Name: 마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 배우세요 마우스에서 LPS 경구인두 기관 내 투여 및 폐포 세척을 이용한 호스트 면역 반응 평가 방법을. 이 기술은 정확한 투여량과 폐 침착을 가능하게 하여 염증 반응 및 조직병리학적 변화를 고해상도로 분석합니다.

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저자는이 프로젝트의 핵심 및 기술 지원을 제공하는 동물 용 의약품의 VA-MD 지역 대학 감사합니다. 이 작품은 NIH 경력 개발 상 (K01DK092355)에 의해 지원된다.

모든 연구는 버지니아 공대의 기관 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인하에 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하였다. 1. 구인두 관리를 사용하여 LPS의 기관 내 (IT) 예방 접종 <ol><li> 각 동물의 고유 귀 펀치, 귀 태그, 또는 다른 제도적으로 승인 된 방법 중 하나를 사용하여 식별되어 있는지 확인합니다. </li><li> 기준 체중과 각각의 동물에 대한 몸의 온도를 기록한다. </li><li> LPS의 작업 주식을 준비합니다. 각 마우스 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 1 ㎎ / ㎏ LPS의 50 μL의 복용량을 받게됩니다. 모의 치료 동물은 1X PBS의 50 μl의 선량을 받게됩니다. </li><li> 다음 드롭 방법을 사용하여 이소 플루 란을 투여에 적합한 실을 준비합니다. 기관 지침으로 시작할 수있는 이소 플루 란과 다른 마취제와 이전의 사용에 관한 다양어떤 연구를 보내고, 사람은 모든 지침을 적절하게 충족 보장하기 위해 동물 보호 / 복지의 자신의 기관의 부서에 문의해야합니다. 드롭 방법 이소 플루 란이 옵션을 선택하지 않으면, 다른 마취제는 대체가 있습니다. <ol><li> 적절한 안전 캐비닛에, 500 ㎖ 비커의 바닥에 접혀 흡수 종이 타월과 장소에 이소 플루 란의 약 3 ㎖를 적용합니다. </li><li> 종이 타월 위에 알루미늄 호일의 작은 조각을 놓고 투명 뚜껑이있는 비이커를 포함한다. </li></ol></li><li> 그것은 접종시 활용 될 도구와 시약을 준비합니다. 동물 삽관 스탠드에 머리를 확보 고무 밴드를 배치합니다. 이 절차는 직선 포셉 한 쌍의 각도 또는 곡선 포셉 한 쌍의와 팁 P200 피펫을 필요로 할 것이다. </li><li> 삽관 스탠드 옆에 쉽게 액세스 할 수있는 위치에있는 피펫 팁과 장소에 부하 LPS의 50 μl를. </li><li> 마우스를 마취이소 플루 란 챔버에 동물을 배치하고 투광성 덮개와 챔버를 덮는 따라. 첫 번째 챔버에 배치 할 때 신속하고 얕은 될, 동물의 호흡 패턴을 관찰한다. 호흡 속도는 일반적으로 챔버에 배치하는 30 초 이내에 도달 한 호흡 / 2 초를 접근 할 때 동물이 충분히 마취됩니다. 드롭 방법 이소 플루 란을 사용하여 승인 된 동물 프로토콜에 명시된 바와 같이 마우스를 마취해야합니다. </li><li> 챔버에서 마취 된 쥐를 제거하고 그 앞니 대기 삽관에 동물을 일시 중지합니다. 동물이 안전하게 억제하고 입과 혀에 액세스 할 수있는 것을 확실히한다. </li><li> 부드럽게 직선 집게로 혀를 고정합니다. 각진 집게로 혀를 잡고 약간의 저항이 느껴질 때까지 부드럽게 입에서 빼냅니다. 이 조치는 후두개 블록 및 기관지에 액세스하기에 충분하다. </li><li> 에 혀를 잡고 계속하면서확장 된 위치는 목의 뒷면에 LPS의 50 μL 용량을 관리하고 즉시 장갑을 낀 손가락으로 동물의 콧 구멍을 커버합니다. 마우스를 흡입 할 때까지 LPS는 목구멍의 뒤쪽에서 볼 수 있습니다. </li><li> 콧 구멍을 커버 5-10 추가 호흡 연장 혀를 계속 누르고 있습니다. </li><li> 삽관 대에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복 될 때까지 새 케이지에 동물을 배치합니다. </li><li> 질병의 진행과 관련된 대리 마커를 모니터링합니다. 체중과 체온은 연구 기간 동안 매 4-8 시간 감시되어야한다. 