Name: 생체 가교 접근 초파리 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 학습하세요 생체 내 가교 접근법을 이용해 Drosophila 태아에서 단백질 복합체를 분리하는 방법을. 이 기술은 전통적인 시험관 내 방법으로는 포착하기 어려운 일시적인 단백질 상호작용을 안정화하여 연구자들이 생체 내에서 유전자 기능을 연구하는 데 도움을 줍니다.

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우리는이 연구와 기술적 도움 요르단 데이비스, 야니 린, 에릭 샤 들러와 Jimiao 청 감사합니다. 이 작품은 ALA에 MCB-1054962에게 부여는 NSF 경력에 의해 지원되었다

1. 큰 사과 주스 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 4 판을 만들려면, 1,000 ㎖의 플라스크에 375 ㎖의의 H 2 O, 12,375 g 플라이 한천 및 교반 막대를 추가합니다. 이 느슨하게 액체 제품에 대해 하나의 30 분 멸균 사이클에 덮인 플라스크의 뚜껑 믹스 A. 오토 클레이브 믹스입니다. </li><li> 500 ㎖ 비커에 125 ㎖의 사과 주스, 12.5 g 테이블 설탕 및 교반 막대를 추가합니다. 믹스의 고압 증기 멸균이 완료 될 때까지 약 70 ° C의 교반 및 온도를 유지하면서 가열 된 플랫폼에서 혼합 B. 열 믹스 B입니다. </li><li> 혼합이 완료되면 고압 증기 멸균, A. 부드럽게 결합 교반 유지 혼합하는 혼합 B를 전송하고 15 분 동안 냉각 할 수 있습니다. 를 통해 냉각 및 방부제를 첨가하기 전에 결과 한천 응고하지 마십시오. </li><li> 에탄올 10 % (중량 / 부피) 메틸 4 - 히드 록시 솔루션을합니다. 이 방부제 역할을합니다. 위의 사과 주스 한천의 혼합물에 용액의 3.75 ML을 추가합니다. anothe 교반 유지5 분 R. </li><li> 각 300cm 2 플라스틱이나 스티로폼 판에 방부제와 125 ㎖의 사과 주스 한천 혼합물을 부어. 이 실온으로 냉각 및 응고 보자. 붓는 동안 기포의 형성을 피할 것. 참고 : 사과 주스 한천 플레이트 즉시 사용할 준비가 된 것입니다. 분명 랩으로 사용하지 않는 접시를 덮고 주까지 4 ℃에서 저장한다. </li></ol> 2. 초파리 배아의 수집 및 사전 가교 처리 <ol><li> 배아가 수집 될에서 약 40,000 ~ 50,000 파리와 인구 케이지를 넣습니다. </li><li> 두 접시 각 매체 (12) 표준 옥수수 가루-당밀 125 ㎖에 포함을 확인하고 각각의 접시에 건조 빵 효모의 약 4g을 뿌린다. 파리를 살찌하는 48 시간을위한 25 ° C의 배양기에서 인구 케이지에이 판을 놓습니다. </li><li> 25 ° C.에 따뜻한 2 사과 주스 한천 플레이트 각 건조 빵 효모의 약 1g을 뿌려판. 0-1 시간 된 배아를 수집을 시작하는 인구 케이지의 2 판을 놓습니다. </li><li> 1 시간 수집의 끝에서 접시를 꺼내. 컬렉션의 또 다른 라운드가 필요한 경우 2 개의 새 번호판으로 교체합니다. </li><li> 플레이트를 커버하고 미세한 페인트 브러시로 부드럽게 배아를 재현 탁하기에 충분한 물을 추가합니다. 스테인리스 철망으로 만들어진이 층 체를 재현 탁 배아를 붓는다. 참고 : 상단 층이 배아를 통해시키면서 큰 플라이 부분을 수집 매체의 기공 크기 (850 μm의) 메쉬 만든다. 바닥 층은 효모와 물을 통해시키면서 배아를 수집 미세 메시 (75 μM)로 만든다. </li><li> 50 ML 튜브 및 미세 나일론 메쉬로 만든 컬렉션 바구니에 수집 된 배아를 전송하는 미세 페인트 브러시를 사용합니다. 물로 간단히 배아를 씻어 후 건조 종이 타월에 메쉬를 얼룩. </li><li> 3 분 동안 부드러운 소용돌이와 50 %의 표백제에서 배아를 담근다. 철저한 린스LY 물에 남아있는 표백제를 제거합니다. 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히. </li><li> (이것은 이상 30 초를 복용해서는 안된다) 15 초 동안 교반과 이소프로판올 또는 다중 배아 덩어리의 붕괴까지 dechorionated 배아를 담가. 완전히 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히. </li><li> 재 부유를 유지하기 위해 배아에 헵탄을 스트리밍 할 수있는 피펫을 사용하는 동안 5 분 헵탄의 배아를 담근다. 