묵이다. 표준 컨트롤은 적절 지역화 것을 태그로 단백질을 구성하는 태그없는 유사한 수준으로 발현 될 수 있도록 수행되고, 그것은 수용체 기능에 영향을주지해야한다. 형질 구조의이 특성은 문제 해결의 과발현 문제에 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>P3 기본 셀 4D 키트&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 공액</td><td>분자 프로브</td><td>B35450</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 공액</td><td>분자 프로브</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 공액</td><td>분자 프로브</td><td>B13423</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Tubocurarine chloride</td><td>Tocris</td><td>2820</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>cS703</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 칼슘 없음, 마그네슘</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Gephyrin 항체</td><td>Synaptic Systems</td><td>147 011</td><td>1:300</td></tr><tr><td>VIAAT/VGAT 항체</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 002</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>anti GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A6455</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>Glass bottom tissue culture dish</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (원형 커버 유리), # 1 두께, 12mm</td><td>워너 악기</td><td>640-0702</td><td></td></tr></tbody></table>

gaba 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

그것은 점점 더 분명 그 이온 성 GABA 수용체 (GABAAR), 전시 매우 역동적 인 인신 매매와 세포 표면의 이동성 1-7 등의 신경 전달 물질 수용체,. 수용체 세포 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 연구하기 위해, 여기에 설명 된 기술은 세포가 α-bungarotoxin (BGT) 결합 부위 (BBS)를 포함하는 구조를 표현하는 형광 α-bungarotoxin의 사용을 결합한다. BBS (WRYYESSLEPYPD)는 높은 친화력 8,9와 BGT를 결합하는 근육 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 α ​​서브 유닛을 기반으로합니다. BBS 사이트의 설립 이전에 GABAA 및 대사성 GABAB의 추적 2,10 수용체에 설명 된대로, 표면의 현지화 및 수용체의 삽입 또는 외인성 형광 BGT의 응용 프로그램 제거를 측정 할 수 있습니다. BBS 사이트 또, 아미노산 및 4 표준 m 의하여 성숙한 GABAAR 소단위의 (5) 사이에 pH 민감성 GFP (pHGFP 11)을 삽입olecular 생물학 및 PCR 클로닝 전략 12 (그림 1 참조). BBS는 13 아미노산 알라닌 / 프로 링커에 의해 분리 된 pH 민감성 GFP 기자의 3 &#39;입니다. 총의 기자가 BGT 정상화 총 수용체 인구 수용체 인구를 표시하므로 GABAAR 소단위 단백질 수준을 태그로 고정 샘플을 기반으로이 책에서 설명한 연구 인신 매매의 경우, pHGFP는 역할을한다. 이것은 태그 GABAAR 소단위의 높거나 낮은 기준선 식의 결과 BGT 염색 신호 가변성 세포 간을 최소화한다. 또한 pHGFP 태그 라이브 또는 고정 이미징 실험을위한 구조 발현하는 세포를 쉽게 식별 할 수 있습니다.

BBS 태그 구조의 특성이 같은 표현 단백질 (특히 여러 개의 서브 유닛으로 구성 수용체)가 제대로 조립 여부를 결정하는 중요한 컨트롤이 포함되어, 세포 표면에 교통 정체를 적절하게 지역화. 억제 시냅스는 억제 비계 단백질 gephyrin와 colocalize과 시냅스 소포 (VIAAT / VGAT)에 GABA와 글리신을로드하는 기공 억제 아미노산 수송에 의해 확인 시냅스 억제 터미널, 나란히 놓여있다 수용체 표면 클러스터는 G​​ABA로 구성된다. α2pHGFP + BBS는 안티 GFP 항체와 시냅스 억제 비계 단백질 gephyrin (그림 2A) 또는 VIAAT (그림 2B) 중 하나와 전체 수용체 인구에 대한 면역 염색 한 다음 BGT으로 표시 표면 GABAAR과 뉴런을 표현하는 그림 2에 표시됩니다. 그림 3은 α의 엔도 시토 시스를 보여줍니다2 1...

