Name: 단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 마이크로플루이딕 장치에서 단일 뉴런을 배열하여 상호 연결된 공동 배양을 준비하는 방법을. PDMS 복제 성형, 플라즈마 본딩, 폴리라이신 패터닝 기술을 활용하여 최소한의 세포 입력으로 효율적인 신경 과학 연구가 가능합니다.

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저자는 SEM 이미징 SU-8 제조 마리아 베커 (ISAS)에 대한 울리히 Marggraf (ISAS)에게 감사의 말씀을 전합니다. 연구는 재정적으로 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), Bundesministerium FÜR Bildung 싶게 Forschung 부여 (BMBF 0101-31P6541)에 의해 Ministerium FÜR 혁신, Wissenschaft 싶게 Forschung 데 Landes의 노르 트라 인베스트 팔렌에 의해 지원되었다. 헤이 케 Hardelauf 덕분에 국제 라이프니츠 대학원 &quot;시스템 생물학 연구소 - 온 - 칩&quot;재정 지원에 대한.

프로토콜은 신경 과학자를 대상으로하고, 그림 2에 요약되어있다. 따라서 그것은 상업적 또는 기관 시설에 아웃소싱 PDMS 복제에 사용 된 SU-8 마스터의 미세을 추천합니다. 두 레이어 마스크 디자인은 화학 웹 사이트 (12)의 왕립 학회에 부가 정보 (ZIP)로 자유롭게 사용할 수 있습니다. 중요한 사실은, 제 SU-8 층은 2.5-3.0 ㎛의 깊이로 제조하고, 25 ~ 30 ㎛의 깊이까지 제되어야한다. 이러한 효과가 신경으로 배열에 필요한 주요 치수입니다. 3 미크론의 높이 제한은 신경 세포가 두 개의 구획 (12) 사이에 운반 또는 마이그레이션되지 않도록하는 것이 필요하다. PDMS 1. 미세 유체 장치 복제 <ol><li> 10:1 비율로 경화제 (184)로 철저히 PDMS의 예비 중합체를 혼합하고 통상적으로 20 분 동안 진공 데시 케이 혼합물을 탈기. 대안 적으로, 혼합 두어50 ML 팔콘 튜브의 낮은 g을 사용 진짜야 탈 가스 원심 분리. </li><li> 80 ° C의 열판에 2 층 미세 구조화 SU-8 웨이퍼를 놓고 웨이퍼의 각 장치에 폴리머 프레임을 맞 춥니 다. ≥ 5mm의 깊이까지의 범위에 PDMS를 부어&gt; 1 시간 열 경화가 완료되도록 할 수있다. </li><li> 치료 후, 핫 플레이트에서 웨이퍼를 제거하고 평평한 표면에 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 상품 웨이퍼의 프레임과 PDMS를에 엄격한 메스 (멀리 SU-8 미세부터) 한 구석에서 보호 안경과 작업을 착용 할 것. </li><li> 프레임에서 PDMS 몰드를 제거하고 초과 PDMS의 장치를 손질하는 가위를 사용합니다. PDMS 박막은 고분자 프레임과 웨이퍼 표면 사이에 퍼지는 경우 소위 번쩍 종종 생성된다. </li><li> 남은 PDMS는 전체 웨이퍼에 적용하고 저장 중에 웨이퍼를 보호하기 위해 경화 될 수있다. 이전 후속 장치 성형이를 제거하고, 그렇게함으로써 어떤 P를 제거표면으로부터 오염물을 명확히. </li></ol> 2. 장치 조립 및 상호 <ol><li> 3mm 직경 생검 펀치를 사용하여 6 인터페이스 포트를 준비합니다. 좋은 조명 조건과 미세 유체 채널 포트의 정렬을 돕기 위해 위쪽으로 향하게 미세 기능, 어두운 화면에서 작업 할 수 있습니다. </li><li> 미립자의 장치를 검사합니다. 가역 접착 테이프를 사용하여이를 제거합니다. </li><li> 이러한가 플렉시블의베이스 상에 PDMS-경화제 혼합물 (10:1 601)의 작은 부피 (~ 0.5 ml)에 부어 의해 제조된다 : 미세 유체 회로는 유리 커버 슬립 상에 장착 얇은 PDMS 층을 사용하여 캡슐화된다 세균 등급 페트리 접시. 부드럽게, PDMS 층에 커버 슬립을 눌러 몇 분 동안 핫 플레이트와 열 치료에 놓습니다. 신속하게 냉각 한 후, 페트리 접시에서 커버 슬립 - PDMS 이중층을 잘라 상에 메스를 사용합니다. 필요에 따라 가위로 잘라. </li><li> 플라즈마 결합 PDMS 장치보기좋은 실을 생산하는 지지층 : 최적의 조건은 기기에 따라 다릅니다. 예를 들어, 40 초 동안 0.2 mbar의 산소 분위기에서 70 W와 40 kHz로 작동하는 플라즈마 오븐은 뛰어난 PDMS-PDMS 결합을 생성한다. 플라즈마 처리 후, 함께 두 부분을 누르면 완전히 결합에 잠시 둡니다. </li><li> 펌프와 주사기와 인터페이스, 실리콘 튜브 (3.2 mm 외경 1.6 mm의 ID)를 사용합니다. </li></ol> 3. 