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히. </li><li> 3 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100 (PBST)를 포함하는 인산염 완충 생리 식염수, 산도 7.4 (PBS)의 스트림으로 배아를 씻어. </li><li> 컬렉션 바구니를 분해하고 10 ㎖의 PBST를 포함하는 15 ML 튜브에 메쉬와 함께 배아를 전송합니다. 메시 떨어져 배아를 씻어 부드럽게 튜브를 반전. </li><li> 튜브에서 메시를 제거합니다. 수직 위치에 튜브를 넣어 태아가 중력에 의해 튜브의 바닥에 가라 앉을 수 있습니다. 참고 : 약 100-300배아 ㎕의 하나 케이지에서 1 시간 수집을 위해 예상된다. </li><li> PBST를 제거하고 즉시 가교 수행을 계속합니다. </li></ol> 수집 된 배아의 3. 생체 가교 <ol><li> 사용 직전에 PBST에서 0.2 %의 포름 알데히드를 준비합니다. 배아에 포름 알데히드 정착액의 10 mL를 넣고 10 분 동안 회전 진탕 기에서 교반과 함께 25 ° C에서 알을 품다. 하루의 끝에서 사용하지 않는 정착을 폐기하십시오. </li><li> 가교 반응을 켄 칭하고 <ol><li> 가교의 끝에서, 배아는 튜브의 바닥에 가라하자. </li><li> 포름 알데히드 용액을 제거합니다. 즉시 가교 반응을 종결 PBST 0.25 M 글리신 10 ㎖를 추가합니다. 5 분 동안 회전 진탕 기에서 교반과 함께 25 ° C에서 알을 품다. </li><li> 배아가 튜브의 바닥에 가라하자. 급냉 솔루션을 제거합니다. PBST 10 ㎖로 3 회 배아를 씻으십시오. </li><li> 완전히 P에게 제거피펫을 사용하여 BST 세척 솔루션입니다. -80 ° C까지 사용에 보관 배아. </li></ol></li></ol> 4. 단백질 샘플 준비 및 면역 침전 <ol><li> 2 ml의 용해 완충액에 다운스 균질화기를 사용하여 500 μL 가교 배아 균질화 (0.5 M 우레아, 0.01 % SDS, 2 % 트리톤-X 100, PBS 2 ㎜ 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 [PMSF] 및 프로테아제 억제제 칵테일). 참고 : 별도로 명시하지 않는 한 RT에이 다음과 같은 단계를 수행합니다. </li><li> 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 해물을 전송하고 부드럽게 철저한 용해를 보장하기 위해 15 분 동안 회전 플랫폼에 바위. 세포 파편 펠렛 5 분 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기. 깨끗한 15 ML 튜브에 뜨는을 저장합니다. </li><li> 항-HA 아가로 오스 비즈가 뜨는에 슬러리 40 μl를 추가하고 2.5 시간 동안 회전 플랫폼에 품어. </li><li> 5 분 2,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. 뜨는을 제거하지만 APPRO를 남겨튜브 ximately 250 μL. 나머지 상층 액에 구슬을 재현 탁하고 10 μm의 기공 필터를 1.5 ml의 스핀 열을 전송할 수 있습니다. </li><li> 10 초 동안 12,000 XG에 스핀 열을 원심 분리를 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 200 μL 세척 버퍼 (0.1 M 글리신, 1 M의 NaCl, 1 % IGEPAL CA-630, 0.1 % 트윈 20, PBS에있는)를 추가하여 구슬을 씻으십시오. 10 초 동안 12,000 XG에서 열을 원심 분리 및 세척을 버린다. 세척이 더 번 반복합니다. </li><li> 비즈 40 μL 용출 버퍼 (2 ㎎ / ㎖ PBS에서 HA-펩타이드)를 추가하고 교반과 5 분마다 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 10 초 동안 12,000 XG에서 열을 원심 분리기 및 용출액을 수집합니다. </li><li> 항-HA 항체 (13)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의한 복합의 용출을 확인합니다. </li></ol>