마찬가지로, 행동 특성 및 사망률 증가와 관련된 임상 증상을 평가. </li><li> LPS에 노출 다음과 같은 특정 시간 지점에서 질병의 진행, 수확 마우스를 평가합니다. LPS 노출 다음 수확에 대한 일반적인 시간 포인트는 0, 6, 12, 18, 24, 및 48 시간이 (가) 있습니다. 회복과 생존을 평가하기 위해, 7 다의 쥐를 평가YS 후 접종. </li></ol> 2. 혈청 및 기관지 세척 유체 (BALF) 컬렉션 <ol><li> 제도적으로 승인 된 방법을 사용하여 마우스를 희생. </li><li> 그 뒷면에 동물을 배치하고 높이 (1.27 cm)에 이상적으로 0.5, 부검 보드에 고정합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 전체 마우스를 적셨다. </li><li> 27 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 이전의 어떤 절개를 만들기 위해 심장 천자를 실시하고 있습니다. 그것은 하나의 마우스에서 전체 혈액의 500 ~ 800 μl를 철회 할 수 있어야한다. </li><li> 주사기에서 바늘을 제거하고 prelabeled 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 전체 혈액을 전송합니다. 혈청 수집을 위해 전체 혈액은 실온에서 적어도 30 분 동안 응고 할 수 있습니다. 혈청 컬렉션에 더하여,이 절차는 또한 이전에 면역 세포를 순환 공부, 전혈을 수집하는 관과 주사기로 항응고제를 통합함으로써 수정 될 수있다. </li><li> 수평 절개를합니다마우스의 아래턱에 복강의 길이 및 복강으로부터 수직 절개를 건너. </li><li> 집게를 사용하여 절개의 양면을 잡고 가볍게 멀리 내부 복막 및​​ 흉부 캐비티로부터 피부를 당겨. </li><li> 다이어프램을 절단하지 않도록주의하면서, 성기에서 흉골에 복강의 길이를 따라 큰 절개를합니다. 부드럽게 신장 중 하나에 대한 액세스를 허용하도록 복강 창자 시프트. </li><li> 관류에 대한 배수 지점 역할을하는 신장으로 이어지는 신장 정맥을 잘라. </li><li> 닉 다이어프램은, 가위를 사용하여 심장의 좌측을 노출, 폐 및 심장을 피하도록주의하면서. </li><li> 수동으로 27 G 바늘과 1X PBS 용액 10 ㎖ 주사기를 사용하여 마음을 perfuse. 식염수가 폐에 강제되지 않도록 재관류시 무리한 힘을 가하지 마십시오. 남아있는 혈액이 포털 정맥 절개로부터 배출한다.</li><li> 조심스럽게 심장과 폐를 절단되지 않도록주의하면서, 무딘 / 무딘 가위를 사용 흉골을 따라 갈비뼈를 잘라. 실수로이 절차를 수행하는 동안 폐를 절단하는 것은 상당히 수집 BALF의 양을 줄일 수 있고 제대로 정착과 폐를 팽창 할 수없는 결과를 초래할 것입니다. </li><li> 부드럽게 마음과 멀리 집게를 이용하여 흉곽에서 폐를 분리. 조심스럽게 가능한 한 척추에 가까운 무딘 / 무딘 가위를 이용하여 흉곽의 각 부분을 잘라 완전히 두 섹션을 제거합니다. </li><li> 집게를 사용하여 침샘을 분리하거나 가위를 사용하여 제거, 기관을 노출. </li><li> 조심스럽게 가위를 사용하여기도를 오버레이 근육을 잘라. 이 기관은이 과정에서 절단하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 가위를 사용하여 기관을 덮는 쇄골을 구분합니다. </li><li> 부드럽게 집게를 사용하여 흉선을 단단히 잡고 마음에서 조직을 올립니다. 에주의하면서, 가위를 사용 흉선을 제거심장이나 폐를 절단하지 마십시오. </li><li> 1-2 링 각도 가위 (45 ~ 90 º 각도, 샤프 / 샤프)를 사용하여 후두 아래의 기관에있는 작은 수평 절개를합니다. 절개 단단히 정맥을 확보 할 수있을만큼 충분히 커야합니다. </li><li> 테이퍼 끝이 절개 아래에 2 ~ 3 기관 반지를 나오도록 캐뉼라를 삽입하고 실크 봉합사를 사용하는 곳에서 정맥을 확보. 봉합은 기관과 식도 사이를 통과하고, 정맥에 꽉 뽑아되어 있는지 확인합니다. </li><li> 행크스 버퍼 식염수 (HBSS) 1 ㎖에 1 ML의 주사기를 입력하고 조심스럽게 캐 뉼러에의 루어를 삽입합니다. </li><li> 천천히, 그러나 지속적인 운동을 사용하여 폐를 팽창, 기관에 ~ 900 μl를 주입, 즉시 HBSS를 철회. 15 ML 원뿔 관에 복구 BALF를 놓습니다. </li><li> 미래 분석 BALF 약 3 ㎖를 수집하기 위해 세척을 2 회 추가를 반복합니다. 