펄프 공장 폐기물 흐름에서 미생물 성장을 촉진하는 방법 및 배양된 미생물의 생분해 잠재력 특성화

다음 실험의 전반적인 목표는 미생물 또는 미생물 컨소시엄이 성장을 위한 펄프 폐기물 흑액, 성장에 사용되는 흑액의 성분 및 이 펄프 폐기물의 미생물 대사에 의해 생성된 제품을 활용하는 능력을 결정하는 것입니다. 이는 펄프 폐기물인 흑액을 수집하여 배양 배지 성분으로 사용하기 위해 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 리그노셀룰로오스 성분을 추출하여 미생물의 탄소원 요구 사항을 결정하는 데 사용됩니다.

다음으로 흑액 및 그 성분에서 미생물이 자랄 수 있는 능력을 결정하기 위해 미생물 성장에 대해 배지를 준비, 접종 및 분석합니다. 결과는 최소 배지 한천 플레이트에서 시각화된 성장을 기반으로 미생물 환경 분리물과 GCMS에 의한 대사 산물의 성장 및 합성을 위한 유일한 탄소원으로 흑액을 활용하는 것을 보여줍니다. 우리는 미생물이 펄프 폐기물에서 자랄 수 있는 가능성과 펄프 공장에서 이러한 미생물을 직접 분리할 수 있을 가능성에 대해 논의할 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

수산화나트륨 표백과 같은 기존 방법에 비해 오늘날 지그날 셀로스 추출 기술의 주요 장점은 염화나트륨 표백이 높고 순도가 높아진다는 것입니다. 이 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. Theo 셀룰로오스 및 GCMS 샘플 전처리 단계는 배우기 어려우며, 이는 필요한 단계 수와 공정 완료를 확인하는 데 필요한 시각적 결정 때문입니다.

이 방법은 흑액의 미생물 분해에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 농작물 잔류물, 산림 잔류물 및 도시 고형 폐기물과 같은 마그노 셀룰로오스 물질을 포함하는 산업 폐기물 흐름에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 크래프트 소화조에 부착된 배출 밸브와 멸균 유리병에서 흑주 샘플을 채취하고 실온으로 식힌 후 다음 단계로 진행합니다. 그런 다음 교반 막대가 장착된 500ml 비커에 100ml의 흑액 샘플을 넣고 중간 속도로 샘플을 저어줍니다.

흑액은 인산이 점성이 될 때까지 적가적으로 첨가하여 중화합니다. 이 분취 후 모든 흑색 주류 용액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 넣고 샘플을 9, 300 Gs에서 30 분 동안 원심 분리하십시오. 탄수화물을 분리하려면 1mm 이하의 분쇄된 스위치그래스 5g과 교반 막대를 500ml 플라스크에 넣습니다.

그런 다음 증류수 200ml, 아염소산나트륨 7.5g, 빙초산 2.5ml를 추가합니다. 섭씨 80도의 교반 플레이트 위에 놓인 오일 수조에 플라스크를 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 플라스크에 염화나트륨 7.5g과 빙초산 2.5ml를 추가로 추가합니다.

이전 단계를 두 번 반복한 후 섭씨 80도에서 30분 동안 계속 저어줍니다. 용액을 실온으로 식히십시오. 그런 다음 진공 상태에서 buchner 깔때기를 통해 필터링하여 고체 물질을 분리합니다.

증류수 100ml로 고체 물질을 세 번 씻습니다. 다음으로, 고체 물질 1g을 모아 깨끗한 여과지 위에 놓습니다. 고체를 섭씨 50도에 놓고 밤새 건조시킵니다.

다음 날 오븐에서 샘플을 꺼낸 후 Hollow Cell이라고 표시된 보관 바이알로 옮깁니다. 250ml의 10% 수산화나트륨이 들어 있는 500ml 플라스크에 나머지 고체 물질을 넣고 플라스크에 마개를 씌웁니다. 용액을 섭씨 70도의 인큐베이터에 넣고 250RPM으로 흔들면서 1시간 동안 놓습니다.

그런 다음 용액을 실온으로 냉각시키고 30분 후 buchner 깔때기를 사용하여 진공 여과를 통해 고체 물질을 분리합니다. 고체 잔여물을 섭씨 50도의 오븐에서 밤새 건조시킨 후 셀룰로오스라고 표시된 보관 바이알에 넣습니다. 여과액을 500ml 플라스크에 옮기고 30ml의 아세트산과 250ml의 이소프로필 알코올 캡을 넣고 생성된 용액을 실온에서 최소 8시간 동안 벤치탑에 놓습니다.

