GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 해마 뉴런에서 가바아 수용체 표면 국소화 및 세포내이입증을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 태그가 지정된 gabaa 수용체 소단위체로 해마 뉴런을 transection하고 배양된 뉴런이 인큐베이터에서 발달할 수 있도록 함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 표면 가바 수용체에 알파 방갈로 토인 결합 형광 Alexa 다이로 표시하는 것입니다.

다음으로, 표지된 수용체가 내세포세포(endocytose)가 될 수 있도록 하기 위해 뉴런을 다양한 시점 동안 배양합니다. 마지막 단계는 적절한 시점에 검체를 고정하고 anti GFP를 사용하여 면역 염색을 수행하여 태그가 지정된 총 수용체 풀을 관찰하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경 검사는 고정 또는 실시간 이미징 접근 방식을 사용하여 태그가 지정된 gabaa 수용체의 표면 국소화 및 세포내이입의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.

이 방법은 리간드 결합이 수용체 내포작용 및 삽입 속도에 어떤 영향을 미칠 수 있는지, 다른 리간드와 조절제가 수용체 재활용 및 분해에 영향을 미칠 수 있는지 여부와 같은 수용체 이동 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 주로 신경계의 맥락에서 G-단백질 결합 수용체의 결찰 이온 채널을 연구하는 데 사용되었지만, 세포 배양 및 다양한 조직의 일차 세포에서 다른 막 단백질의 동적 국소화 및 이동을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 두 가지 이유로 어려움을 겪을 것입니다.

첫째는 기능적 구조를 만드는 것이고, 둘째는 여러 시점을 동시에 처리하는 데 필요한 연습과 경험을 만드는 것입니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 3.5cm 조직 배양 접시 내부에 4-5개의 원형 poly de lysine 코팅 유리 커버 슬립을 준비합니다. 그런 다음 배양 당일에 갓 해리된 뉴런을 1-4마이크로그램의 맥시가 준비된 구조 DNA 플레이트로 transfection합니다.

poly de lycine 코팅 덮개의 형질 주입된 뉴런은 3.5cm 접시당 약 200, 000개의 뉴런의 최종 밀도로 미끄러집니다. 신경 세포 배양 준비 후 4-24시간 후에 배지를 교체하십시오. 그런 다음 시험관 내 14-17일 또는 세포내이입 분석을 수행하기 위한 원하는 단계까지 인큐베이터에서 뉴런이 발달하도록 합니다.

먼저 탁상용 냉각 가열 장치를 섭씨 16도로 설정합니다. 수조에서 세포 외 더미, 완충된 식염수 또는 HBS를 섭씨 16도까지 냉각합니다. 뉴런 접시를 섭씨 16도의 알루미늄 플레이트로 옮기고 5분 동안 식힙니다.

매체를 제거하고 섭씨 16도의 HBS 1밀리리터와 150마이크로몰, 2 보 린으로 2분 동안 교체합니다. 다음으로, 라벨이 붙은 폐기물 용기의 매체를 제거하고 섭씨 16도 HBS 1 밀리리터와 2 개의 보 케린 플러스 알파 방갈로 독소로 교체하십시오. Alexa 5 9 4는 섭씨 16도에서 15분 동안 배양합니다.

배양 후, 배지를 표지된 폐기물 용기로 옮기고 유리 바닥의 3.5cm 배양 접시를 사용하여 수용체 내포작용 후 라이브 이미징 시계열 실험을 위해 섭씨 16도 HBS 2밀리리터로 접시를 3회 세척합니다. 접시를 가열된 스테이지로 옮기십시오.tage 현미경의 그리고 컨포칼 또는 잔디 현미경으로 이미징을 시작합니다. 고정 커버 슬립을 설정합니다.

전송 T는 0 시점 커버가 실온 4%파라 포름알데히드, 4% 자당의 접시에 20분 동안 다른 시점의 경우 20분 동안 미끄러지는 것과 같습니다. HBS를 조건화된 섭씨 37도 배지로 교체하고 필요한 시점에 섭씨 37도에서 세포내이입(endocytosis)을 위해 인큐베이터로 돌아갑니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 실온 2ml, delcos phosphate, 완충 식염수 또는 DPBS로 빠르게 두 번 씻습니다.

그런 다음 표본을 4% 파라폼 알데히드, 4% 자당에 20분 동안 고정합니다. 20분 고정 후 폐기물 용기에 있는 파라폼 알데히드 4%, 수크로오스 4%를 제거하고 실온 DPBS 2밀리리터로 접시를 두 번 씻습니다. 그런 다음 커버 슬립을 실온에서 10분 동안 배양합니다.