사용 준비가 될 때까지 얼음에 4 º C에서 BALF를 저장합니다. </li></ol><ol><li> 폐의 팽창 대에 10 ML의 주사기를 삽입합니다. 루어, 코크에 루어, 주사기로 꼭지에 호스를 조립합니다. 마개가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다. 10 ML의 주사기는 중력 흐름 저수지 역할을합니다. 저수지는 동물의 위의에 4.75을 서서 저수지의 상단이 동물의 위 10.5을 확장해야합니다 인플레이션에 연결해야합니다. </li><li> 중성 포르말린 용액을 주사기를 채우십시오. 주사기가 완전히 정착 가득되어 있는지 확인합니다. </li><li> 튜브의 개방 단부에서 흡수 수건을 놓고 정착이 튜브를 채울 수 있도록 꼭지를 엽니 다. 정착이 튜브에서 흐르는 시작되면, 즉시 마개를 닫고 정착과 상단에 주사기를 리필. 이것은 주사기 완전히 폐 인플레이션 압력의 적절한 양을 제공하기 위해 충전하는 것이 중요하다. </li><li&gt; 부드럽게 약 1 ~ 2 기관 반지 정맥의 끝 아​​래, 기관에서 봉합 실의 두 번째 조각을 전달합니다. </li><li> 봉합에 하나의 느슨한 매듭을 짓고; 그러나, 매듭 꽉 잡아 당기지 마십시오. </li><li> 정맥에 서 마우스 인플레이션 튜브를 삽입합니다. </li><li> 마개를 열고 폐 중력 인플레이션을 작성 할 수 있습니다. </li><li> 폐는 자신의 최대 인플레이션 수준에 도달하면, 봉합 꽉 끌어와 두 번째 매듭을 짓고. </li><li> 마개를 닫고 정맥에서 튜브를 제거합니다. </li><li> Gently 포셉 한 쌍 봉합사을 잡고 손가락 캐뉼라 잡고 기관에서 캐뉼라 제거합니다. 단단히 흉강 다시 마우스의 코쪽으로 정맥을 향해 아래로 봉합을 당깁니다. </li><li> 부드럽게 집게로 기관 또는 봉합을 단단히 잡고 목 공동의기도를 올립니다. </li><li> 무딘 가위를 사용하여 연결 봉합에 기관의 꼬리를 절단. </li><li> 일단 trache이 기본 조직에서 무료로, 마우스에서 멀리 기관을 끌어 시작합니다. 부드럽게 흉강 중 폐를 들어 올립니다. </li><li> 조심스럽게 흉강에 폐를 유지하는 결합 조직을 잘라. 멀리 마우스의 몸에서기도를 당겨 계속 기본 연결을 절단하면서 꾸준히 상향 력을 적용합니다. 폐를 절단하지 않도록주의하십시오. 심장이 왼쪽으로이 방법을 사용하여 폐에 연결해야합니다. </li><li> 폐를 제거하고 나면, 포르말린 10 ㎖에 배치합니다. </li><li> 유전자형에 대한 마우스의 꼬리 부분을 제거합니다. </li><li> 해당 기관의 지침에 따라 마우스의 시체를 폐기하십시오. </li></ol> 4. 사이토 카인의 평가 <ol><li> 혈청을 분리하기 위해 5 분 동안 12,000 XG에서 2.5 단계에서 수집 된 전혈을 원심 분리기. -80 ° C에서 prelabeled 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 혈청을 전송 </li><li> 오는 평가ELISA 또는 다른 유사한 분석에 의해 m 사이토 카인 수준. 혈청 1:5 희석 - 다음, 분석에 따라 적절한 희석 버퍼에 1:20 지침을 제조하고 있습니다. 이러한 희석은 실험적으로 이전 샘플의 부피를 실행으로 결정되어야한다. </li><li> 때문에 수집 된 혈청의 낮은 볼륨으로, 반으로 ELISA 플레이트에 장착 된 샘플 볼륨을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 대부분의 상업적 ELISAs는 표준 및 샘플을 100 μL 부피를 이용한다. 표본 표준 부하 50 μl를 희석 혈청을 절약마다 잘합니다. </li><li> 원심 분리기 5 분 200 XG에 냉장 테이블 탑 원심 분리기에서 BALF. 두 가지로 세포 상등액을 전송 -80 ° C에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소를 prelabeled </li><li> 희석하지 않고 ELISA 또는 다른 유사한 분석에 의해 BALF 사이토 카인을 평가합니다. </li><li> C. ° -80에서 보관되지 않은 혈청 및 BALF </li></ol> 5. 차동 염색 및 BAL 세포질 평가 <ol><li> BALF 원심 HBSS하고 완전한 제거에 따라, 저장성 염수를 사용하여 펠렛 화 적혈구를 용해. 