생체 적합 물질 패터닝 및 미세 유체 운영 현장 생체 재료의 패턴, 신경 세포의 문화와 유체 치료에 대한 프로토콜은 그림 2에 나타내었다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 일러스트 미세 유체 프로토콜. A) PL 및 PLL-g-PEG의 패턴; 세포 접착층의 첨가 (예를 들면,PL, 그린), 증발 물을 정렬 마스크 B) 노광 PL의 대기압 플라즈마 처리를 생산하는,. 2 개의 안테나 핀. C) PBS 흡인 (파란색) 세탁을 PLL-g-PEG의 PL. D) 배달 (빨간색 플라즈마 처리 영역 오염을 막기 위해 사용되는 핑크 스타와 함께 설명 된 플라즈마 도입 안테나로 사용된다 ) 코트에 대한 열망 플라즈마 처리 영역 E) 휴대 로딩.; 흡인에 의해 모두의 측면에 구획에 신경을 동시에 미세으로 배열, 수압 구동 흐름 G) 절연 유체 치료를 사용하여 F) 미디어 (핑크) 관류.; 테스트 에이전트 (흑)의 둘레 치료 흡인하고, 흡인 하단 중앙 입구로부터 전달 H) 중앙 처리에 의해 하부의 측면에 흡입구로부터 전달. 그림과 전설은 화학의 왕립 학회의 허가를 재현(RSC)는 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> PDMS 미세 유체 채널을 접합하는 즉시 다음과 같은 플라즈마 (접촉각 ≤ 5 °) 높은 친수성이다. 이러한 표면은 차별화 된 인간 SH-SY5Y 신경 세포와 같은 세포와 같은 세포 라인의 접착과 문화에 적합하다. 기본 뉴런과 같은 룬드 인간의 중간 뇌 세포 라인 (LUHMES) 폴리아민 코팅, 폴리 라이신 (PL) 또는 폴리 오르니 틴 (PO) 중 하나와 같은 신경 전구 세포 라인의 문화의 체외 배양을 위해, 정전 앵커가 필요합니다. 또한 이러한 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 접착 단백질은 종종 인테 - 인터페이스 코팅으로 필요합니다. 그러나, PL 및 PO 코팅은 쉽게 배열 사이트에 미세 유체 전달을 방해하고 원치 않는 전단 응력을 부과, 신경 세포를 바인딩합니다. 이 문제를 해결하려면 칩 생체 재료패터닝 트랩 사이트와 가지의 마이크로에 접착 물질을 집중해야합니다. 이것은 또한 간 구획 연결의 개발을 촉진하고 지역의 엉킴을 감소시킨다. 프로토콜은 또한 단백질과 뉴런 긴 배양 기간 동안 원하는 위치로 제한되도록 인접 지역에 PEG 재료의 첨가를 포함한다. 다음 프로토콜은 그림 3에 설명되어 있습니다 : <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3. 물 플라즈마 스텐실에 의해 생체 적합 물질 패터닝 마스크. A) PDMS의 micropillars 플라즈마 박아 자리에 물 메 니스 커스 (meniscus)을 고정으로 물 마스킹 과정의 그림입니다. 수직 평면에 메 니스 커스의 곡률은 무시하고있다. B) 물 마스크 메 니스 커스 (P)에 의해 붉은 염료로 시각화 및 위치단백질의 플라즈마 박아. D 후 몇 군데 회. C) 패턴 PL-FITC 코팅) 추가 플라즈마 패턴 PL-FITC 코팅을 거부하고 세포 혐오감을 PLL-g-PEG-TRITC. 이것은 SH-SY5Y 세포의 등록 및 또한 LUHMES 셀들에 대한 추가적인 피브로넥틴 층을 패터닝하기 위해 사용되었다. 그림과 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 전설 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol><li> 플라즈마 박아하여 현장에서 생체 적합 물질 패터닝 물 마스킹 <ol><li> 곧 플라즈마 본딩 피펫 후 중앙 하단 포트에 PL 또는 PO (100 ㎍ / ㎖의에 1X PBS)의 0.5 μL 볼륨. 수초 이내에 전체 미세 유체 회로는 모세관 작용에 의해 충전된다. 몇 분 남겨 폴리 A와 완벽하게 코트 친수성 ​​PDMS 표면에광산. </li><li> 1 분 동안 (도 2c 참조) 1X PBS와 포부 중심의 세탁에 의해 언 바운드 폴리아민 분자를 제거합니다. </li><li> 포트에서 모든 PBS를 제거하고 현미경으로 조사하여 장치를 가열한다. 이 빠른 물 마스크 형성을위한 포트에서 증발을 증가시킨다. 물 마스크 (그림 3a에 나타낸 그림 (b)에 설명)을 ~ 5 분 이내에 설정됩니다. </li><li> 물 마스킹이 완료 보장하기 위해 현미경으로 장치를 검사합니다. 배열 사이트의 상류 저수지 구조가 물 마스크 (~ 15 분)의 안정성을 연장하기 위해 마스크 디자인에 포함 된주의하시기 바랍니다. </li><li> 포트 (그림 2B)로 스테인레스 스틸 핀을 삽입합니다. 