January 2nd, 2014
표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.
이 절차는 형광 사진 활성화 국소화 현미경과 같은 원자력 현미경 및 초고해상도 현미경 검사에 사용하기 위해 바이러스가 포함된 유리 커버 슬립을 준비합니다. 먼저, 유리 기판을 청소하고 폴리 L 라이신에 접목된 부분적으로 비오틴화된 폴리에틸렌 글리콜의 박막으로 유리를 코팅합니다. 다음으로, 표면을 아바돈으로 처리하여 비오틴화 필름의 결합 친화도를 높입니다.
이제 관심 바이러스에 특이적인 비오틴화 항체로 표면을 처리하십시오. 그런 다음 항체 제조 표면을 관심있는 바이러스로 처리하십시오. 스핀 코팅과 달리 이 기술은 표면을 따라 변형을 균일하게 분포시키는 장점이 있습니다.
현미경 검사를 최적화하기 위해 적절한 크기의 테프론 커버 슬립 랙에 커버 슬립을 수직으로 놓고 여과된 에틸 알코올 초음파 처리로 채워진 비커에 30분 동안 담급니다. 그런 다음 초순수로 덮개가 미끄러지는 부분을 광범위하게 헹굽니다. 다음으로, 덮개를 별도의 깨끗한 테프론 랙에 넣고 1몰로 채워진 수산화나트륨 비커를 30분 동안 초음파 처리한 다음 초순수로 광범위하게 헹굽니다.
이제 헹궈진 덮개를 질소 흐름 아래로 미끄러져 건조시키고 깨끗하고 건조한 테프론 랙으로 옮깁니다. 각 커버 슬립이 눈에 보이는 필름이나 입자로 깨끗한지 확인하십시오. 질소 흐름에서 수평으로 건조시킨 직후, 커버 슬립 피펫 중앙에 있는 멸균 페트리 접시에 커버 슬립 슬립 하나를 PBS에 적절한 양의 비오틴화 폴리리신 그라프팅 폴리에틸렌 글리콜에 넣습니다.
샌드위치 방식으로 유체 위에 다른 깨끗한 덮개 슬립을 놓습니다. 두 커버 슬립의 활성 면 사이의 부피가 액체로 완전히 채워졌는지 확인하십시오. 페트리 접시를 덮고 실온에서 45-60분 동안 배양합니다.
다음으로, 여분의 액체를 꼬집지 않고 핀셋으로 샌드위치를 집습니다. 이제 엄지와 검지를 사용하여 샌드위치를 가볍고 수평으로 집습니다. 커버 슬립을 반대 방향으로 밀고 활성 면을 건드리지 않도록 분리합니다.
25ml의 초순수로 활성 얼굴을 모두 헹굽니다. 이제 질소 흐름으로 커버 슬립을 건조시키고 어떤 커버 슬립 면이 멸균 페트리 접시에 활성화되었는지 확인합니다. 활성 면이 위로 향하게 한 처리된 커버 슬립을 활성 면의 중앙에 적절한 양의 해동된 증거 용액으로 놓습니다.
활성 면이 아래로 향하도록 다른 커버 슬립을 놓고 액체를 끼운 다음 실온에서 25-30분 동안 배양합니다. 그런 다음 앞서 그림과 같이 두 개의 커버 슬립을 분리합니다. 활성 면을 만지지 마십시오.
이제 25ml의 초순수로 두 활성 얼굴을 모두 헹군 다음 질소 흐름으로 커버 슬립을 건조시킵니다. 어떤 커버 슬립 면이 활성화되어 있는지 기억하는 것이 중요합니다. 나중에 참조할 수 있도록 즉시 멸균 페트리 접시에 열렬한 처리된 커버 슬립 활성 페이스를 위로 향하게 놓고 활성 얼굴 중앙에 적절한 양의 해동 비오틴화 항체를 피펫으로 씌웁니다.
샌드위치 방식으로 활성 면이 아래로 향하도록 다른 커버 슬립을 유체 위에 놓습니다. 그런 다음 실온에서 45-60분 동안 배양합니다.두 개의 커버 슬립을 분리한 후 25ml의 PBS로 두 활성 면을 모두 헹굽니다. 그런 다음 멸균된 페트리 접시에 활성 면이 위로 향하게 하여 항체 처리된 커버 슬립을 놓고 활성 얼굴 중앙에 적절한 양의 바이러스를 피펫으로 넣습니다.
이제 두 번째 활성 덮개로 샌드위치를 만들고, 미끄러지고, 덮고, 배양하십시오. 이제 두 개의 커버 슬립을 분리하십시오. 25ml의 PBS로 두 활성 면을 모두 헹구고 PBS로 채워진 테프론 랙과 비커로 옮깁니다.
준비된 샘플을 즉시 사용하거나 최대 3일 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오. 여기. 수포성 구내염 바이러스의 야생형 변종을 유리 표면에 고정하고 원자력 현미경으로 분석했습니다. 비리온의 너비와 길이는 80나노미터 x 180나노미터로 비리온의 원래 크기에서 왜곡이 최소화됩니다.
이 실험에서 단일 비리온은 형광 광 활성화 국소화 현미경으로 이미지화되었습니다. Alexis 6 47 표지된 VSVG 항체 사용. 파란색 등면은 FOM 현미경을 사용하여 복구된 비리온의 표면을 보여줍니다.
이 비디오를 시청한 후에는 원자력 현미경 또는 초고해상도 현미경에 사용하기 위해 바이러스가 포함된 유리 커버 슬립을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 커버 슬립의 어느 면에 활성 화학 물질이 있는지 항상 기억하는 것이 중요합니다.
이 기사는 원자력 현미경(AFM) 및 초고해상도 형광 이미징에 사용하기 위해 바이러스가 있는 유리 커버 슬립을 준비하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 바이러스 구조의 고해상도 이미징을 용이하게 하는 바이러스의 제어된 부착을 보장합니다.
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.