Name: 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 22 s
Description: 학습하세요 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 4단계 원포트 합성법과 역상 HPLC 정제, NMR 및 MALDI-TOF 특성 분석 방법을. 이 기술은 고순도 화합물 제조에 필수적입니다.

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이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 N PZ00P2_126430 / 1 ° 및 PZ00P2_144595)에 의해 지원되었다. 교수 C. Leumann 대해 감사의 실험실 공간 및 장비를 제공뿐만 아니라, 자신의 지속적인 지원에 대해 인정 받고 있습니다. 양 고소 KNECHT는 유익한 토론을위한 인정 받고 있습니다.

1. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 합성 선택의 합성 방법은이 방법은 일반적으로 신뢰성이 매우 몇 가지 측면 제품 (그림 1A) 39 리드 이후 루드비히와 에크 스테인에 의해 개발 된 절차를 따릅니다. <ol><li> 회 무수 피리딘 (2 ml)로하고, 밤새 진공 하에서 건조 후 적절 3&#39;-OAC 보호 된 뉴 클레오 시드 (전형적 0.1 밀리몰)으로 공 증발. 동시에, 진공하에 밤새 건조 피로 인산 트리 부틸 암모늄 (0.13 mmol)을 첨가 하였다. </li><li> 건조 피리딘 (0.2 ㎖)을 최소로 뉴 클레오 시드를 용해 및 공용 ​​매로 건조 디 옥산 (0.4 ml)에 추가합니다. 마지막으로, 2 - 클로로 -1,3,2 - benzodioxaphosphorin -4 - 온 (0.11 밀리몰)을 첨가하고 45 분 동안 실온에서 반응하도록 허용한다. 주 : 특정 손질 2 - 클로로 -1,3,2 - benzodioxaphosphorin -4 - 온 시약으로 이동해야 주목할 만하다. 실제로, 불활성 가스 atmosp에서이 시약에서도 스토리지여기의 분해를 방지하기에 충분하지 않다. 따라서,이 분해에 형성되는 백색 고체를 사용하기 전에 긁어되어야 할 수있다. </li><li> 건조 DMF (0.17 ㎖)에 트리 부틸 피로 인산 용액 및 새로 증류 부틸 준비 (58 μl를, 분 자체를 추가하지 않습니다). 반응 혼합물 (백색 침전물이 나타나지만 빨리 사라)로 생성 된 용액을 추가 45 분 동안 실온에서 반응하도록 허용한다. </li><li> 요오드의 용액을 피리딘 (0.16 밀리몰) (0.98 ㎖) 및 H 2 O (20 μL)을 준비하고 (III) 중심 Pα를 산화시키기 위해, 반응 혼합물에 추가한다. 생성 된 짙은 용액은 실온에서 30 분 동안 교반하도록 허용. </li><li> I 2 과잉을 해소하기 위해 NAS 2 O 3의 10 % 수용액을 사용합니다. 진공 하에서 용매를 제거 하였다 (회전 증발기의 수조의 온도는 30 ℃ 이하로 유지되어야한다). H 2 O (5 ㎖)을 추가하고 MI에게 허용환상 인산 잔기를 가수 분해 실온에서 30 분 동안 서서 xture. </li><li> 이 단계에서, 보호기는 일반적으로 (3&#39;-OAC 및 핵 염기의 측쇄에 개 즉) 제거된다. 결과적으로, 조 질의에 NH 4 OH (H 2 O, 10 ㎖의 30 %)을 추가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 교반하고, 진공하에 용매를 제거한다. </li><li> 2 튜브에 H 2 O 및 분할의 2 ML을 추가합니다. 30 분 동안 아세톤 원심 분리 (1,000 XG)에서 차아 염소산 나트륨 4의 2 % 용액의 12 ML을 추가합니다. 