2014년 7월 7일
큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 조직학적 절편 없이 형광 표지된 온전한 생물학적 샘플을 이미지화하는 것입니다. 이는 완전한 투명성이 달성될 때까지 유기 용매에서 고정 조직을 순차적으로 배양함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로.
투명 조직은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 3D로 이미지화됩니다. 다음으로, 이미징 결과를 분석하고 수집된 3개의 디스코 이미지로부터 절단되지 않은 척수와 뇌의 신경 구조를 3D로 재구성할 수 있습니다. 이 방법은 전체 뇌와 척수에서 신경 세포와 GAL 연결을 매핑하는 방법에 관한 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 기술의 의미는 이제 전체 신경계에 걸쳐 신경 무결성을 시각화할 수 있기 때문에 신경 퇴행 치료로 확장됩니다. 이 방법은 신경계의 조직에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 폐나 종양 조직과 같은 다른 기관에도 적용할 수 있습니다. 이 기술은 일단 숙달되면 척수나 폐와 같은 작은 장기의 경우 몇 시간, 뇌의 경우 약 하루나 이틀이 소요됩니다. 수확한 조직당 하나의 유리 바이알에 갓 준비한 50%THF 2-3밀리리터를 첨가하여 절차를 시작합니다.
그런 다음 고정된 장기를 세척 용액으로 옮기고 바이알을 단단히 닫습니다. 바이알을 회전자에 놓고 알루미늄 호일로 덮고 30RPM의 일정한 속도로 적절한 시간 동안 샘플을 저어줍니다. 그런 다음 투명화 용액을 제거하고 새 PE 또는 피펫을 사용하여 다음 용액에서 조직을 현탁시킵니다.
최종 투명화 단계 중 표에 표시된 바와 같이, 다중 광자 또는 컨포칼 현미경 검사를 위해 완전히 투명해질 때까지 샘플을 용액에 보관하십시오. 완전한 투명화가 이루어지는 즉시 이미징 슬라이드에 샘플을 이 끝에 장착합니다. 치과 용 시멘트를 사용하여 조직 주위에 테두리를 만듭니다.
치과 시멘트가 완전히 단단해지기 직전에 최종 세척 용액으로 수영장을 채운 다음 즉시 세척된 샘플을 수영장 중앙에 놓고 커버 유리로 덮습니다. 치과 시멘트로 완전히 밀봉될 때까지 커버 유리를 누르고 완전한 투명이 달성되는 즉시 가벼운 시트 현미경 검사를 위해 투명화된 장기 표면에 닿을 때까지 커버 유리를 누른 다음 샘플 홀더의 나사를 수동으로 돌려 샘플을 고정합니다. 다음으로, 이미징된 조직에 적합한 최종 투명화 용액으로 채워진 광시트 현미경의 이미징 챔버에 샘플을 담그십시오.
그런 다음 현미경이 제공할 수 있는 최상의 해상도로 투명화된 조직 전체를 포함하는 Z 스캔을 수집하고 관심 영역을 확대하여 더 높은 해상도의 이미지를 수집합니다. 이미지를 수집한 후 resolve RT 모듈을 사용하여 Amira 소프트웨어에서 이미지 시리즈를 로드합니다. 시리즈가 로드되면 이미지 읽기 매개 변수 창에 올바른 복셀 크기를 입력하고 확인을 클릭합니다.
다음으로, 다중 평면 보기 하위 응용 프로그램을 선택합니다. 그런 다음 기본 및 두께 슬라이더를 사용하여 회색 값에 대한 최적의 투영 두께와 임계값을 선택합니다. 마지막으로 자르기 모서리 모듈을 사용하여 다양한 3D 방향에서 슬라이스를 탐색합니다.
