뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

이 비디오의 전반적인 목표는 변형된 뉴클레오시드 인산염의 합성부터 완전한 생화학적 특성화에 이르는 절차를 시연하는 것입니다. 이는 먼저 4단계 1포트 절차의 적용에 의해 적절하게 보호된 뉴클레오시드 전구체를 해당 tri phosphate로 전환함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 생성된 인산트리포스페이트를 먼저 침전으로 정제한 다음 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하는 것입니다.

다음으로, 트리 포스페이트 아날로그는 핵 자기 공명 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 또는 NMR 및 maloff를 특징으로 하여 고순도를 보장합니다. 마지막 단계는 프라이머 확장 반응과 말단 데옥시 뉴클레오티드 전이효소 또는 TDT 중합 반응입니다. 궁극적으로, 반응 생성물, 및 따라서 tri phosphate의 기질 수용은 겔 전기 영동에 의해 분석됩니다.

Borge 접근법과 같은 다른 합성 전략과 비교했을 때 이 방법의 장점은 부산물이 더 적게 형성되어 정제가 더 쉽다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 여러 분야의 지식이 필요한 상당히 길고 복잡한 절차이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 변형된 인산염을 합성했을 때 이 방법을 촬영한다는 아이디어를 처음 떠올렸고 자세한 절차를 찾는 것이 다소 어렵다는 것을 알게 되었습니다.

이 방법의 또 다른 장점은 변형 핵산 분야의 다른 질문을 해결하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 실제로, 광범위한 반응을 촉매하는 DNA 효소를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 핵산의 기능적 태깅에 사용될 수 있다.

이 방법의 시각적 시연은 합성 및 정제 단계를 배우기가 어렵기 때문에 매우 중요한데, 이는 tri phosphates가 주의해서 다루어야 하는 극성 및 활성 유도체이기 때문입니다. 먼저 적절하게 3프라임 하이드록실 보호 뉴클레오시드를 2밀리리터의 무수 퓨린으로 두 번 공동 증발시킨 후 밤새 진공 상태에서 건조합니다. 동시에, 다음 날 밤새 진공 상태에서 건조 재판소 피로 인산 암모늄은 최소 200 마이크로 리터의 건조 피리딘에 뉴클레오 시드를 용해시켰다.

그런 다음 400마이크로리터의 건조 다이옥산을 COS 용매로 추가합니다. 마지막으로 고리형 인 3 유도체를 첨가하고 실온에서 45 분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 170 마이크로 리터의 건조 디메틸 포름 아미드와 58 마이크로 리터의 갓 증류 된 트리 부틸 아민에 건조 부틸 암모늄 피로 인산염 용액을 준비합니다.

생성된 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 45분 동안 반응시킵니다. 그런 다음 980 마이크로 리터의 퓨린과 20 마이크로 리터의 물에 160 마이크로 몰의 요오드 용액을 준비합니다. 반응 혼합물에 용액을 첨가합니다.

알파 인 중심을 산화시키기 위해. 생성된 어두운 용액을 실온에서 30분 동안 저어줍니다. 과도한 요오드를 담금질하기 위해 10% 티오황산나트륨 수용액을 사용하십시오.

진공 상태에서 용매를 제거하십시오. 그런 다음 물 5ml를 넣고 혼합물을 실온에서 30분 동안 방치하여 고리형 인산 삼인염 물질을 가수분해합니다. 이 단계에서는 일반적으로 보호 그룹이 제거됩니다.

결과적으로, 30% 이모듐 하이드록사이드를 미처리 샘플에 첨가하십시오. 진공 상태에서 용매를 제거하기 전에 실온에서 1.5시간 동안 저어줍니다. 다음으로 물 2ml를 넣고 혼합물을 튜브 튜브로 나눕니다.

절차를 반복하기 전에 아세톤과 원심 분리기에 염소산염당 12%나트륨 용액 2ml를 30ml 추가합니다. 또 한 번. 인산트리(tri phosphate)로부터의 합성에 사용된 시약은 침전되어 유성 잔류물을 형성하고 용매의 분리를 허용하며, 따라서 유성 잔류물의 공기 건조 후 후속 역상 HPLC 정제를 실질적으로 단순화합니다.

표준 절차에 따라 미처리 샘플의 P 31 NMR 스펙트럼을 기록합니다. 다음 NMR은 4 밀리리터의 증류수에 기름진 잔류 물을 용해시켰다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 초순수에서 EENT A로 50밀리몰의 트리에틸 암모늄 바이카보네이트와 EENT B로 50% 아세틸 니트릴을 준비하여 HPLC 정제를 시작하고 진공 상태에서 EENT를 모두 제거하고 20분 동안 교반합니다.

10마이크로리터의 원트리포스페이트를 300마이크로리터의 증류수에 용해시켜 분석 샘플을 준비합니다. 그런 다음 40분 안에 0%B에서 100%B 범위의 그래디언트를 사용합니다. 반분취용 역C 18상 컬럼이 장착된 HPLC 시스템에 시료를 주입합니다.

tri phosphate 및 diphosphate의 체류 시간에 따라 HPLC 프로그램을 조정하십시오. 이러한 조건을 사용하여 조잡한 혼합물을 정제하고 약간의 이인산을 포함할 수 있는 초기 분획을 제거하여 제품을 포함하는 모든 분획을 결합하고 동결 건조합니다. 그런 다음 초순수로 여러 번 공동 증발합니다.

