영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

다음 실험의 전반적인 목표는 조직 절편 제작 없이 형광 표지된 온전한 생물학적 시료를 이미징하는 것입니다. 이는 고정된 조직을 유기 용매에 순차적으로 배양하여 완전한 투명도가 달성될 때까지 처리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로.

투명해진 조직을 레이저 스캔 현미경을 사용하여 3D로 촬영합니다. 다음으로, 촬영 결과를 분석하여 수집된 3D 이미지로부터 절단되지 않은 척수와 뇌의 신경 구조를 3D로 재구성할 수 있습니다. 이 방법은 전체 뇌와 척수에서 신경 및 GAL 연결을 매핑하는 방법에 관한 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이제 신경계 전체의 신경 무결성을 시각화할 수 있게 됨에 따라, 이 기술의 응용 가능성은 신경퇴행성 질환의 치료로 확장됩니다. 이 방법은 신경계의 구조적 조직에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 폐나 종양 조직과 같은 다른 장기에도 적용될 수 있습니다. 숙련된 후에는 척수나 폐와 같은 작은 장기의 경우 단 몇 시간만 소요되며, 뇌의 경우 약 1~2일이 소요됩니다. 채취한 조직당 유리 바이알 하나에 갓 조제한 50% THF 2~3 mL를 첨가하여 절차를 시작하십시오.

그 다음 고정된 장기를 투명화 용액으로 옮기고 바이알을 단단히 닫습니다. 바이알을 로테이터에 올리고 알루미늄 호일로 덮은 후, 30 RPM의 일정한 속도로 적절한 시간 동안 샘플을 교반합니다. 그런 다음 투명화 용액을 제거하고, 새로운 PE 또는 피펫을 사용하여 조직을 다음 용액에 현탁합니다.

최종 투명화 단계의 표에 명시된 대로, 다광자 또는 공초점 현미경 관찰을 위해 샘플이 완전히 투명해질 때까지 용액에 보관하십시오. 완전히 투명해지면 즉시 이미징 슬라이드에 샘플을 마운트하십시오. 치과용 시멘트를 사용하여 조직 주변에 테두리를 만드십시오.

치과용 시멘트가 완전히 굳기 직전에 풀을 최종 투명화 용액으로 채운 다음, 즉시 투명화된 시료를 풀의 중앙에 배치하고 커버 글라스로 덮습니다. 완전한 투명화가 이루어져 광시트 현미경 관찰을 위한 마운팅이 완료되는 즉시, 커버 글라스가 치과용 시멘트에 의해 완전히 밀봉되고 투명화된 장기의 표면에 닿을 때까지 누른 후, 시료 홀더의 나사를 수동으로 돌려 시료를 고정합니다. 다음으로, 영상화할 조직에 적합한 최종 투명화 용액이 채워진 광시트 현미경의 이미징 챔버에 시료를 담급니다.

그런 다음 현미경이 제공할 수 있는 최상의 해상도로 투명화된 조직 전체를 포함하는 Z 스캔을 수집하며, 관심 영역은 확대하여 더 높은 해상도의 이미지를 수집합니다. 이미지 수집 후, resolve RT 모듈이 포함된 Amira 소프트웨어에서 이미지 시리즈를 불러옵니다. 시리즈가 로드되면 이미지 판독 파라미터 창에 정확한 복셀 크기를 입력하고 확인을 클릭합니다.

다음으로, 다평면 재구성(multiplanar view) 서브 애플리케이션을 선택하십시오. 그런 다음 primary 및 thickness 슬라이더를 사용하여 최적의 투영 두께와 회색조 값의 임계값을 선택하십시오. 마지막으로, crop corner 모듈을 사용하여 다양한 3D 방향으로 단면을 탐색하십시오.

시료를 시각화하기 위해, 뉴런의 구조적 조직을 매핑하는 것은 건강한 상태와 질병 상태에서 뉴런이 어떻게 기능하는지 이해하는 데 매우 중요합니다. 세 가지 디스크는 다양한 장기에 적용될 수 있으며, 특히 척수와 뇌의 긴 뉴런 연결을 추적하는 데 유용합니다. 예를 들어, 투명화된 대형 척수 분절의 초고해상도 현미경 스캔을 통해, 이 이미지들에 나타난 바와 같이 설치류 척수에서 수 센티미터에 걸쳐 축삭 연결을 추적할 수 있습니다.

이와 유사한 방식으로, 투명화된 마우스 뇌 전체와 해마를 이미징하여 뇌 내의 신경 연결을 추적할 수 있습니다. 공초점 현미경이나 다광자 현미경을 사용하면, 특히 Z축 방향으로 이미징 해상도를 상당히 높일 수 있습니다. 예를 들어, GFPM 라인 마우스의 투명화된 척수를 다광자 이미징하면 1.5에서 2mm에 이르는 척수 전체 깊이에서 끊김 없는 이미지를 얻을 수 있습니다.

투명화된 척수에 대한 공초점 현미경 관찰은 유사한 방식으로 개선된 해상도를 제공합니다. 투명화된 뇌의 다광자 현미경 이미징은 수상돌기 가시를 포함한 신경 구조의 미세한 세부 사항을 시각화할 수 있는 매우 높은 해상도의 이미지를 제공합니다. three disco 샘플은 다양한 방법으로 표지할 수 있습니다.

예를 들어, 렉틴이 결합된 형광 추적자를 사용하여 뇌와 척수의 전체 혈관계를 표지할 수 있으며, 이는 정상 및 질환 상태의 혈뇌장벽을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 세 가지 disco smaller cells 기법을 사용하면 거대 조직 내의 세포들도 영상화할 수 있습니다. 예를 들어, 미세아교세포와 성상교세포 모두 알츠하이머병 및 외상성 손상을 포함한 신경퇴행성 질환의 병리에 깊이 관여되어 있습니다.

3개의 디스코(disco)를 사용하여 척수 내의 밀도와 분포를 연구할 수 있습니다. 신경 세포가 아닌 조직 또한 이미징이 가능합니다. 예를 들어, 설치류 폐 전체의 Clara 세포를 항체로 면역 표지하여 절단 없이 단일 세포 수준에서 이미징할 수 있습니다.

마찬가지로, 비정상 췌장 조직에서도 세포를 투명화하고 이미징하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 이 췌장 이미지들에서는 투명화 후 형광 표지된 alpha 세포를 이미징하였습니다. 투명화 및 이미징 단계는 간단하지만 데이터 분석은 복잡할 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 중요합니다.

이 절차를 적용할 때, 투명화 용액 내에서 형광 신호가 시간이 지남에 따라 감소하므로 완전한 투명도가 달성되는 즉시 투명화된 조직을 이미징하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발은 뇌의 신경망 매핑과 같이 온전한 장기의 세부 사항을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 전체 장기의 세포 및 세포 하부 구조를 투명화하고 이미징하며, 이를 시각화하고 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.