증류수 900 μL에 세포를 재현 탁. 즉시 배 PBS 100 μl를 추가합니다. </li><li> 개별적으로 각각의 샘플을 용해. 샘플은 적혈구의 과도한 양을 포함하는 경우, 세포를 5 분 및 적혈구 세포 용해 프로토콜이 반복 될 수있다 400 XG에서 테이블 탑 원심 분리기에서 펠렛 화 될 수있다. </li><li> 트리 판 블루 염색과 10X 20 X 배율에서 hemacytometer를 사용하여 1 ㎖ 서스펜션 총 BALF의 세포질을 결정합니다. 평가 및 세포 / ml로 이러한 데이터를 제공. </li><li> cytospin 및 차등 염색 재료를 준비합니다. 연필이나 용매 저항하는 펜을 사용하여 표준 현미경 슬라이드 레이블을 지정합니다. cytospin 브래킷 및 깔때기에 슬라이드를 고정합니다. cytospin의 회 전자에 슬라이드 어셈블리를 고정합니다. </li><li> 5 분 100 XG에 BALF의 Cytospin 150 μL. 세포 밀도 효과적으로 너무 크면, 세포 형태를 평가 슬라이드에 스핀 다운 볼륨을 줄일 수 있습니다. 슬라이드 밤새 건조 공기를 허용합니다. </li><li> 차등 제조 프로토콜 다음 슬라이드를 얼룩. 슬라이드 밤새 건조 공기를 허용합니다. 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입을 사용하여 슬라이드를 커버 슬립하고 20X 및 40X 대물 탑재 현미경을 사용하여 슬라이드를 평가한다. </li><li> 그러한 FACS, 전자 현미경, 공 초점 현미경, 유전자 발현의 평가를 위해 RNA 추출 및 / 또는 웨스턴 블롯에 대한 단백질 추출 등의 후속 분석을 위해 남아있는 세포를 수확. </li></ol> 6. 조직 병리학의 평가 <ol><li> 조직 병리학 평가를위한 폐를 준비합니다. 포르말린 고정의 24-48 시간 후, 배쪽으로 전체 비정상적으로 폐의 방향과 파라핀. 메인 전도기도를 노출하는 결과 블록을 잘라. </li><li> 채점의 정확도를 개선하기 위해, 동일한 위치에있는 폐 위치 및 t의 최대 길이 시각화를 수득 각 블록 트림그는 주요 축기도를 폐내. 이 시점에서, 5 미크론 시리얼 섹션과 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E)와 얼룩을 잘라. 추가 부분은 잘라 표준 프로토콜을 사용하여 현장 하이브리드 화에 대한 제조 할 수있다. </li><li> 0 (결석) 및 3 (중증) 사이에 득점하는 다음과 같은 염증 매개 변수에 기초하여 반 정량적 평가 시스템 사용 조직 병리를 평가 : 단핵구와 다형 핵 세포 침윤; 상피 세포의 증식과 부​​상을기도; 넘쳐; 혈관 주위와 peribroncheolar 바지를 접; 염증과 관련된 폐의 비율. 폐 조직 병리는 경험 병리학 자에 의해 평가되어야한다. </li><li> 총 조직 병리학 점수를 생성하거나 질병의 진행의 특정 측면을 정량화 개별 점수를 사용하는 매개 변수의 점수 모두 평균. 유전자형과 치료에 모두 눈을 멀게 검토와 함께, 이중 맹검 방식으로 모든 채점을 실시한다. 이 채점 시스템은 previousl왔다Y는 6,7,10을 설명했다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

다음과 같이 성공적으로 마우스의 폐에서 호스트 면역 반응을 평가하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 평가중인 모델에 대한 적절한 마우스 긴장과 섹스를 선택; 2) 폐에 PAMP 전달을 최적화; 3) 제대로 수집하고 BALF를 처리; 4) 제대로 해결 및 조직 병리학 적 평가를위한 폐의 준비. 마우스 균주의 선택은 숙주의 면역 반응을 평가하는 중요한 요소이다. C57BL / 6 마​​우스는 일반적으로 인해 대부분의 PAMPS에 자신의 TH1 기울이기 강력한 대응에 선천성 면역 연구를위한 최적의 마우스 배경으로 간주됩니다. 마찬가지로, BALB / c 마우스는 일반적으로 인해 TH2의 기울이기로 알레르기 질환 모델 연구에 사용됩니다. 폐암 모델에서 세 번째 일반적으로 사용되는 균주는 유전자 변형 동물을 생성하는 공통의 사용으로 인해 129SvEv 배경에 마우스입니다. 모든 경우에,주의는 실험 설계와 가능하면, 연령과 성별에 엄마시주의해야한다tched 리터 메이트 대조...

