단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭

다음 실험의 전반적인 목표는 바이오레이어 간섭계(biolayer interferometry, BLI)를 사용하여 단백질의 역학, 단백질 간 상호작용 및 소분자 리간드가 이러한 상호작용에 미치는 알로스테릭 효과를 측정하는 것입니다. 이는 단백질 중 하나를 특정 비오틴으로 준비하고, 이를 strep. aden 코팅 바이오센서 표면에 병렬로 고정함으로써 수행됩니다.

두 번째 단계로, 센서에 결합된 단백질을 결합 파트너가 포함된 완충액에 노출시키며, 센서 표면의 광학적 간섭에 미치는 영향을 통해 결합 상태를 실시간으로 측정합니다. 다음으로, 단백질의 실시간 해리를 측정하기 위해 각 센서를 결합 파트너가 없는 완충액으로 옮깁니다. 단백질 복합체.

얻어진 결과들을 통해 상호작용하는 단백질들의 결합 및 해리 속도 상수를 결정할 수 있으며, 이를 통해 결합 친화도를 알 수 있습니다. 추가적인 결과들은 BLI가 단백질-단백질 복합체의 해리 속도에 미치는 소분자 리간드의 영향을 감지할 수 있음을 보여줍니다. 표면 플라즈몬 공명과 같은 기존 방법들과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 BLI가 굴절률 변화에 과도하게 민감하지 않다는 점입니다.

따라서 결합 및 연합 단계에서 소분자 리간드를 변경하여 단백질-단백질 상호작용에 미치는 영향을 실시간으로 테스트할 수 있으며, 이 방법은 단백질-단백질 상호작용의 역학에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 고정화된 DNA 또는 RNA에 단백질이 결합하거나 고정화된 단백질에 리포좀이 결합하는 것과 같은 다양한 조합에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 BLI 장비를 설정하여 이 실험을 시작하십시오.

그런 다음 데이터 획득 소프트웨어에서 실험 설계를 설정하십시오. 실험 마법사 탭에서 새로운 kinetics 실험을 선택하십시오. 그러면 첫 번째 탭에서 정의해야 하는 모든 단계가 포함된 탭 메뉴가 나타납니다.

사용할 컬럼을 정의합니다. 96-well 샘플 플레이트에서 버퍼, 고정화할 단백질 또는 결합 파트너가 포함될 컬럼을 지정하십시오.

각 결합에 대해 사용할 결합 파트너의 농도를 입력합니다. 두 번째 탭에서 분석에 필요한 모든 단계를 정의하십시오. 여기에는 결합 파트너의 베이스라인 로딩, 결합 및 해리가 포함됩니다.

어세이 단계를 선택한 후 해당 컬럼을 더블 클릭하여 개별 어세이 단계를 샘플 플레이트의 웰 컬럼과 연결합니다. 이렇게 하면 센서가 한 웰 컬럼에서 다음 컬럼으로 이동하도록 프로그램됩니다. 어세이 진행 시, 96웰 플레이트에서 초기 BLI 신호를 설정하기 위해 어세이 버퍼가 담긴 첫 번째 웰 컬럼과 연결된 짧은 베이스라인 단계를 먼저 수행하십시오.

그 다음, 로딩 단계를 비오틴화된 단백질이 포함될 웰들에 연결하십시오. 임계값 함수를 사용하여 미리 설정된 결합 수준을 달성하십시오. 모든 센서가 다음 웰 열로 이동하도록 임계값 옵션을 설정하십시오.

어떤 센서라도 임계값에 도달하면, 센서에서 고정되지 않은 비오틴화 단백질을 씻어내기 위해 버퍼를 이용한 기준선 단계를 추가하십시오. 전반적인 결합 및 해리 속도 상수를 결정하기 위한 기본 분석용의 새로운 안정적인 기준선 신호를 설정하려면, 결합 단계 이전에 새로운 버퍼 웰 열에 있는 센서를 사용하여 추가 기준선 단계를 포함하십시오. 다음 단계로, 결합 파트너가 다양한 농도로 포함된 웰 열에 결합 단계를 연결하십시오.

