Name: 의 조직 화학 염색 애기 장대 차 전지 벽 요소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 Arabidopsis 이차 세포벽 성분을 시각화하는 조직화학 염색법을 통해 식물 줄기의 조직 변화를 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포벽 구성 연구에 필수적입니다.

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우리는 편집에 도움 세이빈 러셀에 감사드립니다. 이 작품은 (http://www.jbei.org) 미국 에너지 부, 과학, 생물 환경 연구의 사무실, 사무실에서 지원하는 DOE BioEnergy 공동 연구소의 일부였다 로렌스 버클리 사이의 계약 DE-AC02-05CH11231 통해 국립 연구소와 미국 에너지 부.

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저자는 공개할 재정적 갈등이 없습니다.

A. thaliana의 줄기 부분 널리 이차 세포벽의 세포 조직을 연구하고 질적 야생형 및 트랜스 제닉 식물의 차이를 조사하기 위해 사용된다. 표본을 절편 일반적으로 사용되는 기술은 직접 손으로 절단하다; 표본이 아가로 오스 또는 정착에 포함 된 경우 나, 절편은 vibratome 또는 마이크로톰을 수행 할 수 있습니다. 한편 절단 달리, 마지막 두 단순히 샘플 및 요철 표면 사이의 두께 차이로 인한 잘못된 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 차이 부정확 제조 위험을 줄일 수있다. 이러한 방법들은 모두 장단점이 있습니다. 우리는 vibratome를 사용 구획 한 후, 아가 로스에 매립 선택하고, 다음과 같은 이유로 이렇게했다 : 신선한 조직의 정교한 처리의 필요성을 없애 매립 용이성과 시간을 사용하여 아가 로스에 보냈다. 또한, 직접 만든 금형 만들기 쉽고 저렴, 일을 보유 할 수전자 똑바로 줄기, 몇 년 동안 사용할 수 있으며, 혼잡하지 않고 표본을 쉽게 방출하는 데 도움이 될 수 있습니다. 높은 비율의 아...