병원성 박테리아 종과 관련된 폐 감염은 글로벌 병적 상태와 사망률의 흔한 원인이다. 이들 병원균에 대한 숙주 면역 반응을 구동 메커니즘을 결정하는 것은 이러한 감염의 영향을 약하게 할 신규 예방 전략 및 치료제의 개발을 촉진 할 것이다. 여기에 설명 된 프로토콜의 전반적인 목표는 생균에 대한 대리 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)를 사용하여 병원균 감염에 대한 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 위해 유연한 방식으로 사용자에게 제공하는 것이다. 박테리아 숙주 선천성 면역 반응을 평가하기 이전 연구의 대부분은 의한 실행의 상대적 용이성 복막 모델에 초점을 맞추고있다. 이 모델은 매우 유용하고 호스트 병원체 상호 작용과 전신 염증의 분야에서 상당한 발전시킬 수도 있지만,이 모델에서 생성 된 데이터는 항상 연구에 적합하지 involvi호흡기를 겨. 여기서, 급성 폐 염증의 폐 모델은 고전 복강 내 (IP) 주입 모델과 실제 임상 적으로 관련된 확장으로서 제안되어있다. 제안 된 기술은 특정 장기 모델 시스템에서의 선천성 면역 반응의 평가를 위해 로컬 허용한다. 여기서 설명한 방법은 사용자가 공통 PAMP이다 LPS에 숙주 면역 반응을 평가할 수있는 간단하고 강력한 기술을 제공하도록 설계된다. 방법은 기관 내 마우스 및 호흡기 질환 및 급성 폐 손상 1에서 고통받는 인간의 환자에서 관찰되는 병리 생리 학적 기능의 많은 모방의 폐에 강력한 선천성 면역 반응을 유도 LPS의 (IT) 점안을 기반으로합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 생체 내 연구에서 수행과 관련된 교란 변수 및 안전 우려없이 숙주 면역 반응을 평가할 수 있다는 것이다살아있는 박테리아를 사용하여. 마찬가지로,이 프로토콜에 설명 된 노출의 인두 IT 관리 경로 관리 (의) 비강 수술 IT 관리 등 다른 일반적으로 사용 기술에 비해 상당한 장점이 있습니다. 예를 들어, 인두 IT 관리는 일반적으로 인해 비강에있는 에이전트의 손실로 폐 증착의 변동성이 증가 시달리고 2-4 부비동 관리,의에 비해 상대적으로 정확한 dosaging과 폐 증착 할 수 있습니다. 그것의 투여 경로는 이러한 충치를 우회하고 기관과기도에 직접 액세스 할 수 있습니다. 마찬가지로, 수술의 IT 접근 방식은 훨씬 더 병적 관리 방법 및 마스터에 광범위한 교육이 필요합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 일반적인 기술 및 염증의 진행을 평가하고 LU를 제조하는데 적절한 기술을 설명하는 프로토콜을 종료하는 데 사용되는 대리 마커 설명을 포함조직 병리학 평가를위한 NGS. 이러한 프로토콜은 각각의 동물에서 생성 된 데이터를 최대화함으로써 각각의 연구에 필요한 생쥐의 수를 최소화하는 데 초점을 맞추고있다. 설명하는 프로토콜은 매우 유연하고 쉽게 다양한 범위의 PAMPS 손상 관련 분자 패턴 (감쇠)을 평가하기 위해 수정 될 수 있습니다. 또한, 몇 가지 추가 수정,이 프로토콜은 또한 알레르기 성기도 질환의 진행 또는 살아있는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 5-10와 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 연구에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>잭슨 연구소</td><td>주식 000664</td><td></td></tr><tr><td>컴팩트 스케일</td><td>Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>소형 동물 직장 온도계</td><td>Braintree Scientific</td> 설치류용 <td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>직장 프로브</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>귀 펀치</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline Life Technologies</td><td></td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td><td>ICAP Manufacturing</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>설치류 삽관 스탠드</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>가위(무디기/날카로움)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>집게(직선)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>집게(45&ordm;, 곡선)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>가위(뭉툭한/뭉툭한)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>피펫(200 &마이크로; l 