이 절차를 한 번 더 반복한다. 침전물을 따라서 실질적으로 계속되는 RP-HPLC 정제를 단순화 (침전 것) 트리 포스페이트로부터 합성에 사용되는 용매 및 시약의 분리를 허용한다. </li><li> 유성 잔류 공기 건조 후, (표준 절차에 따라 재료 및 그림 3의 또한 목록 참조) 원유의 31 P-NMR 스펙트럼을 기록하고4 ML의 H 2 O에 용해 주 :이 합성 절차는 주로 개질 옥시 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트의 생성에 초점을 맞추고 있지만, 매우 유사한 절차 (단순히, 3&#39;-비스-O-아세틸 화 된 전구체 &#39;2를 사용하여) 자신의 RNA 대조를 위해 적용될 수있다. </li></ol> 2. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 H​​PLC 정화 <ol><li> 트리 에틸 암모늄 바이 카보네이트 (TEAB)의 1 M 스톡 용액의 제조 : 40 <ol><li> 증류시키고 여과 H 2 O.의 ≈ 600 ㎖에 트리 에틸 아민 1 몰 (139 ㎖)의 용액을 준비 </li><li> 거품 이산화탄소 (드라이 아이스와 가스 버블을 통해) 격렬하게 교반하면서 용액에 7.6의 pH가 (이 적어도 10 시간이 소요됩니다)에 도달 할 때까지. 이 원액은 최대 1 달 동안 냉장고에 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 정화 : <ol><li> 초순수에 50 mM의 TEAB 2 L (용출액 A) : 1 M 주식에서 두 개의 버퍼 용액을 준비차 50 %의 MeCN (용출액 B)에서 50 mM의 TEAB 1 L. 두 용리액 진공하에 20 분 동안 교반 드가이 (세심한주의가 탈기 중에 CO 2를 제거하여 pH를 변경하지 않도록 요구된다.) </li><li> 300 ㎕의 증류수 H 2 O의 원유 인산의 10 μl를 용해하여 분석 샘플을 준비하고 반 예비 RP 컬럼 (C18)을 탑재까지 그라데이션을 사용하여 HPLC 시스템에 주입 40 분의 0 ~ 100 % B에서 (그림 4). 인산의 R 티셔츠 (일반적으로 크로마토 그램의 주 피크 인)와 (약간 낮은 R 티셔츠가) 인산에 따라 HPLC 프로그램을 조정합니다. 이러한 조건과 약간의 인산을 포함 할 수 있습니다 초기 분수를 제거를 사용하여 조 혼합물을 정제. </li><li> 생성물을 포함하는 모든 분획을 합하고 동결 건조 (원하지 diphosph로 가수 분해를 최소화하기 위해, 회전 증발기에서 증발되는 것이 바람직) 먹었다. (용리액에서 남은 트리 에틸 아민을 제거하기 위해) 초순수 여러 번 공 증발. NMR에 의한 인산의 순도 표준 프로토콜의 응용 프로그램 (1 H와 31 P의 NMR 모두) 및 MALDI-TOF (그림 5 참조) 평가합니다. 이 프로토콜의 애플리케이션에 의해 얻어지는 전형적인 수율은 일반적으로 기판에 따라 30-70 %의 범위에 놓여. </li></ol></li></ol> 3. 뇌관 확장 반응과 TDT 중합 <ol><li> 프라이머의 5&#39;-말단 라벨링 <ol><li> 프라이머 30 pmol의 혼합 (예 : P1, 재료 목록) 배 폴리 뉴클레오티드 키나제 (PNK) 버퍼, γ-[32 P] ATP, PNK 1 μL, 그리고 DDH 2 O 3 μL (용의 4 μL와 40 μl의 총 반응 부피). 30 분 동안 37 ° C에서 반응 혼합물을 품어 후 키나제 (70 ° C에서 10 분) 열 비활성화합니다. </li><li> 라벨 반응 준비 중실란 화 된 유리 섬유와 1 ㎖ 피펫 팁을 연결하고 G10 솔루션 (DDH 2 O 10 %, 멸균)과 팁을 작성하여 G10 세파 덱스 컬럼. 스핀 다운 및 500 μL의 DDH 2 O 50 μL의 DDH 2 O. 