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</ol>

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포름 알데히드는 일반적으로 단백질 - 단백질 및 단백질 - 핵산 상호 작용을 식별하기위한 가교제로서 사용되고있다. 함께 하류 질량 분석 절차와 호환성과의 우수한 용해도 및 세포막 투과성은, 세포 내 가교 애플리케이션 3,15-17 알데히드 이상적인 후보 약제 만든다. 특히, 성공적 바사, 초파리 (11)에서 중요한 생식 세포 RNA 헬리 카제와 관련된 mRNA를 식별하는 데 사용되었다. 가까이에 존재하는 단 분자 표적 단백질의 상호 작용 파트너의 특이성을 강화하고, 적절한 조건 하에서 가교 결합 될 수 있음을 의미 시판 가교제들 - (2.7 2.3), 또, 포름 알데히드는 최단 스페이서 아암 중 하나가 여기 . 상술 된 이유로, 포름 알데히드는 우리 프로토콜 가교제로서 선택되었다. 그러나,이 U이 제외 안된다Drosophila의 배아에 대한 생체 내 응용 프로그램의 다른 가교제의 sefulness. 그러나, 우리는 더 명백 TUD는 디티 오...

multisubunit 단백질 어셈블리 및 DNA 또는 RNA-단백질 복합체의 분리는 단백질 복합체, DNA-결합 규제 단백질이나 RNA 결합 단백질의 RNA의 대상으로 인식 게놈 유전자 좌를 식별하기 위해 수행된다. 다른 방법은 특정 RNA 결합 단백질 (CLIP-서열) 2와 관련된 전사 인자 또는 염색질 단백질 (칩 - 서열) 1 RNA의 대상으로 인식 DNA 사이트의 게놈 전체의 식별을 할 수 있습니다. RNA 유래의 cDNA 또는 DNA의 대상 라이브러리는 다음 깊이 순서가됩니다. 이러한 방법은 화학 물질 또는 UV-유도 공부 착체의 단백질 성분에 대한 항체로 면역 침전 (IP)이어서 복합체를 안정화하는 가교를 사용한다. 생물체의 개발 과정에서 많은 단백질 복합체가 일시적으로 형성한다. 따라서, 어플을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생체 내에서 이러한 복합체 조성물 및 기능을 분석하는 데있어 매우 중요elopment. 이 상호 작용하는 구성 요소와 체외에서 세포의 생화학 적 환경의 기본 농도를 재현하는 것은 사실상 불가능하기 때문에 이러한 생체 분석은 체외 방법이 뛰어난 것입니다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 Drosophila의 배아에서 큰 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 생체 내 접근 방식을 보여줍니다. 이 방법에서, 살아있는 배아 단백질 복합체는 저 알데히드 농도 및 후속 또한 단백질 복합체가 행 착체 및 질량 분광 분석의 겔 정제하여 착물의 알려진 성분에 대한 항체와 IP에 의해 절연되어 가교 아르 알 수없는 복잡한 구성 요소를 식별합니다. 포름 알데히드는 세포막을 투과 할 수 있으며, 2.3-2.7 3의 가교 범위를 가지고 있기 때문에, 단백질 복합체는 생체 내에서 가교 결합 될 수 있고, 복잡한 구성 요소는 서로에 근접 할 가능성이있다. 이 문서에 우리의예를 들어 튜더 (TUD) 단백질 복합체의 분리를 사용하여이 방법을 설명합니다. TUD는 생식 개발 4-7 필수적인 생식 단백질이다. 이 단백질은 다른 폴리 펩타이드 8-10의 메틸화 아르기닌 또는 라이신과 상호 작용하는 것으로 알려져 11 TUD 도메인이 포함되어 있습니다. 이전에, 우리는 기능 TUD 5 HA-태그를 표현하기 때문에, 특정 항-HA 항체 가교 후 TUD 단지를 아래로 당겨하는 데 사용되는 형질 전환 초파리 라인을 생성했다. 단백질 - 단백질 가교뿐만 아니라, 포름 알데히드는 핵산 - 단백질 가교를 생성 할 수 및 칩 SEQ 실험에 사용된다. 또한, 초파리, 포름 알데히드 가교 생체 내에서 바사 RNA 헬리 케이즈 단백질 (11)의 RNA 대상의 식별을 허용했다. 이 문서에서 우리는 생체 가교 PUR하는 방법을 설명하는 동안Drosophila의 배아에서 단백질 복합체의 ification,이 방법은 다른 생물과 조직에 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Drosophila 한천</td><td>Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>사과 주스 플레이트가 깨지기 쉬울 수 있으므로 물과 한천 혼합물을 장기간 고압멸균하지 마십시오</td></tr><tr><td>메틸 4-하이드록시벤조에이</td>트 <td>시그마 (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>다른 이름: TEGOSEPT</td></tr><tr><td>개체군 케이지</td><td>플라이스터프 ( http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>파인 나일론 메쉬</td><td>플라이스터프 (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>수집 바구니를 만들 때 단단히 밀봉되도록 매 튜브 캡의 개구부보다 약간 큰 메쉬를 자르</td></tr>십시오 <tr><td>Dounce 균질화 시</td><td>그마 (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td> <td>D8938-1SET</td><td>단백질 분해를 방지하기 위해 사용하기 전에 균질화기를 얼음에 식히고 차가운 용해 버퍼로 미리 헹굽</td></tr>니다<tr><td>. 프로테아제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa</td><td>)4693132001</td><td>PBS는 집중된 프로테아제 억제제 스톡 용액을 준비하는 데 사용될 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Anti-HA 아가로스 비즈</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>이 키트에는 HA-펩타이드와 스핀 컬럼도 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td>HA-펩타이드</td><td>MBL International (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>PBS로 2 mg/ml까지 준비하십시오.</td></tr><tr><td>스핀 컬럼</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>스핀 컬럼은</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td> 키트의 일부로 포함되어 있습니다.<td></td><td></td>BP26324</tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>헵탄</td><td>피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td> <td>AM9625</td>는 <td>사용하기 전에 nanopures로 10X에서 1X에 묽게</td></tr> 한다 <tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>바이오라드 (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>바이오라드 (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>바이오라드 (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드</td><td>시그마(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>이소프로판올에 200mM 원액을 준비한 다음 용해 완충액에서 2mM의 작동 농도로 희석</td></tr>합니다. <tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>15ml 튜브</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox brand</td><td></td><td>동일한 부피의 나노 순수로 희석하여 50% 표백제</td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>만들기 BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>최상층 체</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>바닥층 체</td><td>피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

