단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭
2014년 2월 18일
여기에 프로토콜은 바이오 층 간섭과 단백질 - 단백질 상호 작용의 운동 분석을 설명합니다. 셀룰러 에너지 대사에 관여 F 형 ATP 합성 효소는, 세균에서의 ε 서브 유닛에 의해 억제 될 수있다. 우리는 ε의 억제 C-말단 도메인과 촉매 복합체의 상호 작용을 연구하는 바이오 층 간섭을 채택했다.
다음 실험의 전반적인 목표는 생물층 간섭계(BLI)를 사용하여 단백질의 동역학, 단백질 상호 작용 및 이러한 상호 작용에 대한 작은 리간드의 알로스테릭 효과를 측정하는 것입니다. 이는 특정 비오틴을 가진 단백질 중 하나를 준비하고 이를 연쇄상구균 표면에 고정시킴으로써 달성됩니다. Aden은 바이오센서를 병렬로 코팅했습니다.
두 번째 단계로, 센서 결합 단백질은 결합 파트너가 포함된 완충액에 노출되고 결합은 센서 표면의 광학 간섭에 미치는 영향에 의해 실시간으로 측정됩니다. 다음으로, 각 센서는 단백질의 실시간 해리를 측정하기 위해 결합 파트너 없이 버퍼로 전송됩니다. 단백질 복합체.
얻어진 결과를 통해 상호 작용하는 단백질의 결합 및 해리에 대한 운동 속도 상수를 측정할 수 있으며, 이에 따라 결합 친화도를 측정할 수 있습니다. 추가 결과는 BLI가 단백질 단백질 복합체의 해리 속도에 대한 작은 리간드의 영향을 감지할 수 있음을 보여줍니다. 표면 플라즈마 공명과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 BLI가 굴절률 변화에 지나치게 민감하지 않다는 것입니다.
따라서 결합 및 결합 단계에는 단백질-단백질 상호 작용에 대한 영향을 실시간으로 테스트하기 위해 작은 리간드의 변화가 포함될 수 있지만, 이 방법은 단백질-단백질 상호 작용의 동역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 고정된 DNA 또는 RNA에 대한 단백질 결합 또는 고정된 단백질에 대한 리포좀 결합과 같은 다양한 조합에 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 BLI 기기를 설정하여 이 실험을 시작합니다.
그런 다음 데이터 수집 소프트웨어에서 실험 설계를 설정합니다. 실험 마법사 탭에서 새 동역학 실험을 선택합니다. 그러면 탭 1에서 정의해야 하는 모든 단계가 포함된 탭 메뉴가 표시됩니다.
사용할 열을 정의합니다. 96웰 샘플 플레이트에서. buffer, 고정화할 protein 또는 binding partner를 포함할 열을 할당합니다.
각 연관에 대해 사용할 결합 파트너의 농도를 잘 입력합니다. 탭 2에서 분석에 필요한 모든 단계를 정의합니다. 여기에는 베이스라인 로딩 연결 및 바인딩 파트너의 해리가 포함됩니다.
개별 분석 단계는 분석 단계를 선택한 다음 해당 열을 두 번 클릭하여 샘플 플레이트의 웰 열과 연결됩니다. 이것은 센서가 우물의 한 열에서 다음 열로 이동하도록 프로그래밍합니다. 분석하는 동안 분석 버퍼가 있는 웰의 첫 번째 열에 연결된 간단한 기준선 단계부터 시작하여 96 웰 플레이트에서 초기 BLI 신호를 설정합니다.
그런 다음 loading(로딩) 단계를 비오틴화된 단백질을 함유할 웰(well)에 연결합니다. threshold 함수를 사용하여 미리 결정된 바인딩 수준을 얻을 수 있습니다. 모든 센서가 웰의 다음 열로 이동하도록 임계값 옵션을 설정합니다.