완료되면 모든 용액을 50ml 원추형 튜브로 옮기고 9, 300G에서 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 원심분리 후 원뿔형 튜브에서 용액을 조심스럽게 피펫으로 빼내고 폐기합니다. 다음으로, 볼텍싱과 원심분리기로 30ml의 증류수로 펠릿을 9, 300Gs에서 30분 동안 세척합니다.

이 단계를 15회 반복하여 펠릿을 철저히 세척하십시오. 원심분리 후, 동결 건조를 위해 펠릿을 분리하기 위해 상등액을 제거합니다. 샘플이 동결 건조되면 hemi cellulose라고 표시된 바이알에 넣습니다.

리그닌 분리를 위해 1mm 이하의 분쇄된 스위치그래스 5g을 포인트 25몰 수산화나트륨과 30%에탄올의 500ml 용액에 추가합니다. 슬러리를 섭씨 75도의 인큐베이터에 넣고 250RPM으로 2시간 동안 흔듭니다. 시원한 용액을 여과한 후 플라스크에 교반 막대를 추가하고 중간 속도로 조정된 교반 플레이트 위에 놓습니다.

2의 pH가 얻어질 때까지 진한 염산을 여과액에 적가합니다. 용액을 실온에서 밤새 그대로 두십시오. 용액이 50ml 원뿔형 튜브로 옮겨지면 9, 300GS에서 30분 동안 샘플을 원심분리합니다.

완료되면 원뿔형 튜브에서 용액을 조심스럽게 피펫으로 꺼내 버립니다. 볼텍싱과 원심분리기로 30ml의 증류수로 펠릿을 9, 300Gs에서 30분 동안 세척합니다. 이 단계를 15회 반복하여 펠릿을 철저히 세척하십시오.

원심분리 후, 동결 건조를 위해 펠릿을 분리하기 위해 앙와위 natant를 제거합니다. 동결 건조가 완료되면 샘플을 리그닌이라고 표시된 바이알에 넣습니다. 멸균 125ml 플라스크에 50ml의 멸균 M nine 최소 매체를 추가합니다.

그런 다음 검은 액체의 10 % 부피를 미디어에 첨가하십시오. 접종을 위해 혼합물에 하룻밤 동안 박테리아 배양액의 0.1 % 부피를 첨가하고 200 RPM으로 진탕하면서 인큐베이터에서 섭씨 37 도의 배양액을 배양합니다. 중간 로그 단계에서는 UN 접종 및 접종된 박테리아 배양액을 원심분리한 후 주사기를 사용하여 밀봉된 멸균 혐기성 혈청 병으로 박테리아를 옮깁니다.

450시간 동안 성장한 후 각 상등액 10ml를 별도의 유리 시험관에 넣습니다. 진한 염산을 pH 1-2로 적가하여 각 상등액을 산성화합니다. 각 샘플에 대해 30ml의 에틸 아세테이트를 supra natant에 추가합니다.

시험관을 닫은 후 튜브를 4-6회 뒤집어 용액을 혼합합니다. 그런 다음 깨끗한 유리 시험관에 무수 황산나트륨 1-2g을 넣습니다. 일회용 유리 목초지 피펫으로 피펫팅하여 상단 유기 층을 조심스럽게 수집합니다.

무수 황산나트륨이 들어 있는 시험관에 유기층을 놓습니다. 무수 황산나트륨 위의 유기층을 시험관을 부드럽게 두드려 서서히 혼합하여 탈수합니다. 소량의 무수 황산나트륨을 넣고 큰 덩어리가 없을 때까지 섞습니다.

그런 다음 진공 상태에서 buchner 깔때기를 통해 용액을 여과한 다음 용액을 증발 플라스크로 옮기고 회전 증발기를 사용하여 여과액을 증발시킵니다. 완료되면 3mg의 에틸 아세테이트 추출 잔류물을 2mL 호박색 크로마토그래피 바이알에 넣습니다. 100 마이크로 리터의 4 개의 다이옥산과 10 마이크로 리터의 피리딘으로 잔류 물을 용해시킵니다.