한 최종 세척로 3 회 세척 (무료 방사성 라벨을 제거하기 위해) G10을 통해 반응 혼합물을 실행합니다. </li><li> 젤 (PAGE 20 %) 방사성 동위 원소 표지 된 프라이머를 정화하고 호감을 적용하여 복구 (15)에 대해 72 ° C에서 1 % LiClO 4, 1 mm 순중량 3 (산도 8)을 함유하는 수용액 500 μL와 방법 (즉, 용출을 흡수 분). 에탄올 침전 및 G10은 용출 올리고 뉴클레오티드를 탈염. </li></ol></li><li> 프라이머 신장 반응 <ol><li> 단련 한 방사성 동위 원소 표지 된 프라이머 P1의 pmol의 10 pmol의 프라이머 P1, 10 (사용되는 효소의 공급 업체에서 제공) 10 배 반응 버퍼에서 템플릿 T1 (자료 목록)의 pmol의 t을 배치하여우베 뜨거운 (90 ~ 95 ° C) 물에 서서히 (45 분 이상) 실온까지 냉각 할 수 있도록하여. </li><li> 얼음에 튜브를 넣고 (다시)의 dNTP 칵테일 추가 (수정과를 모두 포함을 자연 트리 포스페이트, 100 μM 최종 농도)와 DNA 중합 효소의 1 U (엑소 (환기 - 클레 나우, PWO 또는 11 ° N) m)와 20 μL의 총 반응 부피를위한 물 ()를 완료하십시오. (-)를 사용하고 공기 빼기 (엑소 30 분 동안 예를 들어, 60 ° C) 효소의 최적의 작동 온도에서 배양한다. </li><li> 스톱 솔루션 (포름 아미드 (70 %), 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 50 mM의), 브로 모 페놀 블루 (0.1 %), 자일 렌 cyanol (0.1 %))의 20 μl를 추가, 샘플 (95 ° C, 5 분) 가열, 냉각 아래로 (0 ° C), 및 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기를 변성하여 해결할 수 있습니다. phosphorimager으로 시각화. </li></ol></li><li> TDT 중합 <ol><li> 단일 가닥의 7 pmol의 희석레이블이 지정되지 않은 프라이머 P2 (자료 목록), 1 μL의 TDT 버퍼 10 배의 방사성 동위 원소 프라이머 1 pmol의. </li><li> 얼음에 튜브를 넣고 (다시) (10 및 200 μM 사이를 포함 적절한 농도)의 dNTP 칵테일 및 TDT 중합 효소 (4 U)를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 정지 용액 10 μl를 추가, 샘플 (95 ° C, 5 분) 열 (0 ° C)를 냉각, 및 (PAGE 15 %) 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기를 변성하여 해결할 수 있습니다. phosphorimager으로 시각화. </li></ol></li></ol> 4. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트와 PCR <ol><li> 모두 앞으로의 8 pmol의 혼합 및 증폭되는 템플릿의 0.5 pmol의와 역방향 프라이머. 10X 반응 버퍼 (200 μM 최종 농도)의 dNTP 칵테일을 추가하고 얼음에 튜브를 넣어. 20 μL의 최종 볼륨에 도달 한 DNA 중합 효소의 U와 H 2 O를 갖춘 추가. PCR 유리 병에 혼합물을 전송하고 30 PCR주기를 실시하고 있습니다.</li><li> 배 크로스로드 버퍼의 10 μL와 10 μl를 희석하고 전기 영동 (에티 디움 브로마이드로 염색) 아가로 오스로 2 %를 해결할 수 있습니다. phosphorimager으로 시각화. </li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