센서 중 하나가 임계값에 도달하면 버퍼에 또 다른 기준선 단계를 포함하여 센서에서 고정되지 않은 비오틴화된 단백질을 씻어내고 기본 분석을 위한 새로운 안정적인 기준선 신호를 설정하여 전체 결합 및 해리율 상수를 결정하고 연관성 전에 버퍼 웰의 새로운 열에 센서를 사용하는 추가 기준선 단계를 포함합니다. 다음 단계로 연결을 연결합니다. 다양한 농도의 결합 파트너를 포함하는 웰 기둥으로 이동합니다.
결합 파트너의 포화 농도가 최소한 평형 결합 신호에 도달하도록 단계 시간을 조정합니다. 해리 단계의 경우, 센서가 연결 전 추가 베이스라인에 사용된 것과 동일한 버퍼 웰인 열 4로 돌아가도록 지정합니다. 연관 및 해리 단계의 시간은 속도가 예상보다 느리거나 빠른 경우 실험 중에 조정할 수 있습니다.
탭 3에서 분석을 위해 미리 습윤된 센서를 포함할 센서 트레이의 위치를 표시합니다. 탭 4에서는 프로그램의 그래픽 검토를 허용합니다. 탭 5에서 데이터 파일의 위치 및 원하는 온도를 포함하여 필요한 세부 정보를 입력합니다.
실험을 위해. 스트렙타비딘 코팅 센서를 최소 10분 동안 미리 적십니다. 보호용 자당 코팅을 제거하려면 센서 트레이에서 랙이 포함된 센서를 제거하고 트레이 바닥에 96웰 플레이트를 삽입하여 플레이트의 한쪽 모서리를 트레이의 방향 노치로 밀어 넣습니다.
사용할 센서 컬럼의 경우 웰당 200마이크로리터의 분석 버퍼를 추가합니다. 96웰 플레이트의 해당 열에서 센서 랙을 할당된 올바른 방향으로 트레이로 되돌립니다.프로그래밍하는 동안 샘플 플레이트의 웰을 분석 버퍼 또는 적절한 단백질 희석액으로 채웁니다. 거품은 광 신호에 노이즈를 유발할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
비오틴화된 단백질 또는 결합 파트너를 생략하는 하나 이상의 reference well을 포함합니다. 기기의 도어를 열고 센서 암에서 출력되는 빛을 확인합니다. 트레이 탭이 s의 슬롯에 삽입된 상태에서 센서 트레이를 s에 삽입하십시오.tage.
샘플 플레이트를 플레이트 홀더에 삽입합니다. 플레이트가 평평하게 장착되고 플레이트 홀더에 표시된 대로 올바른 방향으로 놓여 있는지 확인하십시오. 도어를 닫고 데이터 수집 프로그램에서 분석을 시작합니다.
센서에 여전히 사전 습윤이 필요한 경우 실험 시작을 지연하는 옵션을 선택합니다. 마지막으로, 모든 시료 준비가 완료되고 시료 플레이트와 센서 트레이가 모두 기기에 로드되면 go(이동) 버튼을 클릭하여 분석을 실행합니다. 분석이 실행된 후 데이터 분석 소프트웨어를 열고 데이터가 포함된 폴더를 로드합니다.
처리 탭을 클릭하면 단계별 처리 메뉴와 데이터 선택 아래에서 각 센서에 다른 색상이 할당된 원시 운동 데이터를 볼 수 있습니다. 샘플 플레이트 맵에서 센서 선택 버튼을 클릭합니다. 하나 또는 두 개의 제어 센서에 대한 well을 Processing Menu의 참조 well로 지정합니다.
빼기 상자를 선택하고 참조 웰을 선택하여 다른 모든 센서 신호에서 참조 신호를 뺍니다. Align y 축 단계를 사용하여 모든 트레이스를 Y가 0과 같도록 정렬합니다. 그런 다음, 시간 범위에 대한 맞춤 단계로 기준선을 선택합니다.
해당 기준선의 마지막 10초를 입력합니다. 해당 기준선 단계 내를 클릭하면 정렬이 표시됩니다. 다음으로, 연결 단계와 해리 단계 간의 신호 이동을 최소화하기 위해 단계 간 보정 상자를 선택합니다.