그런 다음 50%트리메틸 염소가 함유된 B-S-T-F-A 용액 1마이크로리터를 바이알에 추가합니다. 용액을 섭씨 60도의 인큐베이터에 넣고 15분 동안 흔듭니다. GCMS로 샘플을 분석합니다.

공예 펄프 화 공정에서 생성 된 흑액의 수집 및 변형은이 펄프 화 폐기물을 사용하여 단일 박테리아 분리 또는 혼합 배양의 생분해 능력을 결정하는 것입니다. 여기에 표시된 것은 LB 배지와 10% 중화된 흑색액이 보충된 LB 배지에서 배양된 환경 균주의 광학 밀도로 측정된 호기성 성장입니다. 이러한 결과는 이 박테리아가 흑색 주류의 존재 하에서 자란다는 것을 나타냅니다.

LB 매체에서 환경 분리물의 성장은 흑액이 있는 상태에서 성장할 때보다 빠르지만 광학 밀도는 62시간 후에 감소하기 시작합니다. 흑색 액체의 존재 하에서 미생물 환경 분리 물의 성장은 230 시간의 성장 후까지 광학 밀도가 계속 증가합니다. 흑액의 존재 하에서 미생물 환경 분리물의 성장 곡선은 또한 이위상 성장을 나타내는데, 이는 흑액이 미생물 환경 분리물에 의해 사용될 수 있는 하나 이상의 탄소원을 포함하고 있으며 박테리아가 나타내는 영양소 이용의 선호가 있음을 시사합니다.

성장 요구 사항에 흑액을 사용하는 능력을 결정하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다. 또한 중화되지 않은 흑액에서 박테리아의 성장을 결정하거나 흑액의 농도 증가가 성장에 미치는 영향을 결정할 수도 있습니다. 흑액에 대한 성장을 입증한 후 최소한의 배지 성장 실험을 사용하여 탄소원 활용도를 결정할 수 있습니다.

리그노셀룰로오스의 구성 요소를 구성하는 상업용 기질은 최소 매체에서 탄소원으로 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 리그노셀룰로오스 추출 프로토콜은 그림과 같은 박테리아의 성장 요구 사항을 결정하기 위한 모델을 제공합니다. 다음은 M nine에서 환경 미생물 분리물의 성장입니다. 리그노셀룰로오스 추출의 각 성분으로 보충된 최소 배지 한천.

최소 배지 한천 플레이트에 콜로니가 존재한다는 것은 M nine에 존재하는 홀로 셀룰로오스, 셀룰로오스, 헤미 셀룰로오스 및 리그닌 콜로니를 분해하는 환경 분리물의 능력을 나타냅니다. 최소한의 매체는 환경 분리물이 플레이트 대신 한천을 분해하는 능력을 암시 할 수 있습니다. 액체 배양에 대한 최소 배지 성장 곡선을 사용하여 각 리그노셀룰로오스 분획의 특정 성장률을 결정하여 잠재적인 탄소원이 될 수 있는 한천을 추가할 필요가

GCMS에 의한 추출 및 유도체 눈, 박테리아 배양을 분석하면 생성된 대사 산물을 알 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 접종되지 않은 샘플에 존재하는 TMS 유도체의 GCMS 스펙트럼, 혐기성으로 성장할 때 환경 미생물 분리물에 의해 생성된 TMS 유도체의 스펙트럼 및 M nine, 10%non neutralized black liquor가 포함된 최소 배지가 여기에 그려져 있습니다. 두 스펙트럼을 비교하면 배지에 존재하는 성분의 차이가 드러나며, 이는 발효 산물의 존재와 흑액 성분의 분해를 시사합니다.

머무름 시간이 39.34분인 피크가 접종된 샘플에서 나타났습니다. 21포인트 84분의 머무름 시간을 갖는 피크는 접종된 샘플에서 증가했다. 포집시간이 25.79인 피크는 접종된 샘플에서 감소했습니다.

여기에 표시된 스펙트럼은 25.79분의 머무름 시간으로 피크를 식별하는 데 사용된 guac 표준물질의 스펙트럼입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미생물 또는 미생물 컨소시엄이 흑액을 분해할 수 있는지 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 이 프로토콜에 따라 성장 곡선과 같은 다른 방법을 사용하여 다양한 농도의 흑액 또는 리곤 셀룰로오스 추출물 성분에 대한 미생물 또는 미생물의 성장 속도에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.