이들은 빈 미세 유체 채널로 19, 20 (2 MHz의 30 kV의 신호로 작동 예) 커플 기압 휴대용 코로나 방전 또는 테슬라 생성기에 ​​의해 생성 된 플라즈마에 사용된다. T의 끝을 포인트그는 하나의 핀과 플라즈마의 끝 부근에 소스가 ≤ 1 초 동안 마이크로 치료 플라즈마. 플라즈마 패턴을 관찰하기 위해 낮은 조명 조건을 사용합니다. </li><li> 세척 단계와 물 마스크를 제거합니다. 상위 3 포트에서 병렬 포부를 사용합니다. 병렬 포부를 달성하기 위해 흡인 펌프에 4 방향 어댑터로 연결된 실리콘 튜브의 4 동일한 길이를 사용합니다. 구토물이기도를 시작하고 미세 유체 회로를 통해 PBS를 그릴 아래 3 포트에 PBS를 분배. 이러한 방식으로 PDMS-폴리아민 물질 콘트라스트 (도 3c 참조) 생성된다. 미세 유체 회로에서 PBS 대피하고 원시, 소수성 상태를 복원하기 위해 몇 시간 동안 그대로 둡니다. 이 세포 접착에 PDMS가 완전히 비 관대 렌더링합니다. </li><li> 그러한 라미닌 또는 피브로넥틴과 같은 추가 접착 재료는, 다음 단계는 즉시 물 마스크를 제거한 후 필요하며 이루어져야 필요한되면 : 피펫 그래프트 코 폴리머, 폴리-L의 10 μl의 용적- 리신 - 폴리 (에틸렌 글리콜) (PBS에서 PLL-g-PEG, 100 ㎍ / ㎖,) 양쪽 하단의 측면에 채널로, 2 분간 상부 플 랭킹 채널로부터 흡인 하였다. </li><li> 흐름을 방해하지 않고, PBS 버퍼와 교환 초과 PLL-g-PEG를 제거합니다. PEG 부분이 단백질 흡착 및 세포 부착 17,21을 방지 작용이있는 선택적 코트 비 폴리아민 코팅 영역. </li><li> 이러한 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 접착 단백질은 폴리 아민 코팅 공동 지역화 할 수 있습니다 : 이러한 ECM 단백질 (일반적으로 10 ㎍ / ㎖)의 피펫 10 μL 볼륨을 세 하단 포트에. 장치가 단백질 용액으로 채워지고 양질 코팅을 생산하는 1 시간 동안 배양 될 때까지 최상위 세 개의 포트에서 대기음. </li><li> 아래 3 포트에서 PBS를 흡입하여 여분의 단백질을 제거합니다. </li></ol></li><li> 미세 유체 단일 신경으로 배열 <ol><li> appropri 프라임은 장치미디어를 먹었다. 아래 3 포트에 20 μL 볼륨을 추가하고 상위 세 개의 포트에서 병렬 열망에 의해 빠른 속도로 미디어를 미세 유체 회로를 채 웁니다. 흡인 펌프에 동일한 길이의 실리콘 튜브를 통해 커플에 4 방향 튜브 커넥터 3 위 포트를 사용합니다. </li><li> (그림 1, 0)의 측면에 입구 각 포트에 세분화 된 세포 현탁액 20 ㎕ (1 X 10 6 세포 / ml)를 추가합니다. </li><li> 유량 조절기와 흡인 펌프 장비 또는 상위 3 포트에서 부드러운 포부 주사기를 사용합니다. 완전한 신경으로 배열은 일반적으로 1 분을 필요로한다. </li><li> 이후 마이크로 유체 장치에으로 배열의 피펫 4의 측면에 포트에 남아있는 여분의 신경 세포를 수확. </li><li> 튜브를 제거합니다. 미디어와 모든 포트를 입력하고 인큐베이터에 장치를 배치합니다. 몇 시간 내에 세포는 생체 재료 패턴에 완벽하게 부착된다. </li></ol></li><li> 신경 세포 문화, 선택적 유체 치료 및 면역nostaining <ol><li> 수압 피드 (2mm 열 높이 차이가 적절하게 느린)를 사용하여 정기적으로 관류하여 미디어를 교환한다. </li><li> 또한, 표준 세포 배양에서와 같이 (2-3 일) : 주기적으로 미디어를 교환, 미디어의 마이크로 유체 장치를 잠수함. </li><li> 다음과 같이 신경 세포 배양 구획 또는 중앙 신경 돌기 가지 구획 중 하나에 선택적 유체 처리는 달성된다 : 그 채널의 하단 포트에 시험 물질의 20 μl를 분배하고, 직접 위의 포트에서 대기음. 긴 처리는 유량 조절기를 사용하여 유량을 감소시키고 필요한 피검 물질을 보충하기 위해. </li><li> 면역 염색 프로토콜은 각각의 분자 표적 및 관련 시약에 따라 다릅니다. 느린 유속을 사용한 뉴런 전단 - 유도 된 손상의 잠재적 인 위험에 대처하기 위해. 이것은 정상적인 프로토콜 시간을 연장, 시스템을 완전히 perfuse 증가 응용 프로그램의 시대에 발생합니다. 숨바꼭질(2mm 순서 예) 상이한 칼럼 높이와 포트를 사용 drostatic 관류는 시약을 제공하는 데 사용되었다. 펌프를 사용하여 더 빠른 시약 첨가 및 제거 실험 척도를 줄이기 위해 사용될 수있다. 아래 3 포트에서 시약을 그릴 상단 3 포트에 흡인 펌프를 연결합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