표준 프로토콜의 적용을 통해 NMR 및 maloff에 의한 tri phosphate의 순도를 평가합니다. 이 프로토콜의 적용으로 얻어진 전형적 수율은 30 내지 70%의 범위에서 5 프라임과 프라이머의 라벨링을 위한 기판에 따라 달라집니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 프라이머와 시약을 혼합하고 라벨링 반응을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

라벨링 반응 중에 1ml 피펫 팁을 사일로화된 유리솜으로 연결하고 팁을 G 10 용액으로 채워 G 10 cidex 컬럼을 준비합니다. 500마이크로리터의 이중 증류수로 3번 세척하고 50마이크로리터의 이중 증류수로 마지막으로 한 번 세척합니다. 라벨링 반응의 배양 후, 섭씨 70도에서 10분 동안 키나아제를 가열하여 비활성화합니다.

다음으로, G10을 통해 반응 혼합물을 실행합니다. 유리 방사성 라벨 겔을 제거하려면 무선 라벨링 프라이머를 정제하고 크러쉬 및 담금 방법, 에탄올 침전 및 G 10의 적용을 통해 회수합니다. 프라이머 확장 반응을 위해 방사선 표지된 프라이머 PICA 몰 1개, 프라이머 P 1 10 PICA 몰, 템플릿 P 1 및 10 PICA 몰, T 1 in 10 x 반응 완충액을 결합하고 뜨거운 물에 무릎을 꿇습니다.

그런 다음 45분에 걸쳐 실온으로 서서히 식힙니다. 튜브를 얼음에 넣고 뉴클레오시드 인산염 또는 DNTP 칵테일과 DNA 중합효소 얼음 1개를 추가합니다. 총 20 마이크로 리터 부피에 대한 물과의 반응을 완료하고 효소의 최적 작동 온도에서 배양합니다.

그런 다음 20마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 식히면 샘플이 섭씨 0도에서 내려갑니다. 변성 많은 아크릴아미드 젤 전기 이동법에 의해 결심하기 전에.

TDT 중합을 위한 phospho 이미저로 밴드를 시각화하고, 1마이크로리터의 TDT 버퍼에서 단일 가닥 비표지 프라이머 P 2 및 무선 표지 프라이머를 희석합니다. 튜브를 얼음에 넣고 DNTP 칵테일과 TDT 중합효소를 넣은 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 시료를 섭씨 95도에서 5분 동안 가열한 다음 섭씨 0도에서 냉각하기 전에 정지 용액 10마이크로리터를 추가합니다.

변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 샘플을 분해한 후 phospho 이미저를 사용하여 밴드를 시각화합니다. 여기에 도시된 것은 인 중심의 특성 신호가 관찰될 수 있는 변형된 DNTP의 전형적인 조잡한 P31 NMR 스펙트럼이다. 또한, 이인산(diphosphate) 및 일인산(monophosphate) 측에서 유래한 신호.

더 높은 인산염과 함께 제품은 항상 이 단계에서 관찰됩니다. 조질 혼합물의 역상 HPLC 분석이 여기에 나와 있습니다. 주요 피크는 5개의 프라임 인산염에 해당하며, 주요 부산물인 5개의 프라임 디포스페이트는 약간 더 낮은 머무름 시간을 나타냅니다.

마지막으로, 철저한 역상, HPLC 정제 후, 변형된 DNTP는 NMR 및 maldi를 특징으로 하여 여기에 도시된 것은 sulfa ide, 변형된 DUTP 아날로그의 maloff 스펙트럼이다. 나트륨 부가물은 712.54의 질량 과충전에서 볼 수 있으며 이인산의 흔적은 없습니다. P 31 NMR과 양성자 NMR 스펙트럼은 모두 변형된 dps의 순도를 평가하는 데 중요합니다.

바람직하지 않은 염료 및 모노 포스페이트의 존재는 예시된 독특한 신호를 제공하기 때문에, 다음은 트랜스 프롤린 변형 DUTP 히스타민 변형 DATP 및 발레르산 변형 DCTP를 사용한 1차 확장 반응의 결과입니다. 마지막으로, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 다양한 변형된 DUTP 유사체를 사용한 대표적인 TDT 매개 중합 반응을 분석했습니다. 이러한 맥락에서 cis 프롤린 변성 DUTP 및 펩타이드 변성 DUTP는 TDT에 가장 적합한 기질입니다.

테일링 효율이 자연 DTTP와 비슷하거나 능가하기 때문에 요소 개질 DUTP는 이러한 맥락에서 다소 불량한 기질입니다. 폴리 분산이 적기 때문에 더 긴 크기의 올리고뉴클레오티드를 관찰할 수 있습니다.일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 약 1주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 핵 cytric 인산염은 자연의 활성화된 구성 요소이므로 생성된 후 취급할 때 주의를 기울여야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다.

핵산 분야의 연구자들은 이 방법을 사용하여 변형된 abers 및 촉매 핵산을 생성하기 위한 조합 선택을 탐색합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 4단계 1pop 절차를 사용하여 변형된 인산염을 합성하고 특성화한 후 역상 HPLC 정제 및 1차 확장 반응을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 실험 섹션에서 찾을 수 없는 몇 가지 실험 세부 사항이 분명해집니다.

이 방법은 PCR과 같은 다른 기술과 함께 사용하여 추가 질문에 답변하는 데 사용할 수 있습니다. 실제로, 이는 VIO 선택 방법과의 변형된 tri phosphates의 호환성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.