많은 세포 과정은 multisubunit 단백질 복합체에 의해 제어된다. 자주하는이 단지는 일시적으로 형성하고 조립하는 네이티브 환경을 필요로합니다. 따라서, 이러한 기능성 단백질 복합체를 식별하기 위해서는 세포 용해 및 후속 정제 전의 생체들을 안정화시키는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 Drosophila의 배아에서 대형 선의의 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 용이하게 세포막을 통과 할 수 알데히드의 낮은 농도를 사용하여 생체 내 가교에 의해 배아 내부 복합체 배아 permeabilization과 안정화에 기초한다. 이어서, 관심의 단백질 복합체는 겔 정제하여 질량 분석계로 분석 immunopurified된다. 우리는 생식 개발을위한 필수적인 튜더 단백질 복합체의 정화를 사용하여이 방법을 보여줍니다. 작은 - 튜더 여러 튜더 도메인을 포함하는 큰 단백질이며,표적 단백질의 메틸화 아르기닌 또는 리신과 상호 작용 모듈. 이 방법은 다른 생물과 조직에서 네이티브 단백질 복합체의 분리를 위해 적용 할 수 있습니다.

웨스턴 블롯 하였다 (도 1에 도시) 7 % 단계 겔 (도 2) - 가교 결합의 효과와 가교 TUD 단백질 착물의 정제는 성공적으로 3 %의 SDS-PAGE로 분석 하였다. 3 %를 사용하는 목적 - 7 % 스텝 겔 착물 잔존 미가 교 TUD 단백질 농도에서 가교 TUD 단백질 복합체의 효과적인 분리를 기반으로한다. 상기 우리 생체 가교 조건 하에서, TUD 단백질의 큰 비율은 미가 교 여전히 남아 있었다. 이 무료 TUD 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리 될 때까지 IP 동안 가교 복합체 copurify 것이다. 분명 유지하지 않고 7 % 국경 - 크기가 큰, TUD 단백질을으로 가교 있지만 (285 kDa의)은 3 %에 걸쳐 마이그레이션합니다. 큰 분자량 가교 TUD 단백질 복합체는 어려움이 일의 결과로, 젤 국경을 넘어 이주를해야합니다 반면전자 단지는 무료 TUD 단백질에서 분리, 따라서 &...