핵산에 수정이 포함되어 있다고 안티센스 및 antigene 에이전트의 개발 42, 43, 라벨 및 올리고 뉴클레오티드 (41)의 기능 태그 등 다양한 실제 응용 프로그램에 대한 관심, 그리고 유전 알파벳 44-46을 확장하기 위해 노력합니다. 화학 변경 및 작용기는 일반적으로 표준 자동화 고체 상 합성 프로토콜을 적용하여 핵산에 도입된다. 그러나, 포스 빌딩 블록은 다시 화학적 기능 (47)의 특성에 심각한 제한을 부과하는이 방법에 의해 부과 오히려 가혹한 조건에 반발 할 필요가있다. 유일한 제한은 그들이 중합 효소 1,2 기질 역할을하는 것이 있기 때문에 대신 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 효소 - 매개 중합, 기능의 넓은 범위를 도입 할 수 있습니다. 세대의 눈에 부족하다하더라도erally 적용 방법론, 신뢰성과 강력한 합성 및 분석 방법이 수정의 dNTPs의 합성을 위해 개발되었습니다. 또한, 때문에 자신의 고...

<html> 5&#39;-뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 ((D) NTPS)는 에너지의 보편적 인 통화되는 세포 물질 대사의 규제에 이르기까지 수많은 프로세스와 기능에 관련된 중요한 생체 분자의 종류를 나타냅니다. 이러한 기본적인 생물학적 변환에서의 역할뿐만 아니라, 자신의 수정 된 대응은 올리고 뉴클레오티드에 작용기의 도입에 대한 다양하고 가벼운 플랫폼, 잘 일반적으로 1,2 적용되는 자동화 된 고체상 합성을 보완하는 방법으로 전진했다. 사실, (D) NTPS은 RNA와 DNA 중합 효소 3 기판, 아미노산 4-13, 보론 산 14, 15, nornbornene 16, 다이아 몬도와 같은 잔류 17 일에 대한 사이드 체인 등의 기능 그룹의 풍부한 역할을 할 수 제공 organocatalysis 18 담즙산 19, 심지어 올리고 뉴클레오티드 (20)는 올리고 뉴클레오티드에 도입 될 수있다. _content &quot;&gt; 핵산의 작용에 편리한 벡터를 나타내는 외에도, 수정의 dNTPs는 SELEX 및 수정 된 촉매 핵산 21-30과 다양한 실제 응용 프로그램 (10)에 대한 압 타머의 생성을위한 체외 선택 기타 관련 조합 방법에 종사 할 수있다 31-36. 수정의 dNTPs의 중합에 의해 도입 된 추가 사이드 체인은 선택의 실험 기간 동안 탐험 핵산 (37)의 다소 빈약 한 기능의 무기고를 보충 할 수있는 화학 물질 공간을 늘릴 생각된다. 그러나 이러한에도 불구하고 매력적인 특성과 합성 및 분석 방법 모두의 개발에서 만든 최근의 진보, 보편적으로 적용 가능하고 높은 항복 절차는 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 2.38의 씁니다 존재합니다. 이 의정서의 목적은 (때로는) 복잡한 절차 선도 t으로 빛을 발산하는 것입니다오 합성이 활성화 빌딩 블록 (그림 1B)의 생화학 적 특성. 특별한 강조가 종종 발견하기 어려운 또는 실험 섹션에 존재하지만 순수한 (D) NTPS의 분리 (그림 1)에 이르는 합성 경로의 성공적인 완료에 아직 중요한 모든 합성 세부 사항에 대해 설명하기로한다.