기준선 또는 연관 해제할 선을 선택합니다. 대부분의 경우 KY gole 필터링 기능을 선택하고 프로세스 데이터를 클릭하여 오른쪽 하단 패널에서 최종 프로세스 데이터를 육안으로 검사합니다. 데이터를 분석하려면 분석할 단계에 대한 데이터 분석에서 분석 탭을 클릭하고 연결 및 해리를 선택합니다.
모델의 경우 피팅을 위해 일대일로 선택합니다.글로벌 선택. group by select color의 경우, 고정된 단백질에 대한 파트너의 포화 결합 시 최대 신호 응답의 독립적인 피팅을 허용하기 위해 센서에 의해 연결되지 않은 r max를 선택합니다. 마지막으로 곡선 맞춤을 클릭하여 비선형 회귀 분석을 시작합니다.
센서 데이터 추적이 있는 회귀 곡선의 오버레이, 피팅 잔차의 플롯, 결정된 모수 값과 통계량이 있는 테이블을 포함하는 피팅 결과를 검토합니다. 실시간 결합 및 해리 BLI 역학이 여기에 나와 있습니다. 이 실험은 센서가 사전 습윤 상태였기 때문에 10분의 기준선 단계로 시작되었으며, 잠깐만 비오틴화된 엡실론이 센서에 로드되었습니다.
엡실론의 검출 가능한 해리는 결합 파트너가 추가되지 않은 참조 곡선에서 볼 수 있듯이 나머지 모든 단계에서 발생하지 않았습니다. 두 번째 reference sensor는 동원된 단백질이 없었고 결합 파트너의 낮은 비특이적 결합을 보여주었습니다. 센서 A에서 F까지 다양한 농도의 F1에서 엡실론을 뺀 값을 사용하여 결과를 전역적으로 맞추고 연관 속도 상수 및 평형 해리 상수 KD 결과에 대한 최상의 값을 얻기 위해 연관 단계에서 사용하여 청색 데이터 트레이스를 생성했습니다.
이 경우, 바인딩 파트너의 비특이적 바인딩 및 시스템 신호 드리프트를 수정하기 위해 샘플 트레이스에서 참조 센서 트레이스를 뺍니다. 데이터 분석 단계에서 모든 곡선은 일대일, 일대일 모델로 전역적으로 맞춰졌습니다. 전역 적합은 결합 파트너의 완전한 해리를 가정합니다.
효소가 1 밀리몰 A-T-P-A-D-T-A의 존재 하에서 고정된 엡실론을 감지하도록 결합된 다른 실험이 여기에 나와 있습니다. 이것은 대부분의 F1 엡실론 복합체가 비억제성 확인을 가정하는 경향이 있으며, 이는 쉽게 해리되는 센서를 다른 리간드를 가진 분석 완충액을 포함하는 해리 웰로 이동했습니다. 이것은 엡실론의 확인에 대한 다양한 리간드의 효과를 보여줍니다.
예를 들어, 마그네슘 A GP 및 인산염에 노출되면 순 해리가 극적으로 느려졌으며 이는 엡실론이 단단히 결합된 억제 상태로 확진을 이동시켰음을 나타냅니다. BLI 분석을 처음 설정할 때 단백질과 센서의 비특이적 결합을 테스트하고 비특이적 결합이 사용할 단백질 농도에 따라 크게 달라지는지 여부를 테스트하기 위한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단백질 단백질 상호 작용의 역학을 측정하기 위한 BLI 분석을 설계, 프로그래밍 및 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
BLI를 사용하면 단백질 단백질 상호 작용에 대한 작은 리간드의 영향을 직접 테스트할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 바이오 레이어 간섭법(BLI)을 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 주요 초점은 세균의 에너지 대사에서 역할을 하는 F-형 ATP 합성효소와 그 ε 서브유닛 간의 상호작용에 맞춰져 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 단백질 상호작용
배경
- F-형 ATP 합성효소는 세포의 에너지 생산에 중요합니다.