샘플을 시각화하기 위해 뉴런의 구조적 조직을 매핑하는 것은 뉴런이 건강과 질병에서 어떻게 기능하는지 이해하는 데 매우 중요합니다. 쓰리 디스코는 여러 가지 장기에 사용할 수 있지만, 척수와 뇌의 긴 신경 세포를 추적하는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 투명해진 큰 척수 분절의 초현미경 스캔을 사용하면 이 이미지에 표시된 것처럼 설치류 척수에서 몇 센티미터 이상 축삭 연결을 추적할 수 있습니다.
비슷한 방식으로, 제거된 쥐의 뇌와 해마 전체를 이미지화하여 뇌의 뉴런 연결을 따라갈 수 있습니다. 컨포칼 또는 다광자 현미경을 사용하면 특히 Z 차원에서 이미징 해상도가 크게 향상될 수 있습니다. 예를 들어, GFPM 계열 마우스에서 제거된 척수에 대한 다중 광자 이미징은 척수의 전체 1.5-2mm 깊이에 걸쳐 매끄러운 이미지를 얻습니다.
투명해진 척수에 대한 컨포칼 현미경 검사는 유사한 방식으로 향상된 해상도를 제공합니다. 투명화된 뇌의 다중 광자 현미경 이미징은 수지상 가시를 포함한 신경 구조의 미세한 디테일을 시각화할 수 있는 매우 높은 해상도의 이미지를 제공합니다. 쓰리 디스코의 샘플은 다양한 방법으로 라벨을 붙일 수 있습니다.
예를 들어, 렉틴 접합 형광 추적자를 사용하여 뇌와 척수의 전체 혈관 구조를 라벨링할 수 있으며, 이는 건강과 질병에 대한 혈액 뇌 장벽을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 3개의 디스코를 사용하여 큰 조직에 있는 더 작은 세포도 이미지화할 수 있습니다. 예를 들어, 미세아교세포와 성상세포는 모두 알츠하이머병과 외상성 부상을 포함한 신경퇴행의 병리학에 밀접하게 관련되어 있습니다.
3개의 디스코를 사용하여 척수 내의 밀도와 분포를 연구할 수 있습니다. 비신경 조직도 이미지화할 수 있습니다. 예를 들어, 설치류 폐 전체에 있는 Clara 세포는 항체로 면역 표지되고 단일 세포 수준에서 절편 없이 이미지화될 수 있습니다.
마찬가지로, 승인되지 않은 췌장 조직에서 세포를 투명하게 하고 이미지화하는 것이 가능합니다. 예를 들어, 형광 표지된 알파 세포는 이러한 췌장 이미지를 제거한 후 이미지화됩니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 중요한데, 그 이유는 클리어링 및 이미징 단계는 간단하지만 데이터 분석은 복잡할 수 있기 때문입니다.
이 절차를 적용하는 동안에는 투명화 용액에서 시간이 지남에 따라 형광 신호가 저하되기 때문에 완전한 투명도가 달성되는 즉시 투명 조직을 이미지화하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발은 연구자들이 뇌의 신경 네트워크를 매핑하는 것과 같은 세부 사항과 손상되지 않은 장기를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전체 장기에서 세포 및 하위 세포 구조를 투명하게 하고 이미지화한 다음 시각화하고 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 연구는 3DISCO 기술을 사용하여 조직학적 단면을 만들지 않고 형광 표지된 생물학적 샘플을 영상화하는 방법을 제시합니다. 이 과정은 투명성을 달성하기 위해 고정된 조직을 유기 용매에 순차적으로 배양한 후 레이저 스캐닝 현미경으로 3D 영상화를 수행하는 것을 포함합니다.
3DISCO enables high-resolution 3D imaging of intact biological systems without sectioning, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and oncology R&D. By preserving tissue architecture and enabling whole-organ visualization, it enhances predictive confidence in preclinical models and reduces biological ambiguity in target engagement studies. This capability accelerates lead identification and translational biomarker discovery by providing quantitative, spatially resolved data across disease-relevant systems.
3DISCO fits within the discovery continuum from target validation through preclinical imaging, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in neuroscience and immuno-oncology programs.