0.2%Triton X 100을 함유한 면역형광 차단 용액으로 뉴런을 투과하고 세포 내 수용체 풀의 항 GFP 면역 염색 및/또는 다른 관심 단백질의 라벨링을 가능하게 합니다. 그런 다음 투과성 블록 용액을 제거하고 Triton X 100이 없는 면역형광 블록 용액에서 커버 슬립을 20-30분 동안 배양합니다. 배양 후 실온에서 몇 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 커버 슬립의 1차 항체 배양을 수행합니다.

DPBS에 5분 동안 담가두면 총 3회 세탁하여 커버 슬립을 세탁합니다. 그런 다음 1시간 후 실온에서 1시간 동안 블록 용액에 2차 항체와 함께 커버 슬립을 배양합니다. 이전과 같이 DPBS로 커버 슬립을 세 번 세척합니다.

다음으로, 실험실 티슈로 커버 슬립 뒷면에서 과도한 액체를 제거한 다음 커버 슬립을 유리 슬라이드의 4마이크로리터 장착 매체에 뒤집어 각 커버 슬립을 장착합니다. 컨포칼 현미경으로 60 x 오일 개구수를 사용하여 실험 조건을 블라인드로 설정하여 이미지 획득을 수행합니다. 1.49 침수 목표.

동일한 이미지 획득 설정을 사용하여 뉴런 세포체와 여러 수지상 돌기에 초점을 맞춘 단일 Z 섹션 이미지를 획득하고, 모든 세포내이입 데이터의 분석을 위해 동일한 임계값을 사용하여 뉴런당 3-4개의 근위 수상돌기로 구성된 20미크론을 따라 알파 방갈로 독소, Alexa 형광 신호 및 GFP 면역 염색을 정량화합니다. 각 시점에 대해 10개에서 12개의 뉴런 데이터를 분석합니다. 여러 독립적인 신경 배양으로 실험을 반복합니다.

GABAergic 축삭돌기는 피라미드 뉴런 수상돌기에 억제 접촉을 합니다. 시냅스 전 억제 말단은 GABA와 글리신을 시냅스 소포에 적재하는 소포 억제 아미노산 수송체에 의해 식별됩니다. GABA a 수용체는 시냅스 후 억제 골격 단백질 gein에 의해 묶인 신경 전달 물질 방출 부위와 밀접하게 반대됩니다 여기에 표시된 것은 Alexa 5 9 4 방갈로 독소로 표지 된 표면 gabaa 수용체를 가진 뉴런을 발현하는 알파 2 phg F-P-B-B-S 발현 뉴런 다음에 녹색으로 표시된 항 GFP 항체를 가진 총 수용체 집단에 대한 면역 염색, 그리고 시냅스 후 억제 골격 단백질 gein 또는 소포 억제 아미노산 수송체입니다.

여기서 시험관 내 15일에 GABA A 수용체와 해마 뉴런을 포함하는 알파 2의 세포내이입은 알파 방갈로 독소를 보여줍니다. 패널에 나타난 바와 같이 개별 수지상 과정의 형광 측정은 GFP 항체를 통한 구조체 발현 수준으로 정규화됩니다. 시점의 염색 최종 비교는 T가 0 측정과 같은 정규화에 의해 이루어집니다.

시간 경과에 따른 형광 신호 변화로 인한 60분 동안의 수용체 내재화의 정량화는 단일 지수로 가장 잘 설명되었습니다. 대안적인 접근법은 실시간 이미징 타임 랩스 컨포칼 현미경을 통해 단일 뉴런에서 수용체 세포내이입(receptor endocytosis)을 추적하는 것입니다. P-H-G-F-P 태그가 지정된 GABA A 수용체 및 표면 알파 방갈로 독소 표지 수용체의 반점 및 중첩 형광은 시간이 지남에 따라 실험 시작 시 알파 방갈로 독소 표지 GABA A 수용체 신호가 수용체 내세포로 감소함에 따라 감소하는 것을 볼

새로운 수용체 삽입으로 인해 P-H-G-F-P 신호가 높게 유지되는 반면, P-H-G-F-P 신호의 최소 감소는 세포 표면 수용체 분포 변화와 이 절차에 따른 광표백에 기인합니다. 방갈로 독소 삽입 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 다양한 치료법으로 수용체 삽입 속도와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 세포 활동, 특정 단백질 영역, 작용제 및 기타 조절제가 살아있는 뉴런, 다른 세포 및 조직의 수용체 회전율을 어떻게 수정할 수 있는지 평가할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 알파 방갈로 독소 결합 Alexa 염료를 표준 면역형광 기술과 함께 사용하여 해마 뉴런의 표면 수용체 국소화를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.