- ε 서브유닛은 ATP 합성효소의 활성을 억제할 수 있습니다.
- 이러한 상호작용을 이해하는 것은 대사 조절에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 바이오 레이어 간섭법은 이러한 상호작용을 실시간으로 측정할 수 있습니다.
연구 목적
- 단백질-단백질 상호작용의 동역학을 측정합니다.
- 소분자 리간드가 이러한 상호작용에 미치는 알로스테릭 효과를 조사합니다.
- ATP 합성효소의 촉매 복합체를 연구하기 위해 BLI를 적용합니다.
사용된 방법
- 이동화를 위한 비오틴으로 단백질 준비.
- 결합 분석을 위한 스트렙타비딘 코팅 바이오센서의 사용.
- 광학 간섭을 사용한 결합 및 해리의 실시간 측정.
- 상호작용 중에 형성된 단백질 복합체의 분석.
주요 결과
- ATP 합성효소와 그 ε 서브유닛 간의 결합 동역학 측정에 성공했습니다.
- 단백질 복합체의 해리에 대한 실시간 데이터.
- ATP 합성효소 활성의 알로스테릭 조절에 대한 통찰력.
- 단백질 상호작용을 연구하는 데 BLI가 귀중한 도구임을 입증했습니다.
결론
- BLI는 단백질-단백질 상호작용을 연구하는 데 효과적입니다.
- ATP 합성효소와 그 ε 서브유닛 간의 상호작용은 대사 조절을 이해하는 데 중요합니다.
- 향후 연구는 이러한 방법을 바탕으로 다른 단백질 상호작용을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Bio-layer Interferometry (BLI) enables real-time kinetic analysis of protein-protein interactions and allosteric ligand effects, supporting target validation in antibacterial drug discovery. By measuring binding and dissociation rates of the ε subunit with ATP synthase catalytic complexes, BLI provides quantitative data to de-risk mechanistic hypotheses and prioritize lead compounds. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking ligand-induced conformational changes to functional inhibition of a clinically relevant target.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how ligands shift ε subunit conformation between active and inhibitory states.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding kinetics without label interference, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating ligand binding with functional outcomes in bacterial energy metabolism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Measures association and dissociation rate constants to characterize binding affinity under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Tolerates varying buffer compositions, allowing screening of diverse ligand libraries without signal artifacts.
- Scalability: Compatible with 96-well formats for parallel evaluation of multiple ligand concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro binding data to bacterial-specific auto-inhibition mechanisms relevant to antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies allosteric regulation of ATP synthase, reducing ambiguity in target engagement strategies.
- Preclinical Alignment: Supports disease-relevant modeling by focusing on a validated antibacterial target (FDA-approved for tuberculosis).
Pipeline & Workflow Integration
BLI fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for antibacterial programs targeting energy metabolism.
- Discovery Biology: Tests target validity by measuring real-time kinetics of protein-protein interactions and ligand-induced conformational shifts.
- Screening: Delivers quantitative KD, kon, and koff values to support hit-to-lead progression and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides sensor-based optical interference readouts that enable global fitting and residual analysis for robust kinetic modeling.
- Translational Research: Connects biochemical mechanism to antibacterial phenotype through inhibition of a clinically validated target.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying protein-protein interactions across multiple targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by detecting allosteric effects of small ligands on protein complex stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through reference subtraction, baseline alignment, and inter-step correction during data processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic thresholds for target engagement and ligand efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on binding kinetics and conformational selectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biotinylation, streptavidin biosensor handling, and BLI instrument setup.
- Depends on access to multi-well plate readers with temperature control and real-time optical monitoring capabilities.
- Necessitates standardized workflows for sensor regeneration, reference well inclusion, and data subtraction to minimize noise.
- Involves optimization of association and dissociation timing based on ligand binding kinetics and complex stability.
- Limited by the need for immobilized binding partners, which may affect native protein conformation or accessibility.