식물 세포의 벽은 다양한 구성 요소 내에서 정보의 과다 보유 : 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 (크 실란, glucuronoxylan, 크 실로 글루칸, 아라비, 혼합 결합 글루칸, 또는 글루코), 펙틴을. 조직 학적 기술 조직 및 세포 수준에서 보조 세포 벽 내의 차이를 연구하는 중요한 시각적 단서를 제공한다. 다양한 조직 학적 방법이 개발되었고, 문헌에서 발견 될 수 있지만, 단순한 시각적 지시 매우 상세한 프로토콜이 드물게 이제까지 가능한 경우 없기 때문에 이러한 기술은 어렵고 시간 소모적 초보자 수있다. 본 연구의 목적은 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 조직 학적 염색 기법에 대한 간단한 지침을 제공하는 것이다. 줄기 조직을 구획하는 셀 벽 및 셀의 셰이프 시각화하는 첫 번째 단계이다. 손으로 자른 부분이 저렴하고 준비하는 시간을 줄이고 있지만, vibratome의 사용은 일관성을 제공하며,고품질 이미지를 산출한다. vibratome를 사용하여 선명한 이미지를 생성하는 데 도움이 상당히 간단 나쁜 시료 준비에 의해 야기 될 샘플 간의 부정확 차이 제조 위험을 줄여 동일한 두께, 심지어 섹션을 생성함으로써 더 나은 데이터 품질을 생산한다. 신선한 표본을 해결하기 위해 수지를 사용하여 초보자를위한 도전이 될 수 있으며, 분석을 신속하게 수행 할 필요가있는 경우에도 여전히 전문가를위한 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 또,이 수지에 포함되었을 때 샘플로 생물학적 활성을 측정하는 것이 불가능해진다. 아가 로스 및 제 금형을 채용 한 간단한 기술은 줄기 조직을 매립 명이이며 또한 부드러운 조직의 절개가 필요한 다른 애플리케이션에 이용 될 수있다. 수지 시험편을 매립에 비해,이 방법은 살아있는 조직을 유지하는 샘플 조작을 감소시키는 이점을 갖는다. vibratome를 통해 조직을 단면은 고정밀 및 homogen를 생성연구의 목적에 따라, 다음 여러 다른 염색 기술과 함께 사용될 수 있으며, OU를 섹션. 리그닌과 다른 방향족 화합물을 시각화하는 가장 간단한 방법은 자외선 (UV) 빛을 사용합니다. UV 빛에 의해 방향족 기반 분자의 여기 오래된 기술이지만, 그것은 여전히​​ 리그닌의 시각화를위한 가장 빠른 방법 중 하나입니다. UV 빛은 다른 방향족 화합물을 자극하기 때문에 그러나, UV 시각화 실제로 리그닌 탐지에 적합하지 않습니다. 1-3 : 리그닌은 주로 세 가지 빌딩 블록, monolignols (coniferyl 알코올, sinapyl 알코올, 및 p-coumaryl 알코올 hydroxycinnamyl 알코올)로 구성되어 있습니다. 플로로 글 루시놀 얼룩 통, 섬유 및 기관의 조직 4에 존재 cinnamaldehydes의 범위에 단서를 제공 할 수 있습니다. 플로로 글 루시놀 일반 cinnamaldehydes의 좋은 지표이며 cinnamaldehydes 및 기타 방향족 화합물을 구별 할 수 있습니다. sinapyl 알코올 단량체를 검출 할 수있다및 마 울레 얼룩의 사용으로 차별화. 톨루이딘 블루 O는 다색 염료이며, 따라서 다른 색 5,6에 칸막이 벽의 다른 요소를 더럽힐 수있는 능력을 갖는다. 톨루이딘 블루 O의 주된 용도는 펙틴 및 리그닌 5,6를 검출하는 것이다. 톨루이딘 블루 O를 사용하는 장점은 세포벽의 많은 요소가 단일 단계로 시각화 할 수 있다는 것이다. 흰색 calcofluor 및 콩고 레드 모두 함께 작동하기 쉽고 셀룰로오스를 시각화 할 수있다. Calcofluor 흰색 얼룩 셀룰로오스, callose 및 기타 비 치환 또는 약하게 치환 된 β-글루칸 6-9, 콩고 붉은 얼룩은 직접 특히 10,11-β (1 → 4) - 글루칸과 셀룰로오스 할 수있는 반면. 본 연구의 목표는 A.에서 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 상기 염색 기법의 사용을 위해 단순한 지침을 제공하는 것이다 장대 줄기.