미세 유체으로 ​​배열 기술은 최소한의 문화 구축을위한 정밀 단일 신경 세포의 처리를 가능하게 최초의 것입니다. 미세 구조와 세포의 패턴을 정렬하는 현장 생체 적합 물질 패터닝 방법에있어서, 강력한 접근 방식과 함께, 이러한 최소한의 문화가 감소 된 지역의 얽힘 높은 intercompartment 연결 수준이. 심플한 디자인 수정이 시각화 및 정량 분석​​을위한 개별 축삭을 분리 잠재력이 이러한 기능은 간 구획 전송의 효율적인 학습을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 다음 세대에서 삼지창 구조체가 다발을 형성하는 복수 축삭의 확률을 줄이기 위해 신경 세포 당 하나의 가지 채널로 대체 될 수있는 디자인. 이러한 기능은 크게 신경 과학 등의 응용 프로그램의 다양한 혜택을 누릴 수 있습니다; 나노 입자의 독성 (24)과 망간 전파 25, 활동 SYN간질 chronization 같은 프리온 (26), 알츠하이머 병 9 아밀로...

<html> 신경 조직은 매우 복잡합니다; 공간적 세포 연락처 및 특히 축삭과 수상 돌기의 outgrowths를 통해 통해 정의 층과 구획 내에서 플라스틱 연결과 함께 주문 이종 세포 혼합물. 새로운 기술은 깊은 통찰력과 질병, 개발, 건강 기능 중심 해명 메커니즘을 얻기 위해 더 많은 실험적인 자유를 부여해야합니다. Campenot 챔버 1,2 그리고 더 최근의 마이크로 제조 실시 예 3,4는 선택적으로 다른 체세포 인구 느려지고 또한 신경 돌기의 outgrowths하는 기능과 네트워크의 연결 공동 배양의 생체 외 제조에 사용될 수있다. 이러한 마이크로 유체 장치는 예를 들어 화학 5,6 또는 레이저 axotomy 6-8, 타우 병증 9, 바이러스 전파 10, 11, 및 축삭 4 mRNA의 현지화 다음 축삭의 변성과 재생을 연구하는 데 사용되었습니다. 엔트 &quot;&gt; 신경 생물학의 범위를 확장하기 위해, 기술 개발은 최소한의 신경 세포의 공동 문화를 준비해야합니다. 이것은 하나의 세포 및 서브 셀룰러 정밀 시스템의 조사를 위해 신경 네트워크의 풀림을 할 수 있습니다. 최소한의 세포 수에 대한 요구 사항은 파킨슨 병, 귀에서 나선형 신경절, 말초 신경 관련된 도파민 흑질 세포를 포함한 희귀 세포 유형을 분석하고, 줄기 세포를 수있는 가능성을 연다. 이 외에도, 휴대 경제는 3RS 사업에 관련이 있습니다. 이러한 미세 유체 플랫폼 대규모 독성 스크린 또는 다른 높은 처리량을 이용하여 동물의 신경 세포가 필요한 데이터 풍부한 일련의 실험은 이제 고려 될 수있다. 본 논문에서는 마이크로 유체 장치의 제조 및 사용을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 현장 biomateri에와 함께 마이크로 유체으로 배열알 패터닝 방법은 최소한의 세포 수를 높게하여 상호 연결을 공동 배양의 등록을 위해 사용될 수있다. 미세 유체으로 배열은 차동 흐름 할인 모형의 미세 트랩 유체 회로 (그림 1의 SEM 이미지와 함께 설명) 내에 위치되어있다 12 ~ 15을 기반으로합니다. 신경 돌기 가지의 채널 입구 - 경로 0 → 1은 미세 구멍의 선형 배열에 신경을 운반 낮은 유체 저항 (R 2&gt; R 1)가 있습니다. 하나의 셀에 의해 트랩의 인원은 로컬 이웃 트랩 이후의 세포를 포집 유선을 전환하는 흐름을 방해한다. 배열 트랩의 전체 점유 과잉 뉴런의 제거 동작의 바이 패스 모드를 생성하기 위하여 사문석 경로 (0 → 2)에 유선을 전환하는 유체 비율 (R 1&gt; R 2)를 전환한다. 그림 1. 미세 유체 회로. 신경 돌기 가지 채널에 의해 상호 문화 실의 측면에있는 하나의 뉴런으로 배열에 대한 A) 차동 저항 유체 회로,. B, 메 니스 커스 (meniscus) 고정 micropillars와 이중층 구획 된 신경 세포의 공동 문화 배열의 C) SEM 이미지. 이 디자인으로, 삼지창 모양의 신경 세포 트래핑 구조는 신경 돌기의 outgrowths의 fasciculation을 촉진하는 데 사용되었습니다. 그림과 화학의 왕립 학회 (RSC)의 허가를 재현 전설 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 평면 기판 상에 마이크로 패턴 신경 네트워크의 제조는 용이 exampl 위해 (달성 될 수있다<html> 우리 그룹에서 ES는, Frimat 등. (16)와 헤이 케 등. 17)을 참조하십시오. 그러나, PDMS 장치 내부와 미세 유체 채널이의 마이크로 미터 크기의 정렬의 요구 사항과 생리 활성 물질의 패턴을 캡슐화하는 주요 기술적 인 도전을 포즈. 3.1 절에 대한 프로토콜에 칩, 또는 현장에서, 생체 적합 물질 패턴의 준비가 표시됩니다. 