생체 가교 접근 초파리 태아

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 내 가교 결합(in vivo cross-linking)법을 사용하여 살아있는 초파리 배아로부터 단백질 복합체를 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 수천 마리의 초파리를 집단 케이지에 넣고 초기 배아를 수집합니다. 그다음, 포름알데히드를 이용하여 단백질을 생체 내에서 가교 결합시키며, 이를 통해 내부의 단백질 복합체를 안정화합니다.

그 다음, 단백질 복합체를 면역침강시킬 수 있도록 가교 결합된 배아로부터 단백질 추출물을 준비합니다. 결과는 Western blot 분석을 통해 분리된 단백질 복합체를 식별합니다. in vitro 접근법을 이용한 전통적인 단백질 복합체 분리와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 이 in vivo 접근법을 통해 전통적인 in vitro 방법으로는 검출되지 않을 수 있는 일시적이지만 기능적으로 중요한 단백질-단백질 상호작용을 포착할 수 있다는 점입니다.

실험 기법 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Min Gao가 진행하겠습니다. 먼저 물과 fly agar를 교반 바(stir bar)를 사용하여 섞습니다. 멸균기 작동 중에 이 혼합물을 오토클레이브로 멸균합니다.

사과 주스에 sucrose를 섞고 핫플레이트에서 70°C로 가열합니다. 이후, 혼합물들을 합치고 agar가 응고되기 전 15분 동안 식힙니다. 에탄올에 methyl four hydroxy benzoate를 새로 조제합니다.

이것은 보존제입니다. 이를 응고 혼합물에 넣고 5분 동안 저어 섞습니다. 그런 다음, 기포가 생기지 않도록 혼합물을 300 square centimeter 크기의 플라스틱 또는 스티로폼 플레이트에 붓습니다.

플레이트를 4°C에서 보관하고 1주일 이내에 사용하십시오. 배아를 수집할 40,000~50,000마리의 파리가 들어 있는 개체군 케이지를 준비합니다. 표면에 약 4g의 베이커스 효모를 뿌린 신선한 cornmeal molasses 충전 플레이트 두 개를 개체군 케이지에 부착하십시오.

초파리를 이 플레이트에서 25 °C로 48시간 동안 배양합니다. 이틀 후, 약 1g의 효모를 두 개의 사과 주스 한천 플레이트에 뿌리고, 개체군 케이지 내의 플레이트를 이 플레이트들로 교체합니다. 한 시간 후, 케이지 내의 플레이트를 동일한 종류의 새 플레이트 두 개로 다시 교체합니다.

초파리가 1시간 동안 사용한 두 개의 수집 플레이트에는 배아가 채워져 있을 것입니다. 플레이트 위의 배아와 물을 현탁시킨 후, 붓을 사용하여 배아가 떨어지도록 돕습니다. 그런 다음 2층 체에 부어 걸러냅니다.

상층은 850 micron 강철 메쉬이며, 하층은 75 micron 강철 메쉬입니다. 배아는 더 고운 메쉬 위에 수집되며, 붓을 사용하여 거친 부스러기들로부터 분리합니다. 배아를 50 milliliter 원추형 튜브 상단으로 만든 고운 나일론 메쉬 바스켓으로 옮깁니다.

배아를 물로 헹군 후 메쉬를 사용하여 페이퍼 타월 위에서 건조시킵니다. 다음으로, 배아를 50% 표백제 용액에 3분 동안 담급니다. 표백제 내에서 배아를 가볍게 흔들어준 후, 물로 충분히 헹구고 흡수시켜 건조합니다.

다음으로 배아를 이소프로판올에 약 15초 동안 담급니다. 용액을 부드럽게 흔들어 배아 덩어리를 분리시키며, 이 과정은 30초를 초과하지 않아야 합니다. 배아의 수분을 닦아낸 후 헵탄 용액으로 옮겨 5분 동안 둡니다.