<table><tbody><tr><td>트리부틸암모늄 피로인산염&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8533</td><td>흡습성 고체, Ar</td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one 아래에 보관&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>324124</td><td>수분 민감성</td></tr><tr><td>피리딘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82704</td><td>분자체</td></tr><tr><td>Dioxane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296309</td><td>분자체</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40248</td><td>분자체</td></tr><tr><td>Acetonitrile&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>트리에틸아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>90342</td><td></td></tr><tr><td>트리부틸아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>90781</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>탈이온화 및 정제수, 디에틸피로카보네이트(DEPC</td></tr><tr><td>)디에틸피로카보네이트(DEPC)</td><td>시그마 알드리치</td><td>159220</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>케임브리지 동위원소 연구소, Inc.</td><td>DLM-4-25</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-[32P]-ATP</td><td>Hartmann Analytics</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>Natural dNTP</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td></td></tr><tr><td>Vent (exo-) DNA 중합</td>효소 <td>NEB</td><td>M0257S</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I, 대형(Klenow) 단편</td><td>NEB</td><td>MO210S</td><td></td></tr><tr><td>9&deg; Nm DNA 중합효소</td><td>NEB</td><td>MO260S</td><td></td></tr><tr><td>말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)</td><td>Promega</td><td>M828A</td><td></td></tr><tr><td>Pwo DNA 중합효소</td><td>Peqlab</td><td>01 01 5010</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Thermo Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스아크릴아미드(19:1, 40%)</td><td>Serva</td><td>10679.01</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>아폴로 사이언티픽</td><td>BIA1177</td><td></td></tr><tr><td>G10 Sephadex</td><td>시그마</td><td>G10120</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>아폴로 사이언티픽</td><td>BIU4110</td><td></td></tr><tr><td>목성 반분취 RP-HPLC 컬럼 (5&#956; C18 300 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Q Thermal Cycler</td><td>Bioconcept</td><td>BYQ6042E</td><td></td></tr><tr><td>PCR 바이알</td><td>Bioconcept</td><td>3220-00</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 시스템</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td></td><td>&Auml; kta basic 10/100</td></tr><tr><td>모든 올리고뉴클레오티드는 Microsynth에서 구입하여 PAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-CAAGGACAAAATAC 로 정제했습니다.
CTGTATTCCTT P1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-GACATCATCATGAGAGA 
CATCGCCTCTGGGCTA 
ATAGGACTACTTCTAAT 
CTGTAAGAGCAGATCC 
CTGGACAGGCAAGGAA 
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&#039;-GAATTCGATATCAAG P2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">실험 절차 및 장비에 대한 자세한 내용은 다음 문서에서 확인할 수 있습니다. 
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 
Org. 바이오몰. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F</td></tr></tbody></table>

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

화학 작용기의 도입을위한 전통적인 전략은 초기 체인 적절히 변경됨 포스 전구체를 추가하여 고상 합성을 사용하는 것이다. 그러나 오히려 짧은 시퀀스 합성 중에 사용 제한 조건이 방법론의 적용을 방해. 한편, 변형 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트는 핵산, 실제 응용의 광범위한 팔레트 변경됨 핵산의 사용을 위해 도로를 포장 전략으로 수많은 작용기 마일드 도입에 이용 된 빌딩 블록을 활성화 이러한 리보 자임하고 DNAzymes의 기능 태그 및 생성 등. 주요 과제 중 하나는 이러한 뉴 클레오 시드 유사체의 분리 및 특성에 이르는 방법론의 복잡함에 있습니다. 이 비디오 문서에서는, 우리는 살전의 합성에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다전자 인 (III) 기반의 시약을 사용하여 유사체를 수정했습니다. 또, 생화학 적 특성 규명을위한 절차는 프라이머 신장 반응 및 TDT 테일링 중합에 중점으로, 누설된다. 이 상세한 프로토콜은 수정의 dNTPs 크래프트 조합 및 화학 생물학에서의 추가 사용을위한 사용이 될 것입니다.

그들은 핵산 (41)에 작용기의 광대 한 배열의 손쉬운 도입을 허용 이후 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 합성 목표를 매혹됩니다. 그러나, 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 분리 및 특성 규명은 종종 힘든 것으로 밝혀진다. 따라서, 여기에 기술 된 결과를 상기 합성, 생화학 적 절차 (그림 1B) 내에서 여러 단계를 수행하기 위해 도움의 손길을 제공 할 것으로 생각된다. 특히,도 3은 인 센터의 특성상 신호 (즉, 관찰 될 수있는 변성의 dNTP 전형적인 조 (31) P-NMR 스펙트럼 (특히이 경우 하위 사용자 BPU TP (4) (18),도 2)을 나타낸다 -5.02 (P의 γ)에 이중 어, -10.44 (P의 α)에서 이중선 및 -20.55 ...