이러한 패턴은 긴 문화 척도 동안 신경 세포의 등록을 활성화하고 구획 사이의 outgrowths을 촉진합니다. 메 니스 커스 고정 마이크로는 신경이 사이트와 신경 돌기 가지 채널을으로 배열과 소위 물 마스크를 정렬하는 데 사용됩니다. 노출 된 표면은 생체 재료 패턴을 정의하기 위해 분해되는 반면, 물 마스크는, 플라즈마 처리 동안에 접착 분자 코팅을 보호한다. 또한, 프로토콜은 세포 배양과 다양한 공동 문화 구획의 선택적인 치료에 필요한 유체 격리를 위해 제공됩니다. ve_content &quot;&gt; 프로토콜은 이와 유사하게, 현장 생체 재료의 패턴 증발 및 표면 장력 현상을 이용, 간단합니다. 폴리의 복제 (디메틸 실록산) (PDMS) 미세 유체 장치를 18 일 소프트 리소그래피의 사용자 친화적 인 원리를 활용하도록 설계되어 있습니다 만 저렴한 휴대용 플라즈마 소스를 필요로. 미세 유체 회로는 이러한 동작을 만들기 효과적으로 프로그램 셀 로딩 및 구획 구체적인 치료는 단순히 올바른 하단 포트에 재료를 분배하고 위에서 흡입의 문제. 이러한 방식으로,이 신경 생물 학자에게 제공하기위한 것이다 자신의 실험실에서 미세 유체 장치를 준비하고 사용할 수있는 자유.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>다우 코닝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm 두께</td></tr><tr><td>3mm 생검 펀치</td><td>Kai Medical</td><td></td><td>Handle with care - 매우 날카로운</td></tr><tr><td>Tygon 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1.65 mm ID; 3.35 mm OD</td></tr><tr><td>1 ml 주사기 ( Inkjekt 및 Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>4-Way 튜빙 커넥터</td><td>VWR 또는 Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow regulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 핀</td><td>양재부</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td>, <td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>저장의 안정성이 문제가 될 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>폴리리신-FITC</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>폴리오르니틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡인 펌프의 예</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 코로나 방전 장치</td><td>Leybold-Heraeus, USA</td><td>VP23</td><td>해당 국가의 안전 표준을 준수하지 않을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>펨토 플라즈마 오븐</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum dessicator 또는 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Campenot 실의 미세 유체 실시 예는 신경 과학 사회에서 큰 관심을 받고있다. 이러한 상호 공동 문화 플랫폼은 감염 및 질병 전파에 발달 및 기능 신경 생물학에 걸쳐, 다양한 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 기존의 시스템은 중요한 세포와 같은 기본 도파민 흑색질, 나선 신경절 및 Drosophilia melanogaster의 뉴런의 낮은 풍부 세포 연구에 대한 불충분 한 입력 (구획 당 수천), 및 높은 처리량 실험에 대한 허무가 필요합니다. 조밀 한 문화는 매우 로컬 두 문화를 상호 몇의 outgrowths (&lt;10 %)과 얽혀있다. (I) 미세 유체 하나의 신경 세포는 방법으로 배열하고, 플라즈마 패터닝 생체 재료의 코팅 REGI을위한 (II) 물 마스킹 방법 :이 논문에서는 간단 미세 패터닝 프로토콜은 이러한 문제를 해결하는 설명되어 있습니다신경을 STER과 구획 사이의 파생물을 촉진합니다. 최소한의 신경 세포 공동 배양은 높은 수준 (&gt; 85 %) intercompartment 연결로 제조 된 단일 셀 정밀도 높은 처리량 신경 생물학 실험에 사용될 수있다.