여기에서 우리는 GABA 해마 신경 세포에있는 수용체 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 측정하기 위해-bungarotoxin을 α에 결합 형광 알렉사 염료의 사용을 보여줍니다. α-bungarotoxin, 세포막 단백질의 세포 내 이입 매매 분석을 달성 할 수있는 바인딩 짧은 세포 태그 베어링 구조의 사용을 통해.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 해마 뉴런에서 gabaa 수용체의 표면 국소화 및 세포내섭취를 측정하는 것입니다. 이는 먼저 태그가 지정된 gabaa 수용체 서브유닛을 통해 해마 뉴런을 형질전환하고, 배양된 뉴런을 배양기에서 성장시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 형광 Alexa 염료가 결합된 alpha bungalow toxin으로 표면 gabaa 수용체를 표지하는 것입니다.다음으로, 표지된 수용체가 내세포작용(endocytosis)을 일으킬 수 있도록 뉴런을 다양한 시간 동안 배양합니다. 마지막 단계는 적절한 시점에 시료를 고정하고 anti-GFP를 이용한 면역 염색을 수행하여 전체 표지 수용체 풀을 관찰하는 것입니다. 최종적으로, 고정 또는 살아있는 세포 이미징 접근법을 통해 공초점 현미경을 사용하여 표지된 gabaa 수용체의 세포 표면 국소화 및 내세포작용의 변화를 보여줍니다.이 방법은 리간드 결합이 수용체 엔도시토시스 및 삽입 속도에 어떤 영향을 미치는지, 그리고 서로 다른 리간드와 조절제가 수용체 재활용 및 분해에 영향을 줄 수 있는지와 같은 수용체 트래픽킹 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법은 주로 신경계 맥락에서 리간드가 결합된 이온 통로와 G-단백질 결합 수용체를 연구하는 데 사용되어 왔지만, 세포 배양 및 다양한 조직의 일차 세포 내에서 다른 막 단백질의 동적 국소화 및 트래픽킹을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 두 가지 이유로 어려움을 겪게 됩니다.첫째로, 기능적 컨스트럭트를 제작하고, 둘째로 여러 시점을 동시에 처리하는 데 필요한 실습과 경험을 쌓기 위함입니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 3.5 centimeter 조직 배양 접시 내에 poly de lysine이 코팅된 4~5개의 원형 유리 커버슬립을 준비하십시오. 그 다음, 배양 당일에 갓 해리된 뉴런에 1~4 µg의 maxi prepped 컨스트럭트 DNA 플레이트를 트랜스펙션하십시오.poly-D-lysine이 코팅된 커버슬립 위에 최종 밀도가 3.5 cm 디시당 약 200,000개의 뉴런이 되도록 형질전환된 뉴런을 분주합니다. 뉴런 배양 준비 후 4~24시간이 지나면 배지를 교체합니다. 그 후 인큐베이터에서 뉴런을 in vitro 14~17일 또는 엔도사이토시스 분석을 수행하기 위해 원하는 단계까지 성장시킵니다.먼저 벤치탑 냉각 가열 장치를 16 °C로 설정합니다. 수조(water bath)에서 extracellular heaps, buffered saline 또는 HBS를 16 °C로 냉각합니다. 뉴런 디쉬를 16 °C의 알루미늄 플레이트로 옮겨 5분 동안 냉각합니다.배지를 제거하고 16 °C의 HBS 1 mL와 150 µM 2-Bo Rine을 추가하여 2분 동안 처리합니다. 다음으로, 배지를 라벨이 부착된 폐기물 용기에 제거하고, 16 °C의 HBS 1 mL에 2-bo kerine과 alpha bungalow toxin Alexa 594를 추가하여 16 °C에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 배지를 라벨이 부착된 폐기물 용기에 옮기고, 유리 바닥 3.5 centimeter 배양 접시를 사용하여 수용체 엔도사이토시스 이후의 라이브 이미징 시계열 실험을 위해 16 degrees Celsius HBS 2 milliliters로 접시를 세 번 세척합니다. 접시를 현미경의 가열 스테이지로 옮기고 공초점 현미경 또는 turf 현미경으로 이미징을 시작합니다. 고정된 커버슬립을 위해 설정합니다.T=0 시점의 커버슬립을 실온의 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 포함된 배양 접시에 넣고, 다른 시점의 경우 20분 동안 처리합니다. HBS를 37°C로 평형화된 조건화 배지로 교체하고, 필요한 시점에 따라 37°C 인큐베이터로 옮겨 내포 작용(endocytosis)을 유도합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내어 실온의 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 2 mL로 빠르게 2회 세척합니다.그 다음 4% paraform aldehyde, 4% sucrose에서 20분 동안 표본을 고정합니다. 