용량)</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>BD Medical</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 주사기</td><td>BD Medical</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0.5 in Needle</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>1.2mm 기관 캐뉼라, 루어 어댑터가 있는</td><td>하버드 장치</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 실크 꼰 외과용 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>루어-튜브 커넥터 키트</td><td>하버드 장치</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>루어 스톱콕 키트</td><td>하버드 장치</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Tygon formula E-3603 실험실 튜빙</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>포르말린 솔루션, 중성 버퍼, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL-1&beta; OptEIA ELISA 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IL-6 OptEIA ELISA 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>마우스 TNF-&alpha; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>혈구계 커버 안경</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>세포학 깔때기 클립</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10-357</td><td></td></tr><tr><td>세포학 깔때기</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>필터 카드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>사이토스핀 세포 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff 빠른 염색 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>47733150</tr><tr><td>퍼마운트 마운팅 미디엄</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 pamp 관리 및 폐포의 활용

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

병원체에 대한 숙주 면역 반응은 복잡한 생물학적 과정이다. 생체 내 연구의 대부분은 고전적인 호스트 병원체 상호 작용이 생쥐를 선택 세균이나 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)의 복강 내 주사의 장점을 특성화하기 위해 사용. 이러한 기술은 감염증 한테 진찰 Pathobiology와 관련된 엄청난 데이터를 산출하고 있지만, 복강 내 주사 모델은 항상 폐에 호스트 병원체 상호 작용 연구에 적합하지 않다. 생쥐의 급성 폐 염증 모델을 이용해서, 그 선천적 면역 반응은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)를 이용하여 호스트의 고해상도 분석을 수행 할 수있다. 여기서는, 비수술 인두 기관 내 투여를 이용하여 LPS를 관리 질병 병인과 관련된 임상 매개 변수를 모니터링하고, 숙주 면역 반응을 평가하기 위해 기관지 세정액을 활용하는 방법을 설명한다. 설명하는 기술PAMPS 및 병원균의 다양한 범위에 호스트 타고난 면역 반응을 연구하는데 널리 적용 할 수있다. 마찬가지로, 약간의 수정과 함께, 이들 기술은 또한 알레르기 성기도 염증을 평가 연구 및 약리학 애플리케이션에 적용될 수있다.

그람 음성 박테리아의 세포벽은 환경에 매우 풍부 LPS로 구성된다. 민감한 인간의 인구에 LPS를 흡입하면기도 반응성을 악화하고 강력한 면역 response11을 트리거 할 수 있습니다. LPS는 또한 강력한 선천성 면역 반응을 유도하도록 마우스 모델에서 사용되는 일반적인 PAMP이다. 프로토콜이 여기에 설명에서는, 마우스는 E.에서 격리 LPS의 그것의 복용량을받은 대장균 : 인두 IT 관리를 사용하여 (혈청 형 0111 B4). LPS 노출 모델에서 체온과 체중 모두 동물의 사망률과 질병의 진행의 전형적인 대리 마커입니다. LPS의 문제는 점차적으로 24 시간 (그림 1A)의 과정을 통해 다시 기준선에 증가하는 최초의 6 시간 내에 체온 크게 감소의 원인이됩니다. 이 피크 서서히 N에 복구 곳에 그러나 체중은 꾸준히, 24 시간의 과정 (그림 1B) 이상 감소 할 것이다48 ~ 72 시간 내선. 따라서, 체온은 염증의 개시의 초기 ...