물 마스킹 공격은 표면 장력. 공기 - 액체 계면에서의 압력 공차는 곡률 [반경 반비례 비늘 <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , 미세 유체 차원에서 매우 안정적인 인터페이스를 생성. micropillars 효과적으로 대신 물 마스크 앵커. 워터 마스크 형성은 가열에 의해 증가 된 속도로, 마이크로 유체 포트에서 증발에 의해 구동된다. 낮은 배율 (4X - 10X)에서 열을 사용하여 현미경 조명, 물 마스크는 일반적으로 ≤ 5 분에 설립되었다. 증발은 또한 물 마스크의 최종적인 붕괴에 이르게한다. ~ (플라즈마 박아 실용적인) 15 분은, 18 NL 저장 구조는 문화 구획의 상류에 위치 된 것으로 물 마스크의 수명을 증가시킵니다. 물 마스크 형성과 붕괴의 비율은 다를 수 있고, 간헐적으로 관찰 플라즈마 t에 적합한 기간을 확인하는 것이 좋습니다reatment. 그럼에도 불구하고, 여러 장치를 동시에 제조 할 수...

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

본 절차의 전반적인 목표는 단일 뉴런을 두 개의 미세유체 챔버에 배열하여 연결된 뉴런 공동 배양 시스템을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 PDMS로 미세유체 소자를 복제 성형하고 플라스마 본딩으로 소자를 밀봉함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 미세유체 소자 내부에 폴리라이신을 패턴화하는 것입니다.이는 장치를 폴리라이신으로 채우고, 증발을 통해 수분 층이 형성되도록 한 다음, 플라스마 처리를 통해 노출된 폴리라이신을 제거함으로써 생체 재료 패턴을 생성하여 달성됩니다. 다음으로, 시린지를 사용하여 신경세포를 미세유체 회로를 통해 흡입하여 단일 신경세포 배열을 형성합니다. 장치를 조직 배양 인큐베이터에 배치하여 신경 돌기가 성장하고 두 신경세포 집단을 연결하도록 합니다.마지막 단계에서는 흡입 펌프를 사용하여 하나의 구획만을 선택적으로 처리하고, 신경 회로 내에서 물질과 병리 현상이 전파되는 과정을 모니터링합니다. 이 절차는 ISIS 연구실의 Yayu Chang과 sarada가 시연할 예정입니다. 상용 PDMS 컴포넌트 챔버와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 개별 신경 알고리즘 분석을 위해 단일 세포 위치에서 신경 공동 배양을 준비할 수 있다는 점입니다.이 방법은 신경과학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 알츠하이머병에서 과인산화와 관련된 타우 응집체의 전파 기전은 무엇인지, 또는 감염된 유기체가 뇌 전체로 어떻게 퍼지는지와 같은 질문들입니다. 이 기술은 각 실험 조건당 수백 개의 뉴런만 필요하므로 고처리량 응용에 매우 적합합니다.PDMS 프리폴리머와 경화제를 10:1 비율로 충분히 섞어 절차를 시작합니다. 그다음, 진공 데시케이터에서 혼합물을 보통 20분 동안 탈기시킵니다. 그런 후 80 °C 핫플레이트에 2층 마이크로 구조 SU-8 웨이퍼를 올리고, 웨이퍼 상의 각 소자에 맞게 폴리머 프레임을 정렬합니다.프레임에 PDMS를 붓고 완전히 열경화될 수 있도록 1시간 동안 둡니다. 경화가 완료되면 핫플레이트에서 웨이퍼를 꺼내 평평한 표면 위에서 식힙니다. 그 후, 보호 안경을 착용한 상태에서 단단한 메스로 한쪽 모서리부터 프레임과 PDMS를 웨이퍼에서 조심스럽게 떼어냅니다.프레임에서 PDMS 몰드를 제거하고 가위로 디바이스를 다듬습니다. 보관 중 웨이퍼를 보호하기 위해 남은 PDMS를 웨이퍼 전체에 도포합니다. 웨이퍼에서 이 PDMS 층을 벗겨내면 표면의 입자성 오염 물질이 제거되어 PDMS 몰딩을 반복할 준비가 됩니다.이제 3mm 생검 펀치를 사용하여 6개의 인터페이스 포트를 준비하십시오. 이때 마이크로 구조의 특징이 위를 향하게 하여 포트와 미세유체 채널의 정렬을 돕습니다. 