20분간의 고정 후, 4% paraform aldehyde, 4% sucrose를 폐기물 컨테이너에 버리고 상온의 DPBS 2 mL로 디쉬를 두 번 세척합니다. 이어서 커버슬립을 상온에서 10분 동안 배양합니다.뉴런을 투과시켜 세포 내 수용체 풀의 anti-GFP 면역 염색 및 기타 관심 단백질의 표지를 가능하게 하기 위해 0.2% Triton X 100이 포함된 면역형광 블로킹 용액을 사용합니다. 그 후, 투과성 블로킹 용액을 제거하고 커버슬립을 Triton X 100이 없는 면역형광 블로킹 용액에서 20~30분 동안 반응시킵니다. 이어서 블로킹 용액 내의 커버슬립을 대상으로 실온에서 수 시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체 반응을 수행합니다.커버슬립을 DPBS에 5분 동안 담가 세척하며, 이를 총 3회 반복합니다. 그 후, 블로킹 용액에 희석된 2차 항체와 함께 커버슬립을 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 이전과 마찬가지로 DPBS를 사용하여 커버슬립을 3회 세척합니다.다음으로, 커버슬립 뒷면의 과잉 액체를 실험용 티슈로 제거한 후, 유리 슬라이드 위에 4 µL의 마운팅 용액을 떨어뜨리고 그 위에 커버슬립을 덮어 마운팅합니다. 실험 조건을 알지 못하는 맹검 상태에서 60 x 오일 수치구경 1.49 침수 렌즈를 사용하여 공초점 현미경으로 이미지를 획득합니다.동일한 이미지 획득 설정을 사용하여, 신경세포체와 여러 수지상 돌기가 초점에 들어온 단일 Z-섹션 이미지를 획득합니다. 모든 엔도사이토시스 데이터 분석에 동일한 임계값을 적용하여, 뉴런당 3~4개의 근위 수지상 돌기에서 20 µm 구간을 따라 alpha bungalow toxin, Alexa 형광 신호 및 GFP 면역 염색 강도를 정량화합니다. 각 시점당 10~12개의 뉴런 데이터를 분석합니다. 이 실험을 여러 개의 독립적인 신경세포 배양액으로 반복합니다.GABA 작동성 축삭은 피라미드 뉴런의 수지상 돌기에 억제성 접촉을 형성합니다. 시냅스 소포로 GABA와 글라이신을 운반하는 소포성 억제성 아미노산 운반체(vesicular inhibitory amino acid transporter)를 통해 시냅스 전 억제성 말단을 식별합니다. GABA$_A$ 수용체는 포스트시냅스 억제성 스캐폴드 단백질인 gephyrin에 결합되어 신경전달물질 방출 부위와 밀접하게 마주 보고 있습니다. 여기에 제시된 것은 $\alpha 2$ phg F-P-B-B-S를 발현하는 뉴런으로, 표면 GABA$_A$ 수용체는 Alexa 594 bungarotoxin으로 표지하였고, 전체 수용체 집단은 anti-GFP 항체(녹색으로 표시)를 사용하여 면역 염색하였으며, 포스트시냅스 억제성 스캐폴드 단백질인 gephyrin 또는 소포성 억제성 아미노산 운반체를 함께 염색하였습니다.여기서는 alpha bungalow toxin을 이용한 in vitro 15일 차 해마 뉴런의 alpha two 함유 GABA A 수용체의 내세포작용이 나타나 있습니다. 패널에 표시된 개별 수지상 돌기의 형광 측정값은 GFP 항체를 통한 구성체 발현 수준으로 정규화되었습니다. 시점 간의 최종 비교는 T = 0 측정값으로 정규화하여 수행되었습니다.시간 경과에 따른 형광 신호 변화로부터 60분 동안의 수용체 내면화를 정량화한 결과, 단일 지수 함수로 가장 잘 설명되었습니다. 대안적인 방법으로는 라이브 이미징 타임랩스 공초점 현미경을 통해 단일 뉴런에서의 수용체 엔도사이토시스를 관찰하는 것이 있습니다. 실험 시작 시 P-H-G-F-P가 태깅된 GABA A 수용체와 표면 alpha bungalow toxin으로 라벨링된 수용체의 점상 및 중첩 형광이 관찰되며, 시간 경과에 따라 수용체가 엔도사이토시스됨에 따라 alpha bungalow toxin으로 라벨링된 GABA A 수용체 신호가 감소합니다.새로운 수용체의 삽입으로 인해 P-H-G-F-P 신호가 높게 유지되는 반면, 이 절차 이후 P-H-G-F-P 신호의 최소 감소는 세포 표면 수용체 분포의 변화와 광퇴색(photobleaching)으로 인해 발생합니다. 다른 처리 조건에서의 수용체 삽입 속도와 같은 추가적인 의문에 답하기 위해 벙갈로톡신(bungalow toxin) 삽입 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 세포 활성, 특정 단백질 도메인, 작용제 및 기타 조절 인자들이 살아있는 뉴런, 기타 세포 및 조직에서 수용체 회전(turnover)을 어떻게 변화시키는지 평가할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 표준 면역형광 기법과 결합된 Alexa-염색 alpha bungalow toxin을 사용하여 해마 뉴런의 표면 수용체 국소화를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