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 구강인두 기관 내 LPS 투여 및 기관지폐포 세척법을 사용하여 마우스의 숙주 면역 반응을 평가하는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 구강인두 투여 방식을 통해 마우스에 LPS를 접종함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 기관 캐뉼라를 삽입하고, 해당 캐뉼라를 통해 기관지폐포 세척액을 수집하여 국소 염증 반응을 평가합니다.마지막 단계에서 폐는 조직병리학적 평가를 위해 포르말린으로 팽창시킵니다. 최종적으로 장의 사이토카인 프로파일과 폐의 조직병리학적 상태를 분석하여 LPS에 대한 숙주의 면역 반응을 평가할 수 있습니다. 비강 내 투여나 수술적 기관 내 투여와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 수행 방법이 상대적으로 간단하며 정확한 투여량 조절과 폐 침착이 가능하다는 점입니다.먼저 LPS를 기관 내로 주입합니다. 마취된 마우스를 기관 삽관 상태로 고정합니다. 동물이 안전하게 구속되고 입과 혀에 접근할 수 있도록 앞니 부분을 잡고 대기합니다.직선 포셉으로 혀를 조심스럽게 고정한 다음, 굴곡 포셉으로 혀를 잡고 혀를 잡은 상태에서 약간의 저항이 느껴질 때까지 근육을 입 밖으로 조심스럽게 끌어냅니다. 이 상태에서 목구멍 뒤쪽에 50 µL의 LPS를 투여하고, 희생 후 세척액을 수집하기 위해 즉시 장갑을 낀 손가락으로 동물의 콧구멍을 5~10회 호흡 동안 막아줍니다. 그다음, 복강의 길이를 따라 가로로 절개하고, 복강에서 생쥐의 하악까지 세로로 절개합니다.그런 다음 포셉으로 절개 부위의 양측을 잡고 피부를 아래쪽의 복강 및 흉강으로부터 부드럽게 당깁니다. 다음으로, 횡격막이 잘리지 않도록 주의하면서 생식기부터 흉골까지 복강의 길이를 따라 크게 절개합니다. 그런 다음 복강 내의 장을 부드럽게 밀어내어 신장 중 하나에 접근할 수 있도록 합니다.관류를 위한 배출 지점으로 사용하기 위해 신장으로 이어지는 신정맥을 절단합니다. 그런 다음 가위로 횡격막을 살짝 절개하되, 폐와 심장이 손상되지 않도록 주의합니다. 심장의 왼쪽 면을 노출시키기 위해 27 gauge 바늘이 장착된 10 milliliter 주사기를 사용하여 심장에 PBS를 수동으로 관류합니다.남은 혈액은 문맥 절개 부위를 통해 배출되어야 합니다. 그다음 둔탁한 가위를 사용하여 흉골을 따라 흉곽을 조심스럽게 절개합니다. 이때 심장과 폐가 잘리지 않도록 주의하십시오.심장과 폐를 조심스럽게 분리한 다음, 둔단 가위를 사용하여 갈비뼈 케이지의 각 섹션을 척추에 최대한 가깝게 조심스럽게 절개합니다. 양쪽 갈비뼈 섹션을 완전히 제거한 후, 침샘을 분리하여 기관을 노출시키고 기관 자체를 자르지 않도록 주의하며 기관 위를 덮고 있는 근육을 조심스럽게 절개합니다. 이제 쇄골을 분리하고 흉선을 부드럽게 잡아 심장에서 들어 올립니다.그 다음, 심장이나 폐를 자르지 않도록 주의하며 가위로 흉선을 제거합니다. 이어서 각도가 진 날카로운 가위를 사용하여 후두에서 한두 개의 고리 아래쪽 기관에 캐뉼라를 단단히 고정할 수 있을 정도의 작은 수평 절개를 실시합니다. 그런 다음, 테이퍼진 끝부분이 기관 고리 2~3개 길이만큼 연장되도록 캐뉼라를 삽입합니다.절개 부위 아래에서 기관과 식도 사이에 실크 봉합사를 통과시킨 후, 캐뉼라를 고정하기 위해 봉합사를 단단히 잡아당깁니다. 그런 다음 1 mL 주사기에 HBSS를 채우고, 천천히 일정하게 움직여 루어(lure)를 캐뉼라에 부드럽게 삽입합니다. 