여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

이 비디오의 전반적인 목표는 변형된 뉴클레오시드 인산염의 합성부터 완전한 생화학적 특성화에 이르는 절차를 시연하는 것입니다. 이는 먼저 4단계 1포트 절차의 적용에 의해 적절하게 보호된 뉴클레오시드 전구체를 해당 tri phosphate로 전환함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 생성된 인산트리포스페이트를 먼저 침전으로 정제한 다음 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하는 것입니다.다음으로, 트리 포스페이트 아날로그는 핵 자기 공명 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 또는 NMR 및 maloff를 특징으로 하여 고순도를 보장합니다. 마지막 단계는 프라이머 확장 반응과 말단 데옥시 뉴클레오티드 전이효소 또는 TDT 중합 반응입니다. 궁극적으로, 반응 생성물, 및 따라서 tri phosphate의 기질 수용은 겔 전기 영동에 의해 분석됩니다.Borge 접근법과 같은 다른 합성 전략과 비교했을 때 이 방법의 장점은 부산물이 더 적게 형성되어 정제가 더 쉽다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 여러 분야의 지식이 필요한 상당히 길고 복잡한 절차이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 우리는 변형된 인산염을 합성했을 때 이 방법을 촬영한다는 아이디어를 처음 떠올렸고 자세한 절차를 찾는 것이 다소 어렵다는 것을 알게 되었습니다.이 방법의 또 다른 장점은 변형 핵산 분야의 다른 질문을 해결하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 실제로, 광범위한 반응을 촉매하는 DNA 효소를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 핵산의 기능적 태깅에 사용될 수 있다.이 방법의 시각적 시연은 합성 및 정제 단계를 배우기가 어렵기 때문에 매우 중요한데, 이는 tri phosphates가 주의해서 다루어야 하는 극성 및 활성 유도체이기 때문입니다. 먼저 적절하게 3프라임 하이드록실 보호 뉴클레오시드를 2밀리리터의 무수 퓨린으로 두 번 공동 증발시킨 후 밤새 진공 상태에서 건조합니다. 동시에, 다음 날 밤새 진공 상태에서 건조 재판소 피로 인산 암모늄은 최소 200 마이크로 리터의 건조 피리딘에 뉴클레오 시드를 용해시켰다.그런 다음 400마이크로리터의 건조 다이옥산을 COS 용매로 추가합니다. 마지막으로 고리형 인 3 유도체를 첨가하고 실온에서 45 분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 170 마이크로 리터의 건조 디메틸 포름 아미드와 58 마이크로 리터의 갓 증류 된 트리 부틸 아민에 건조 부틸 암모늄 피로 인산염 용액을 준비합니다.생성된 용액을 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 45분 동안 반응시킵니다. 그런 다음 980 마이크로 리터의 퓨린과 20 마이크로 리터의 물에 160 마이크로 몰의 요오드 용액을 준비합니다. 반응 혼합물에 용액을 첨가합니다.알파 인 중심을 산화시키기 위해. 생성된 어두운 용액을 실온에서 30분 동안 저어줍니다. 과도한 요오드를 담금질하기 위해 10% 티오황산나트륨 수용액을 사용하십시오.진공 상태에서 용매를 제거하십시오. 그런 다음 물 5ml를 넣고 혼합물을 실온에서 30분 동안 방치하여 고리형 인산 삼인염 물질을 가수분해합니다. 이 단계에서는 일반적으로 보호 그룹이 제거됩니다.결과적으로, 30% 이모듐 하이드록사이드를 미처리 샘플에 첨가하십시오. 진공 상태에서 용매를 제거하기 전에 실온에서 1.5시간 동안 저어줍니다. 다음으로 물 2ml를 넣고 혼합물을 튜브 튜브로 나눕니다.절차를 반복하기 전에 아세톤과 원심 분리기에 염소산염당 12%나트륨 용액 2ml를 30ml 추가합니다. 또 한 번. 인산트리(tri phosphate)로부터의 합성에 사용된 시약은 침전되어 유성 잔류물을 형성하고 용매의 분리를 허용하며, 따라서 유성 잔류물의 공기 건조 후 후속 역상 HPLC 정제를 실질적으로 단순화합니다.표준 절차에 따라 미처리 샘플의 P 31 NMR 스펙트럼을 기록합니다. 