태그를 추가하여 superecliptic pHluorin와 막 수용체의 세포 외 도메인, 및 이미징에 의해 배양 된 마우스 뉴런에서 이러한 퓨전 수용체, 우리는 직접 플라즈마 막에 수용체의 개별 기공을 갖는 삽입 이벤트를 시각화 할 수 있습니다. 이 기술은 플라즈마 막에 수용체 삽입에 관한 분자 메커니즘을 elucidating에 도움 될 것입니다.

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

이 비디오는 1차 해마 신경 세포에서 글루타메이트 수용체의 이동을 연구하기 위한 항체 섭식 접근 방식을 보여줍니다. 이 접근 방식을 사용하면 원형질과 내막 모두에서 수용체 집단을 관찰할 수 있습니다. 이러한 subsets 간의 구별은 동일한 1차 항체를 사용하지만 다른 형광단에 접합된 2차 항체를 사용하여 막 투과화 전후의 수용체를 라벨링함으로써 달성됩니다.

해마 뉴런에서 글루타메이트 수용체 이동을 연구하기 위한 체외 기술

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

Guanosine triphosphate (GTP) 결합은 G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) 활성화에서 가장 초기의 사건 중 하나이다. 이 프로토콜은 방사성 표지 된 GTP 유사체 [ 35 S] 구아노 신 -5'-O- (3- 티오) 트리 포스페이트 ([ 35 S] GTPγS)의 결합을 모니터링함으로써 특정 GPCR- 리간드 상호 작용을 약리학 적으로 특성화하는 방법을 설명합니다. 관심있는 리간드에 대한 반응.

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

여기, 선물이 생리학 및 약리학 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물을 발견 하는 프로토콜.

감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

신경 흥분의 엔도-동적 과정 및 exocytosis 흥분 성의 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 통해 변조 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 표면 및 내부 수용 체 인구 풀 측정에 대 한 접근, 하이 콘텐츠 분석 결과가입니다.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

이 문서는 조미료 수용 체를 연구 하는 방법을 제시 (GluR) 해리 된 기본 해 마 문화에서 인신 매매. 약리학적 접근법과 함께 내인성 또는 과발현 수용체를 라벨링하는 항체 공급 접근법을 사용하여, 이 방법은 조절하여 GluR 표면 발현을 조절하는 분자 메커니즘의 식별을 허용합니다. 내재화 또는 재활용 프로세스.

해리 된 기본 해 마 문화에서 조미료 수용 체 인신 매매를 연구 하는 항 체 먹이 접근

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

이 프로토콜은 포유류 Neuro-2a 세포주를 이용한 뉴런 니코틴계 아세틸콜린 수용체 소단위의 발현 및 정량을 설명합니다. pH 민감성 형광 태그와 공초점 현미경은 수용체의 위치가 형질막과 pH 중립 세포 내 구획에서 발현된 수용체를 정밀하게 평가할 수 있게 하여 nAChR 수송과 약리학적 조절 연구를 용이하게 합니다.

포유류 세포에서 정량적 영상을 이용한 세포내 니코틴 아세틸콜린 수용체의 원형 및 세포내 원형질막 위치

배우세요 α-bungarotoxin 형광 표지를 이용하여 해마 뉴런에서 GABA_A 수용체의 막 표면 현지화와 내재화를 측정하는 방법을. 이 기술은 수용체 동역학 연구에 활용됩니다.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

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