장치에 입자가 있는지 확인하고 가역성 접착 테이프를 사용하여 제거하십시오. 다음으로, 페트리 접시에 소량의 PDMS 경화제 혼합물을 부어 유리 커버슬립 위에 장착된 얇은 PDMS 층을 준비하십시오.커버 슬립을 PDMS 층 위에 눌러 고정합니다. 이를 핫플레이트에 올리고 약 10분 동안 열경화시킵니다. 냉각 직후, 보안경을 착용한 상태에서 메스를 사용하여 커버 슬립을 들어 올립니다.장치를 캡슐화하기 위해 페트리 접시에서 PDMS 이중층을 준비합니다. 양호한 PDMS-PDMS 결합이 필요합니다. PDMS 이중층과 미세유체 장치를 플라스마 오븐에 넣고 40초 동안 처리합니다.플라즈마 처리가 완료되면 두 부품을 함께 눌러 완전히 접합되도록 하고, 플라즈마 접합 직후 하단 중앙 포트에 polylysine 0.5 µL를 피펫으로 분주합니다. 전체 마이크로 유체 회로는 수 초 내에 모세관 현상으로 채워져야 합니다. 그 다음, 친수성 PDMS 표면이 polylysine으로 완전히 코팅되도록 몇 분 동안 그대로 둡니다.다음으로, 흡입 세척을 통해 결합되지 않은 polylysine을 제거합니다. 4방향 유니온을 사용하여 펌프를 동일한 길이의 튜브로 상단 3개 포트에 연결하고 흡입을 시작합니다. 하단 3개 포트에 PBS를 추가하고 1분 동안 세척합니다. 그 후, 튜브를 분리하고 포트에 남아 있는 PBS를 모두 제거합니다.장치를 현미경으로 옮기고 조명을 통해 가열하여 포트에서의 증발을 촉진함으로써 수분 마스크가 빠르게 형성되도록 합니다. 현미경으로 장치를 관찰하여 수분 마스킹이 완료되었는지 확인합니다. 그다음, 핸드헬드 코로나 방전 발생기로 생성된 플라즈마를 빈 미세유체 채널로 결합시키기 위해 스테인리스 스틸 핀을 포트에 삽입합니다.플라스마 소스의 팁을 핀 하나의 팁 가까이에 위치시킨 후 플라스마를 발생시킵니다. 마이크로 채널을 1초 동안 처리합니다. 그 후, 핀을 제거하고 상단의 포트 3개를 펌프에 연결합니다.흡입을 시작하고 하단 3개 포트에 PBS를 분주하십시오. 이는 마이크로유체 회로를 통해 PBS를 끌어당기기 위함입니다. 마이크로유체 회로에서 모든 PBS를 제거하고, 생체 재료 패턴 형성을 완료하기 위해 하룻밤 동안 그대로 둡니다.여기서는 플루오레세인으로 표지된 polylysine을 사용하여 패턴을 시각화합니다. 이 절차에서는 하단 3개 포트에 각각 20 µL를 첨가하여 장치를 적절한 배지로 프라이밍합니다. 그런 다음 상단 3개 포트에서 평행 흡입을 수행하여 미세유체 회로를 배지로 빠르게 채웁니다.각 측면 하단 포트에 분산된 세포 현탁액 20 µL를 추가합니다. 주사기를 사용하여 상단 3개 포트에서 부드럽게 흡입하십시오. 뉴런 배치 완료에는 보통 1분이 소요됩니다.그 다음 피펫을 사용하여 후속 마이크로유체 장치의 링 포트에 남아 있는 과잉 뉴런을 수확합니다. 이 예시는 뉴런이 단일 세포 정밀도로 배열되는 방법을 보여줍니다. 그 후 장치를 배지에 담그고 인큐베이터에 넣어 세포가 몇 시간 내에 생체 재료 패턴에 완전히 부착되도록 합니다.일반 배양과 마찬가지로, 뉴런 배양 구획 또는 중앙 신경 돌기 성장 구획 중 어느 한 곳을 선택적으로 처리하기 위해 주기적으로 배지를 보충해야 합니다. 관심 채널과 연결된 하단 포트에 시험 물질 20 µL를 분주하고, 바로 위의 포트에서 흡입하십시오. 이 예시에서는 중앙 구획에 선택적 처리가 적용되었으며, 다른 예시에서는 측면 구획이 처리되었습니다.처리는 1분 이내에 설정되었으며 60분 동안 유지되었습니다. 이후 뉴런 공동 배양물을 모니터링하여 물질의 전파 또는 병리 현상을 측정할 수 있습니다. 숙련되면 단 하룻밤 사이에 많은 수의 미세유체 소자를 준비할 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면, 귀하의 실험실에서 최소형 뉴런 배양법을 준비하는 방법과 이를 통해 뇌 내 물질 및 질병 전파의 기전을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