결합 파트너가 최소한 포화 농도에서 평형 결합 신호에 도달할 수 있도록 단계 시간을 조정하십시오. 해리 단계의 경우, 센서가 결합 전 추가 베이스라인 측정에 사용했던 것과 동일한 버퍼 웰인 4번 컬럼으로 돌아가도록 지정하십시오. 결합 및 해리 단계의 시간은 속도가 예상보다 느리거나 빠른 경우 실험 중에 조정할 수 있습니다.

세 번째 탭에서 분석에 사용할 미리 적신 센서가 배치될 센서 트레이의 위치를 지정하십시오. 네 번째 탭에서는 프로그램의 그래픽 리뷰가 가능합니다. 다섯 번째 탭에서는 데이터 파일의 위치와 설정 온도 등 필요한 세부 정보를 입력하십시오.

실험을 위해 streptavidin 코팅 센서를 최소 10분 동안 사전 습윤화하십시오. 보호용 sucrose 코팅을 제거하려면, 센서 트레이에서 센서가 담긴 랙을 꺼내고 96-well 플레이트의 한쪽 모서리를 트레이의 가이드 홈에 맞춰 트레이 바닥에 삽입하십시오.

사용할 센서 컬럼의 웰당 200 µL의 분석 버퍼를 추가하십시오. 96웰 플레이트의 해당 센서 컬럼에 센서 랙을 프로그래밍 시 지정된 올바른 방향으로 트레이에 다시 장착하십시오. 샘플 플레이트의 웰을 분석 버퍼 또는 적절한 단백질 희석액으로 채우십시오. 기포는 광학 신호에 노이즈를 유발할 수 있으므로 발생하지 않도록 주의하십시오.

비오틴화 단백질 또는 결합 파트너 중 하나를 생략한 하나 이상의 참조 웰(reference well)을 포함하십시오. 기기의 도어를 열고 센서 암에서 나오는 광 출력을 확인하십시오. 트레이 탭을 스테이지의 슬롯에 끼워 센서 트레이를 스테이지 위에 삽입하십시오.

샘플 플레이트를 플레이트 홀더에 삽입하십시오. 플레이트가 플레이트 홀더에 표시된 올바른 방향으로 평평하게 안착되었는지 확인하십시오. 도어를 닫고 데이터 획득 프로그램에서 분석을 시작하십시오.

센서의 사전 습윤화(pre wetting)가 여전히 필요한 경우, 실험 시작을 지연시키는 옵션을 선택하십시오. 마지막으로, 모든 시료 준비가 완료되고 시료 플레이트와 센서 트레이가 모두 기기에 장착되면, go 버튼을 클릭하여 분석을 실행하십시오. 분석이 완료되면 데이터 분석 소프트웨어를 열고 데이터가 포함된 폴더를 불러오십시오.

프로세싱 탭을 클릭하여 단계별 프로세싱 메뉴를 확인하고, 데이터 선택 항목에서 각 센서에 서로 다른 색상이 지정된 원시 키네틱 데이터를 확인하십시오. 샘플 플레이트 맵에서 센서 선택 버튼을 클릭하십시오. 프로세싱 메뉴에서 하나 또는 두 개의 대조군 센서 웰을 참조 웰로 지정하십시오.

뺄셈(subtraction) 확인란을 선택하고 기준 웰을 지정하여 다른 모든 센서 신호에서 기준 신호를 뺍니다. Y축 정렬(align y axis) 단계를 사용하여 모든 트레이스를 Y=0으로 맞춥니다. 그런 다음 시간 범위에 대한 정렬 단계로 베이스라인(baseline)을 선택합니다.