다음 NMR은 4 밀리리터의 증류수에 기름진 잔류 물을 용해시켰다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 초순수에서 EENT A로 50밀리몰의 트리에틸 암모늄 바이카보네이트와 EENT B로 50% 아세틸 니트릴을 준비하여 HPLC 정제를 시작하고 진공 상태에서 EENT를 모두 제거하고 20분 동안 교반합니다.10마이크로리터의 원트리포스페이트를 300마이크로리터의 증류수에 용해시켜 분석 샘플을 준비합니다. 그런 다음 40분 안에 0%B에서 100%B 범위의 그래디언트를 사용합니다. 반분취용 역C 18상 컬럼이 장착된 HPLC 시스템에 시료를 주입합니다.tri phosphate 및 diphosphate의 체류 시간에 따라 HPLC 프로그램을 조정하십시오. 이러한 조건을 사용하여 조잡한 혼합물을 정제하고 약간의 이인산을 포함할 수 있는 초기 분획을 제거하여 제품을 포함하는 모든 분획을 결합하고 동결 건조합니다. 그런 다음 초순수로 여러 번 공동 증발합니다.표준 프로토콜의 적용을 통해 NMR 및 maloff에 의한 tri phosphate의 순도를 평가합니다. 이 프로토콜의 적용으로 얻어진 전형적 수율은 30 내지 70%의 범위에서 5 프라임과 프라이머의 라벨링을 위한 기판에 따라 달라집니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 프라이머와 시약을 혼합하고 라벨링 반응을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.라벨링 반응 중에 1ml 피펫 팁을 사일로화된 유리솜으로 연결하고 팁을 G 10 용액으로 채워 G 10 cidex 컬럼을 준비합니다. 500마이크로리터의 이중 증류수로 3번 세척하고 50마이크로리터의 이중 증류수로 마지막으로 한 번 세척합니다. 라벨링 반응의 배양 후, 섭씨 70도에서 10분 동안 키나아제를 가열하여 비활성화합니다.다음으로, G10을 통해 반응 혼합물을 실행합니다. 유리 방사성 라벨 겔을 제거하려면 무선 라벨링 프라이머를 정제하고 크러쉬 및 담금 방법, 에탄올 침전 및 G 10의 적용을 통해 회수합니다. 프라이머 확장 반응을 위해 방사선 표지된 프라이머 PICA 몰 1개, 프라이머 P 1 10 PICA 몰, 템플릿 P 1 및 10 PICA 몰, T 1 in 10 x 반응 완충액을 결합하고 뜨거운 물에 무릎을 꿇습니다.그런 다음 45분에 걸쳐 실온으로 서서히 식힙니다. 튜브를 얼음에 넣고 뉴클레오시드 인산염 또는 DNTP 칵테일과 DNA 중합효소 얼음 1개를 추가합니다. 총 20 마이크로 리터 부피에 대한 물과의 반응을 완료하고 효소의 최적 작동 온도에서 배양합니다.그런 다음 20마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다. 식히면 샘플이 섭씨 0도에서 내려갑니다. 변성 많은 아크릴아미드 젤 전기 이동법에 의해 결심하기 전에.TDT 중합을 위한 phospho 이미저로 밴드를 시각화하고, 1마이크로리터의 TDT 버퍼에서 단일 가닥 비표지 프라이머 P 2 및 무선 표지 프라이머를 희석합니다. 튜브를 얼음에 넣고 DNTP 칵테일과 TDT 중합효소를 넣은 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 시료를 섭씨 95도에서 5분 동안 가열한 다음 섭씨 0도에서 냉각하기 전에 정지 용액 10마이크로리터를 추가합니다.변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 샘플을 분해한 후 phospho 이미저를 사용하여 밴드를 시각화합니다. 여기에 도시된 것은 인 중심의 특성 신호가 관찰될 수 있는 변형된 DNTP의 전형적인 조잡한 P31 NMR 스펙트럼이다. 또한, 이인산(diphosphate) 및 일인산(monophosphate) 측에서 유래한 신호.더 높은 인산염과 함께 제품은 항상 이 단계에서 관찰됩니다. 조질 혼합물의 역상 HPLC 분석이 여기에 나와 있습니다. 주요 피크는 5개의 프라임 인산염에 해당하며, 주요 부산물인 5개의 프라임 디포스페이트는 약간 더 낮은 머무름 시간을 나타냅니다.마지막으로, 철저한 역상, HPLC 정제 후, 변형된 DNTP는 NMR 및 maldi를 특징으로 하여 여기에 도시된 것은 sulfa ide, 변형된 DUTP 아날로그의 maloff 스펙트럼이다. 나트륨 부가물은 712.54의 질량 과충전에서 볼 수 있으며 이인산의 흔적은 없습니다. P 31 NMR과 양성자 NMR 스펙트럼은 모두 변형된 dps의 순도를 평가하는 데 중요합니다.바람직하지 않은 염료 및 모노 포스페이트의 존재는 예시된 독특한 신호를 제공하기 때문에, 다음은 트랜스 프롤린 변형 DUTP 히스타민 변형 DATP 및 발레르산 변형 DCTP를 사용한 1차 확장 반응의 결과입니다. 