<table><tbody><tr><td>아가로 스</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS 번호 : 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5- 트리 하이드 록시 벤젠 [CAS 번호 : 108-73-6]</td></tr> <tr><td>염산</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS 번호 : 7647-01-0</td></tr><tr><td>수산화 암모늄</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS 번호 : 1336-21-6</td></tr><tr><td>툴리딘 블루 O</td><td>시그마</td><td>T3260</td><td>블루틴 클로라이드, 톨로늄 클로라이드 [CAS 번호 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>과망간산 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>223468</td><td>CAS 번호 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올 190 증명</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS 번호: 64-17-5</td></tr><tr><td>콩고 레드</td><td>시그마&nbsp;</td><td>C6277</td><td>디소듐 3,3'-[[1,1'-비페닐]-4,4'-디일비스(아조)]비스(4-아미노나프탈렌 1-설포네이트) [CAS 번호 573-58-0]</td></tr><tr><td>형광 증백제 28/ Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>4,4'- 비스 [[4- [비스 (2- 하이드 록시 에틸) 아미노] -6- 아닐리 노 -1,3,5- 트리아진 -2- 일] 아미노] 스틸벤 -2,2'- 디 술폰산 [CAS 번호 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica 진동 칼날 마이크로톰 VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety 면도기 회사</td><td>품목 # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>스테인레스 스틸 더블 에지 블레이드 (Personna Super)</td></tr><tr><td>스크류 캡 마이크로 원심분리기 튜브 (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (0.6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>미트</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; 핫 핸드 프로텍터 미트</td></tr><tr><td>티슈 접착제</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Store at 4 &deg; C 또는 20 &deg; C 3개월 이상 보관용</td></tr><tr><td>전자레인지</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 인스턴트 티슈 접착제&nbsp;</td></tr><tr><td>기계식 셔터가 없는 CCD 칩이 있는 카메라&nbsp;</td><td>하마마츠</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>고속 컬러 카메라&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Q이미징</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>카메라 소프트웨어&nbsp;</td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph 버전 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Imagining anaylsis&nbsp;</td><td>어도비&nbsp;</td><td>포토샵 CS4</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경, 사각형, No. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-커버 안경은 부식에 강하고 균일하게 두껍고 평평합니다. 1 번 두께는 0.13-0.17 mm입니다.</td></tr><tr><td>프로스트 마이크로 슬라이드, 1mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25mm - 1mm</td></tr><tr><td>파라필름 M</td><td>알칸 패키징</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 필터 큐브</td><td>라이카</td><td>11513851/11513885</td><td>560/40 대역 통과로 콩고 적색 분석에 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana는 식물의 다양한 세포 과정을 이해하고 조작하는 데 일반적으로 사용되는 모델 유기체이며 2차 세포벽 형성 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 2차 세포벽 증착은 1차 세포벽이 놓인 후에 발생하며, 이 과정은 혈관 및 섬유 조직을 형성하는 세포와 같은 특수 세포에 의해 독점적으로 수행됩니다. 대부분의 2차 세포벽은 셀룰로오스(40-50%), 헤미셀룰로오스(25-30%), 리그닌(20-30%)으로 구성되어 있습니다. 2차 세포벽 생합성에 영향을 미치는 여러 돌연변이가 분리되었으며, 해당 돌연변이는 보상 반응에 의해 가려질 수 있기 때문에 해당 돌연변이는 명백한 생화학적 조성 변화 또는 시각적 표현형을 나타내거나 나타내지 않을 수 있습니다. 염색 절차는 역사적으로 세포 기반의 차이를 보여주기 위해 사용되어 왔습니다. 이러한 방법은 전적으로 시각적 분석 수단입니다. 그럼에도 불구하고 신속하고 비판적인 분석에서 이들의 역할은 매우 중요합니다. 콩고 레드(Congo red)와 칼코플루오르 화이트(calcofluor white)는 다당류를 검출하는 데 사용되는 염색이며, 말레(Mäule)와 플로로글루시놀(phloroglucinol)은 리그닌(lignin)의 차이를 확인하는 데 일반적으로 사용되며, 톨루이딘 블루 O(toluidine blue O)는 다당류와 리그닌을 구별하여 염색하는 데 사용됩니다. 겉보기에는 간단해 보이는 절편, 염색 및 이미징 기술은 초보자에게는 어려울 수 있습니다. 이 연구는 A. thaliana 모델을 사용한 시료 전처리를 시작으로 식물의 2차 세포벽에서 세포 및 조직 조직을 관찰하기 위해 쉽게 구현할 수 있는 다양한 염색 방법론의 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

임베딩 및 단면 줄기 : 포함 할 만든 플라스틱 금형의 사용은 아가로 오스 빠르고 쉽게 (그림 1) 입증 7 %에서 유래한다. 두 부분 (A와 B, 그림 1) 내장 된 유리 병 시스템은 간단한 쉽게 청소 시스템을 유지, 아가로 오스는 불활성 유리 병 부분에 충실하지 않는 한 아가로 오스에 포함 된 줄기를 해제 할 수 있습니다. 작은 유리 병 몇 년 동안 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 임베디드 줄기를 저장하는 편의는 다음 단계가 쉬워집니다. 언젠가 임베디드 비슷한을 저장하기 위해 줄기는 단면 처리에 대해 하나의 단면 판에 (최대 3 개) 그룹화 할 수 있습니다. UV에서 방향족의 관측 : 줄기 부분은 유리 슬라이드에 증류수에 장착 UV 빛으로 관찰되었다. 세포에있는 리그닌을 포함하는 방향족 화합물은, UV 빛에서 자신의 형광도에 의해 시각하실 수 있습니다. 통 (XY)와 interfasci...