해당 베이스라인의 마지막 10초를 입력하십시오. 베이스라인 단계 내부를 클릭하면 정렬 상태가 표시됩니다. 다음으로, 결합 단계와 해리 단계 사이의 신호 이동을 최소화하기 위해 단계 간 보정(inter step correction) 확인란을 선택하십시오.

기준선 또는 해리 분석을 위한 라인을 선택하십시오. 대부분의 경우 KY gole 필터링 기능을 선택하고, 데이터 처리(process data)를 클릭하여 진행한 후 우측 하단 패널에서 최종 처리된 데이터를 시각적으로 검토하십시오. 데이터를 분석하려면 데이터 분석의 분석 탭에서 분석할 단계를 클릭하고, 결합(association) 및 해리(dissociation)를 선택하십시오.

모델의 경우, 피팅을 위해 one to one을 선택하고 global을 선택하십시오. group by에서는 color를 선택하고, 고정화된 단백질에 파트너가 포화 결합되었을 때의 최대 신호 반응을 독립적으로 피팅할 수 있도록 r max를 unlinked by sensor로 선택하십시오. 마지막으로, fit curves를 클릭하여 비선형 회귀 분석을 시작하십시오.

회귀 곡선과 센서 데이터 트레이스의 중첩, 피팅 잔차 플롯, 그리고 결정된 파라미터 값과 통계치가 포함된 표로 구성된 피팅 결과를 검토하십시오. 여기에는 실시간 결합 및 해리 BLI 키네틱스가 표시됩니다. 센서가 짧게 사전 습윤 처리되었으므로, 이 실험은 10분간의 베이스라인 단계로 시작되었으며, 이후 비오틴화된 epsilon을 센서에 로딩하였습니다.

결합 파트너를 추가하지 않은 참조 곡선에서 확인할 수 있듯이, 이후의 모든 단계에서 epsilon의 해리 현상은 검출되지 않았습니다. 두 번째 참조 센서에는 동원된 단백질이 없었으며, 결합 파트너의 낮은 비특이적 결합을 보여주었습니다. 결과값을 전역적으로 피팅하여 결합 속도 상수와 평형 해리 상수 KD의 최적값을 얻기 위해, 센서 A부터 F까지의 결합 단계에서 다양한 농도의 F1 minus epsilon을 사용하였으며, 처리된 결과는 파란색 데이터 트레이스로 나타났습니다.

이 사례에서는 결합 파트너의 비특이적 결합과 시스템 신호 드리프트를 보정하기 위해 샘플 트레이스에서 참조 센서 트레이스를 뺐습니다. 데이터 분석 단계에서 모든 곡선은 1:1 모델을 사용하여 글로벌 피팅을 수행하였습니다. 글로벌 피팅은 결합 파트너의 완전한 해리를 가정합니다.

여기서는 1 mM ATP-ADP-TNA 존재 하에 효소가 고정화된 epsilon 센서에 결합된 다른 실험을 보여줍니다. 이는 대부분의 F1 epsilon 복합체가 비억제성 구조를 취하게 하여 쉽게 해리되도록 합니다. 그런 후 센서를 서로 다른 리간드가 포함된 분석 버퍼가 들어 있는 해리 웰로 옮겼습니다. 이는 epsilon의 구조에 미치는 다양한 리간드의 영향을 보여줍니다.

예를 들어, magnesium A GP 및 phosphate에 노출되었을 때 순 해리 속도가 급격히 느려졌으며, 이는 epsilon이 강하게 결합된 억제 상태로 구조가 변화했음을 나타냅니다. BLI 분석을 처음 설정할 때는 센서에 대한 단백질의 비특이적 결합 여부와, 사용될 단백질 농도에 따라 비특이적 결합이 유의미하게 변하는지를 테스트하기 위한 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단백질-단백질 상호작용의 역학을 측정하기 위한 BLI 분석을 설계, 프로그래밍 및 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

BLI를 통해 소분자 리간드가 단백질-단백질 상호작용에 미치는 영향에 대해 직접적인 테스트가 가능합니다.