배아들이 뭉치지 않도록 헵탄을 배아 위에 자주 피펫팅하고, 배아의 수분을 제거한 후 PBST로 헹굽니다. 배아를 3분 동안 헹군 후, 메쉬를 이용해 10 mL의 PBST가 담긴 15 mL 튜브로 옮깁니다. 메쉬를 제거하여 배아를 용액 속에 남겨두고, 배아의 양이 100에서 300 µL 사이가 되는지 확인합니다.

바닥에 가라앉히고, PBST를 흡입하여 제거한 후 즉시 배아를 교차결합시키기 위한 교차결합 과정을 진행합니다. 먼저, 갓 제조한 0.2% formaldehyde PBST 10 milliliters를 배아에 첨가합니다. 25 degrees Celsius에서 10분 동안 부드럽게 흔들어주며 배양합니다.

10분 동안 반응시킨 후, 배아가 가라앉을 때까지 기다렸다가 용액을 제거합니다. 그다음 반응을 정지시키기 위해 용액을 0.25 M glycine/PBST 10 mL로 빠르게 교체합니다. 튜브를 사용하여 5분 더 흔들어 줍니다. 반응 정지 후, 용액을 제거하고 10 mL의 PBST를 사용하여 배아를 3회 세척합니다.

남은 PBST를 피펫 흡입으로 제거하고, 배아를 필요한 시점까지 -80 °C에서 보관하십시오. 다운 균질기(down homogenizer)와 2 mL의 용해 버퍼를 사용하여 가교 결합된 배아 500 µL를 균질화합니다. 이때 촘촘한 페스틸(pestle)로 약 15회 정도 스트로크합니다.

용해물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 15분 동안 부드럽게 흔들어 섞이도록 설정합니다. 그런 다음 용해물을 16,000 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.

펠렛은 폐기해도 됩니다. 이제 상청액에 40 µL의 anti ha agros 비드 슬러리를 첨가합니다. 비드 접합이 완료된 후 약 2.5시간 동안 로킹(rocking) 상태로 둡니다.

비드를 2,500 Gs에서 5분 동안 원심 분리하여 침전시킵니다. 튜브에 상층액을 약 250 µL 남기고 비드를 그 안에 재현탁합니다. 현탁된 비드를 스핀 컬럼의 10 micron 필터로 옮깁니다.

12,000 Gs에서 10초 동안 원심분리하여 용액을 제거합니다. 컬럼의 비드를 200 µL의 세척 버퍼로 세척하고 다시 원심분리합니다. 이 과정을 총 3회 반복합니다. 그런 다음 비드에 40 µL의 용출 버퍼를 추가하고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.

이 기간 동안 5분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 유출액을 수집하십시오. 컬럼을 12,000 GS에서 10초 동안 한 번 더 원심 분리합니다. 가교 결합의 효율성과 가교된 두 단백질 복합체의 정제 정도는 3~7% 단계별 젤(step gel)을 이용한 SDS page와 이후의 western blot으로 분석하였습니다. 가교 결합의 정도를 모니터링하고 프로토콜을 위한 다양한 포름알데히드 농도를 테스트하기 위해 HA 태그와 GFP 단백질을 발현하는 배아를 사용하였습니다.

처리된 배아 내 GFP의 대부분은 가교 결합되지 않았으므로, 이러한 현상은 발생하지 않습니다. 무작위로 가교 결합된 이량체 복합체를 가교 결합되지 않은 대조군과 비교하였습니다. 가교 결합되지 않은 두 단백질은 자유롭게 이동하는 285 kilodalton 밴드에서 관찰됩니다.

가교 결합된 형태의 단백질은 분자량이 더 커서 조단백 용해물 내에서 이동 속도가 더 느립니다. 두 단백질 중 약 절반이 생체 내(in vivo)에서 가교 결합되었습니다. HA 펩타이드를 이용한 상호작용 파트너 용출 분석 결과, 비드를 세척한 후 용출 분획에서 복합체 상태와 유리 상태의 단백질이 모두 확인되었습니다.

SDS가 제거되면 대부분의 튜브가 자유 상태가 되며 튜브 복합체는 최소화됩니다. 이 절차 이후, 분리된 복합체 내의 단백질 성분 확인과 같은 방법에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.