식물 세포벽 구성은 조직 유형에 따라 다르며 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 펙틴을 포함할 수 있습니다. 세포 유형 수준에서 차이를 시각화하기 위해 다양한 염색 기술이 개발되었습니다. 이 논문은 일반적으로 사용되는 세포벽 염색 기술을 편집한 것입니다.

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

이 실험 절차의 전체적인 목적은 Arabidopsis ANA 이차 세포벽 요소의 조직화학적 염색을 보여주는 것입니다. 먼저 식물 줄기를 aros에 매립하여 수행합니다. 그 후 aros에 매립된 줄기를 탈형하여 시편 디스크로 옮긴 다음, vibrato를 사용하여 줄기 횡단면으로 절편을 만듭니다.다음으로, 절편들을 다양한 조직 화학 염색 과정에 처합니다. 최종적으로, 현미경을 사용하여 조직 화학 염색을 통해 얻은 2차 세포벽 요소들의 차등적인 변화를 관찰합니다. 이 방법은 식물 줄기의 반점 조직 변화와 같이 세포벽의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 본 프로토콜에 언급된 간단하지만 중요한 단계들이 이전에 철저히 기록되지 않았거나 단순한 방식으로 제시되지 않았기 때문입니다. 우선, 플라스틱 바이알을 사용하여 줄기 매립을 위한 수제 몰드를 준비하십시오. 먼저, 면도날을 사용하여 2 mL 스크류 캡 마이크로 원심분리 튜브의 원추형 바닥 부분을 잘라냅니다.이 구성 요소는 주사 바늘 구멍이 있는 부분 A로 지칭하며, 튜브 캡의 구멍은 삽입될 줄기(stem)의 직경보다 약간 더 크게 뚫려 있습니다. 다음으로, 0.6 mL 마이크로 원심분리 튜브의 바닥 부분을 0.5 cm 길이로 자릅니다. 이 구성 요소는 부분 B로 지칭됩니다. 잘라낸 0.5 cm 길이의 0.6 mL 마이크로 원심분리 튜브 조각을 미리 뚫어놓은 2 mL 마이크로 원심분리 튜브 안에 넣습니다.파라폼(paraform)을 사용하여 두 부분을 밀봉합니다. 면도날을 사용하여 관심 영역에서 줄기 단면을 절단하고, 7% aros 용액을 전자레인지의 낮은 강도로 가열하여 녹입니다. 녹은 aros가 약 50 °C로 식으면, 미리 제작된 플라스틱 몰드에 agros 5 mL를 천천히 피펫으로 옮겨 바이알을 채웁니다.에어로졸이 30~60초 동안 식어 반고체 상태가 되면, 줄기(stem)를 에어로졸이 채워진 바이알에 넣습니다. 그런 다음 줄기의 끝부분이 캡에 의해 고정되도록 타공 캡을 씌웁니다. 바이알을 실온 또는 4°C에서 10~30분 동안 굳을 때까지 둡니다.튜브에서 몰드를 조심스럽게 밀어내어 제거합니다. 파라필름을 열고 몰드 B부분의 바닥을 엄지손가락으로 살며시 밀어, 응고된 aros를 A부분에서 유리 슬라이드 위로 떨어뜨립니다. 슬라이드 절편 제작을 수행합니다.에어로스에 삽입된 줄

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 특수 식물 세포에 존재하는 리그닌을 염색하기 위한 Wiesner 염색 기술에 대해 설명합니다. 이 염색 기술은 애기장대 탈리아나 줄기에서 리그화된 세포벽을 시각화하는 데 도움이 되며 다양한 유형의 세포 세포벽에서 리그니화를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

리그닌 시각화를 위한 Wiesner 염색: 애기장대 탈리아나의 줄기에 존재하는 리그닌 침전물을 염색하는 기술

이 비디오에서는 특수 식물 세포에 존재하는 시린질 리그닌을 염색하기 위한 Maule 염색 기술에 대해 설명합니다. 이 염색 기술은 물관부 및 근막간 섬유의 리그닌 분포를 특성화하는 데 도움이 됩니다.