여기서 우리는 glial 피더 층의 존재에 culturing 쥐 대뇌 피질의 뉴런에 대한 프로토콜을 제공합니다. 교양 뉴런은 극성을 설정하고 시냅스를 만들고, 이러한 전기 생리학, 칼슘 이미징, 세포 생존 assays, immunocytochemistry, 그리고 RNA / DNA / 단백질 분리 등 다양한 어플 리케이션에 사용하기 위해 glia에서 분리 수 있습니다.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

이 동영상은 인간 신경전구세포(NPC)를 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. NPC는 확립된 마우스 성상세포-쥐 피질 뉴런 공동 배양에 도입되어 NPC가 뉴런으로 분화되는 것을 촉진합니다. 분화는 컨포칼 현미경으로 세포를 시각화하여 확인됩니다.

인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술

이 비디오는 구획화된 접근 방식을 사용하여 간접 뉴런-성상세포 공동 배양을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이 설정에서 뉴런과 성상세포는 공간적으로 분리되어 있지만 조건화된 매질을 공유합니다. 성상세포에 의해 방출된 신경영양인자(neurotrophic factor)는 뉴런 분화와 시냅스 연결의 형성을 촉진하여 뉴런-아교세포(neuron-glia) 상호작용을 시사합니다.

뉴런-신경교세포 상호작용을 연구하기 위한 간접 뉴런-성상세포 공동 배양 기법

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

amperometric 기술은 자연 도파민의 산화에 의해 생성 된 산화 전류를 검출하여 하나의 세포에서 도파민 릴리스를 측정합니다. 동시 전압 클램프 및 amperometry 방법론은 도파민 수송과 도파민의 역방향 전송에서이 활동의​​ 규제 역할의 전체 '활동'사이의 기계론의 관계를 알 수있다.

동시 전압 클램프 및 Amperometry과 도파민 릴리스의 단일 세포 측정

배우세요 마이크로플루이딕 장치에서 단일 뉴런을 배열하여 상호 연결된 공동 배양을 준비하는 방법을. PDMS 복제 성형, 플라즈마 본딩, 폴리라이신 패터닝 기술을 활용하여 최소한의 세포 입력으로 효율적인 신경 과학 연구가 가능합니다.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

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