다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

다음 실험의 전반적인 목표는 생체 내 가교 결합(in vivo cross-linking)법을 사용하여 살아있는 초파리 배아로부터 단백질 복합체를 얻는 것입니다. 이를 위해 먼저 수천 마리의 초파리를 집단 케이지에 넣고 초기 배아를 수집합니다. 그다음, 포름알데히드를 이용하여 단백질을 생체 내에서 가교 결합시키며, 이를 통해 내부의 단백질 복합체를 안정화합니다.그 다음, 단백질 복합체를 면역침강시킬 수 있도록 가교 결합된 배아로부터 단백질 추출물을 준비합니다. 결과는 Western blot 분석을 통해 분리된 단백질 복합체를 식별합니다. in vitro 접근법을 이용한 전통적인 단백질 복합체 분리와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 이 in vivo 접근법을 통해 전통적인 in vitro 방법으로는 검출되지 않을 수 있는 일시적이지만 기능적으로 중요한 단백질-단백질 상호작용을 포착할 수 있다는 점입니다.실험 기법 시연은 저희 연구실의 박사후 연구원인 Dr.Min Gao가 진행하겠습니다. 먼저 물과 fly agar를 교반 바(stir bar)를 사용하여 섞습니다. 멸균기 작동 중에 이 혼합물을 오토클레이브로 멸균합니다.사과 주스에 sucrose를 섞고 핫플레이트에서 70°C로 가열합니다. 이후, 혼합물들을 합치고 agar가 응고되기 전 15분 동안 식힙니다. 에탄올에 methyl four hydroxy benzoate를 새로 조제합니다.이것은 보존제입니다. 이를 응고 혼합물에 넣고 5분 동안 저어 섞습니다. 그런 다음, 기포가 생기지 않도록 혼합물을 300 square centimeter 크기의 플라스틱 또는 스티로폼 플레이트에 붓습니다.플레이트를 4°C에서 보관하고 1주일 이내에 사용하십시오. 배아를 수집할 40,000~50,000마리의 파리가 들어 있는 개체군 케이지를 준비합니다. 표면에 약 4g의 베이커스 효모를 뿌린 신선한 cornmeal molasses 충전 플레이트 두 개를 개체군 케이지에 부착하십시오.초파리를 이 플레이트에서 25 °C로 48시간 동안 배양합니다. 이틀 후, 약 1g의 효모를 두 개의 사과 주스 한천 플레이트에 뿌리고, 개체군 케이지 내의 플레이트를 이 플레이트들로 교체합니다. 한 시간 후, 케이지 내의 플레이트를 동일한 종류의 새 플레이트 두 개로 다시 교체합니다.초파리가 1시간 동안 사용한 두 개의 수집 플레이트에는 배아가 채워져 있을 것입니다. 플레이트 위의 배아와 물을 현탁시킨 후, 붓을 사용하여 배아가 떨어지도록 돕습니다. 그런 다음 2층 체에 부어 걸러냅니다.상층은 850 micron 강철 메쉬이며, 하층은 75 micron 강철 메쉬입니다. 배아는 더 고운 메쉬 위에 수집되며, 붓을 사용하여 거친 부스러기들로부터 분리합니다. 배아를 50 milliliter 원추형 튜브 상단으로 만든 고운 나일론 메쉬 바스켓으로 옮깁니다.배아를 물로 헹군 후 메쉬를 사용하여 페이퍼 타월 위에서 건조시킵니다. 다음으로, 배아를 50% 표백제 용액에 3분 동안 담급니다. 표백제 내에서 배아를 가볍게 흔들어준 후, 물로 충분히 헹구고 흡수시켜 건조합니다.다음으로 배아를 이소프로판올에 약 15초 동안 담급니다. 용액을 부드럽게 흔들어 배아 덩어리를 분리시키며, 이 과정은 30초를 초과하지 않아야 합니다. 배아의 수분을 닦아낸 후 헵탄 용액으로 옮겨 5분 동안 둡니다.배아들이 뭉치지 않도록 헵탄을 배아 위에 자주 피펫팅하고, 배아의 수분을 제거한 후 PBST로 헹굽니다. 배아를 3분 동안 헹군 후, 메쉬를 이용해 10 mL의 PBST가 담긴 15 mL 튜브로 옮깁니다. 메쉬를 제거하여 배아를 용액 속에 남겨두고, 배아의 양이 100에서 300 µL 사이가 되는지 확인합니다.바닥에 가라앉히고, PBST를 흡입하여 제거한 후 즉시 배아를 교차결합시키기 위한 교차결합 과정을 진행합니다. 먼저, 갓 제조한 0.2% formaldehyde PBST 10 milliliters를 배아에 첨가합니다. 25 degrees Celsius에서 10분 동안 부드럽게 흔들어주며 배양합니다.10분 동안 반응시킨 후, 배아가 가라앉을 때까지 기다렸다가 용액을 제거합니다. 그다음 반응을 정지시키기 위해 용액을 0.25 M glycine/PBST 10 mL로 빠르게 교체합니다. 튜브를 사용하여 5분 더 흔들어 줍니다. 반응 정지 후, 용액을 제거하고 10 mL의 PBST를 사용하여 배아를 3회 세척합니다.