마지막으로, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 다양한 변형된 DUTP 유사체를 사용한 대표적인 TDT 매개 중합 반응을 분석했습니다. 이러한 맥락에서 cis 프롤린 변성 DUTP 및 펩타이드 변성 DUTP는 TDT에 가장 적합한 기질입니다.테일링 효율이 자연 DTTP와 비슷하거나 능가하기 때문에 요소 개질 DUTP는 이러한 맥락에서 다소 불량한 기질입니다. 폴리 분산이 적기 때문에 더 긴 크기의 올리고뉴클레오티드를 관찰할 수 있습니다.일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 약 1주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 핵 cytric 인산염은 자연의 활성화된 구성 요소이므로 생성된 후 취급할 때 주의를 기울여야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다.핵산 분야의 연구자들은 이 방법을 사용하여 변형된 abers 및 촉매 핵산을 생성하기 위한 조합 선택을 탐색합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 4단계 1pop 절차를 사용하여 변형된 인산염을 합성하고 특성화한 후 역상 HPLC 정제 및 1차 확장 반응을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 실험 섹션에서 찾을 수 없는 몇 가지 실험 세부 사항이 분명해집니다.이 방법은 PCR과 같은 다른 기술과 함께 사용하여 추가 질문에 답변하는 데 사용할 수 있습니다. 실제로, 이는 VIO 선택 방법과의 변형된 tri phosphates의 호환성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

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이 기사는 C2'- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다.

2&#39;- 포스 핀 올리고 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고머의 고상 합성을위한 프로토콜<em&gt; O</em&gt; 원형 이색 성을 통한 - 티오 페닐 메틸 변형 및 특성 분석

여기, 우리 제시이 당 nucleosides의 합성에 대 한 프로토콜을 통해 ribonucleosides의 regioselective Oglycosylation에 의해의 임시 보호 그들의 2', 3'-diol moieties 주기적 boronic 에스테 르를 이용 하 여. 이 메서드는 아데노신, guanosine, cytidine, uridine, 5-methyluridine, 5-fluorouridine을 주고 해당이 당 nucleosides 등 여러 보호 nucleosides에 적용 됩니다.

Regioselective O-Glycosylation Nucleosides 통해 는 임시 2', 3'-Diol 보호 Boronic 에스테 르에 의해이 당 Nucleosides의 합성에 대 한의

NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.

화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

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HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

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올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

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루테늄의 시리즈의 합성, 특성 및 반응성<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; 박사</sup&gt; 단지

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뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

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