리그닌을 위한 Maule 염색: 애기장대 탈리아나 줄기 절편에서 리그닌 분포를 특성화하는 기술

이 비디오에서는 애기장대 탈리아나 줄기 절편에서 셀룰로오스 침전물을 시각화하는 콩고 적색 염색 방법을 보여줍니다.

콩고 레드 염색: 식물 줄기 절편에서 셀룰로오스 침전물을 시각화하는 기술

이 비디오에서는 쌍떡잎식물 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 세포벽 내 셀룰로오스 침착을 시각화하는 염색 절차를 설명하며, 이는 β 결합 글루칸에 특이적으로 결합하여 자외선 아래에서 형광을 나타냅니다.

Calcofluor White staining: 쌍떡잎식물 줄기 절편의 세포벽에 있는 셀룰로오스 침전물의 UV 유도 형광 시각화를 위한 간단한 방법

이 동영상은 식물 조직에서 아라비노갈락탄 단백질(AGP)과 펙틴을 국소화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 고정 및 수지 포매 식물 조직 절편은 AGP 및 펙틴 특이적 1차 및 형광 2차 항체와 셀룰로오스 결합 형광 염료로 염색되어 세포벽에서 조직 특이적 공동 국소화를 나타냅니다.

식물 조직에서 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역 국소화

우리는 면역 염색, 형광 제자리 교잡, 전체 마운트 애기 장대 난자의 양적, 고해상도 이미징 다음 DNA 염색 여기를 효율적이고 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 성공적 염색질 변형 및 핵 구조를 분석하는데 사용 하였다.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

이 프로토콜의 목표는 애기장 대의 아래 부분의 다른 사이트에 cfda를 로드 하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 그런 다음 촬영에 CF의 결과 분포 패턴을 제시 합니다.

애기 장 대의 바닥 싱크대 조직에 로드 Cfda 추적자의 총격전 운동

이 프로토콜은 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역지역화를 위한 식물 물질이 어떻게 고정되는지, 친수성 아크릴 수지에 내장되어, 단면화및 유리 슬라이드에 장착되는지 자세히 설명합니다. 우리는 세포벽 관련 전형이 특정 항체로 검출될 것임을 보여준다.

식물 조직의 세포 벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화

본 프로토콜은 플라스모디오포라 브라시카에 의해 유도된 담즙의 조직학적 관찰을 위한 최적화된 방법을 기술한다. 배축의 Vibratome 섹션은 질병 진행 동안 전사 인자와 식물 호르몬의 관여를 연구하기 위해 형광 이미징 전에 제거됩니다. 이 프로토콜은 수지 임베딩 한계를 극복하여 형광 단백질의 플란타 시각화를 가능하게 합니다.

Plasmodiophora brassicae에 대한 유전자 발현 및 생리적 반응의 변화를 시각화하기 위해 투명화와 형광 현미경을 결합

이 프로토콜은 Arabidopsis thaliana 종자에서 배유 세포층의 온전한 샘플을 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주사 바늘 및 정밀 겸자와 같은 일반적인 실험실 장비만 필요하며 개발 중인 종자와 성숙한 종자 모두에서 배유 세포의 고해상도 형광 라이브 셀 이미징을 가능하게 합니다.

Preparation of intact tissue for microscopic analysis of the endosperm cell layer in Developing and mature Arabidopsis seeds(개발 및 성숙한 애기장대 종자에서 배유 세포층의 현미경 분석을 위한 온전한 조직의 준비)

학습하세요 Arabidopsis 이차 세포벽 성분을 시각화하는 조직화학 염색법을 통해 식물 줄기의 조직 변화를 분석하는 방법을 배우세요. 이 기술은 세포벽 구성 연구에 필수적입니다.

의 조직 화학 염색

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