남은 PBST를 피펫 흡입으로 제거하고, 배아를 필요한 시점까지 -80 °C에서 보관하십시오. 다운 균질기(down homogenizer)와 2 mL의 용해 버퍼를 사용하여 가교 결합된 배아 500 µL를 균질화합니다. 이때 촘촘한 페스틸(pestle)로 약 15회 정도 스트로크합니다.용해물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 15분 동안 부드럽게 흔들어 섞이도록 설정합니다. 그런 다음 용해물을 16,000 GS에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 15 milliliter 튜브로 옮깁니다.펠렛은 폐기해도 됩니다. 이제 상청액에 40 µL의 anti ha agros 비드 슬러리를 첨가합니다. 비드 접합이 완료된 후 약 2.5시간 동안 로킹(rocking) 상태로 둡니다.비드를 2,500 Gs에서 5분 동안 원심 분리하여 침전시킵니다. 튜브에 상층액을 약 250 µL 남기고 비드를 그 안에 재현탁합니다. 현탁된 비드를 스핀 컬럼의 10 micron 필터로 옮깁니다.12,000 Gs에서 10초 동안 원심분리하여 용액을 제거합니다. 컬럼의 비드를 200 µL의 세척 버퍼로 세척하고 다시 원심분리합니다. 이 과정을 총 3회 반복합니다. 그런 다음 비드에 40 µL의 용출 버퍼를 추가하고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다.이 기간 동안 5분마다 튜브를 부드럽게 흔들어 유출액을 수집하십시오. 컬럼을 12,000 GS에서 10초 동안 한 번 더 원심 분리합니다. 가교 결합의 효율성과 가교된 두 단백질 복합체의 정제 정도는 3~7% 단계별 젤(step gel)을 이용한 SDS page와 이후의 western blot으로 분석하였습니다. 가교 결합의 정도를 모니터링하고 프로토콜을 위한 다양한 포름알데히드 농도를 테스트하기 위해 HA 태그와 GFP 단백질을 발현하는 배아를 사용하였습니다.처리된 배아 내 GFP의 대부분은 가교 결합되지 않았으므로, 이러한 현상은 발생하지 않습니다. 무작위로 가교 결합된 이량체 복합체를 가교 결합되지 않은 대조군과 비교하였습니다. 가교 결합되지 않은 두 단백질은 자유롭게 이동하는 285 kilodalton 밴드에서 관찰됩니다.가교 결합된 형태의 단백질은 분자량이 더 커서 조단백 용해물 내에서 이동 속도가 더 느립니다. 두 단백질 중 약 절반이 생체 내(in vivo)에서 가교 결합되었습니다. HA 펩타이드를 이용한 상호작용 파트너 용출 분석 결과, 비드를 세척한 후 용출 분획에서 복합체 상태와 유리 상태의 단백질이 모두 확인되었습니다.SDS가 제거되면 대부분의 튜브가 자유 상태가 되며 튜브 복합체는 최소화됩니다. 이 절차 이후, 분리된 복합체 내의 단백질 성분 확인과 같은 방법에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 질량 분석법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 "등심"준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.

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검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

이 프로토콜의 목표는 중형 규모 (0.5-1g)에서 초파리 ( Drosophila) 배아를 수집하고 친화도 정화 - 질량 분광 분석 (AP-MS)과 같은 하류의 단백질 응용 분야에서 사용할 수있는 단백질 추출물을 제조하는 간단하고 저렴한 접근법을 제공하는 것입니다 ).

중간 규모의<em&gt; Drosophila</em&gt; 프로테옴 실험을위한 배아 추출물

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

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여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

학습하세요 생체 내 가교 접근법을 이용해 Drosophila 태아에서 단백질 복합체를 분리하는 방법을. 이 기술은 전통적인 시험관 내 방법으로는 포착하기 어려운 일시적인 단백질 상호작용을 안정화하여 연구자들이 생체 내에서 유전자 기능을 연구하는 데 도움을 줍니다.

생체 가교 접근 초파리* 태아*

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