다음으로, 폐를 팽창시키기 위해 약 900 µL의 HBSS를 기관 내로 주입한 후, 즉시 HBSS를 다시 뽑아내어 회수된 액체를 15 mL 원추형 튜브에 분주합니다.세척 과정을 두 번 더 반복하여 약 3 mL의 세척액을 수집합니다. 폐를 해부하기 위해 세척액을 얼음 위에 보관하십시오. 조직병리학적 분석을 위해, 10 mL 주사기를 폐 팽창 스탠드에 삽입하고 튜브를 루어(lure)에, 루어를 스톱콕(stopcock)에, 그리고 스톱콕을 주사기에 연결합니다. 스톱콕이 닫힘 위치에 있는지 확인한 후, 주사기에 중성 완충 포르말린 용액을 채웁니다. 주사기에 고정액이 완전히 채워지면, 튜브의 열린 끝부분 아래에 흡수성 타월을 놓고 스톱콕을 열어 고정액이 튜브를 채우도록 합니다.고정액이 튜브에서 흐르기 시작하면 즉시 스톱콕(stop cock)을 잠그고 주사기에 고정액을 가득 다시 채웁니다. 그런 다음 두 번째 봉합사를 기관 아래로, 대략 1~2개의 기관 고리 위치에 부드럽게 통과시킵니다. 캐뉼라 끝부분 아래에서 봉합사로 느슨하게 단일 매듭을 지은 다음, 마우스 팽창용 튜브를 삽입합니다.캐뉼라에 세워 둡니다. 스톱콕을 열고 중력 팽창을 통해 폐가 채워지도록 합니다. 폐가 최대 팽창 수준에 도달하면 봉합사를 팽팽하게 당겨 두 번째 매듭을 묶습니다.스톱콕을 잠그고 캐뉼라에서 튜브를 제거한 다음, 포셉으로 봉합사를 잡습니다. 봉합사를 흉강 쪽으로 단단히 당기면서 캐뉼라를 마우스의 코 방향으로 천천히 당겨 캐뉼라를 제거합니다. 다음으로, 기관을 목강에서 부드럽게 들어 올린 후 뭉툭한 가위를 사용하여 결찰 봉합사까지의 기관 부위를 절단합니다.기도가 하부 조직으로부터 분리되면, 기도를 마우스로부터 당기기 시작하여 폐를 흉강 밖으로 조심스럽게 들어 올립니다. 그런 다음, 폐를 흉강에 고정하고 있는 결합 조직을 일정한 상향 힘으로 조심스럽게 절단하며, 폐가 손상되지 않도록 주의하면서 기도를 마우스의 몸체로부터 계속해서 당깁니다. 마지막으로, 폐를 10 milliliters의 완충 포르말린에 고정합니다.LPS 노출 모델에서 동물의 이환율과 질병 진행의 전형적인 대리 마커인 체온과 체중을 살펴보면, 그래프에 나타난 바와 같이 LPS 챌린지 후 처음 6시간 이내에 체온이 유의미하게 감소하며, 이후 24시간에 걸쳐 점진적으로 기저치로 회복됩니다. 반면, 체중은 24시간 동안 꾸준히 감소하여 최저점에 도달한 후, 다음 48~72시간에 걸쳐 서서히 회복됩니다. 따라서 체온은 염증 개시의 초기 단계를 평가하는 데 더 적절한 마커입니다.체중은 병인 및 회복의 후기 단계에서 더 신뢰할 수 있는 지표인 반면, 기도를 통한 LPS 노출은 백혈구의 상당한 유입을 초래합니다. 노출 후 처음 6시간 이내의 폐에서는 숙주의 선천 면역 반응과 관련된 세포들이 밸브 내에서 관찰될 수 있습니다. 이후 세포 밀도는 면역 반응이 정점에 이르는 24~48시간 동안 계속해서 증가하며, 그 후 염증 해소 단계로 진입합니다. 24시간이 되면 폐에 상당한 수의 호중구가 존재하며, 분별 염색 후 밸브에서 이를 관찰할 수 있습니다.판막 세포성 평가는 폐 내 호스트 면역 반응과 관련된 세포를 특성화하기 위한 강력하고 정량화 가능한 기술을 제공합니다. 이러한 증가는 기도, 혈관 및 폐 실질로의 상당한 호중구 유입과 일치합니다. 폐 조직 병리학은 이미지에서 볼 수 있듯이 반정량적 점수 시스템을 사용하여 효과적으로 평가할 수 있습니다.LPS는 혈관 주위, 세기관지 주위 및 실질의 염증을 유의하게 증가시킵니다. LPS 투여는 Eliza로 검출되는 선천 면역 반응과 관련된 여러 사이토카인을 포함하여, 높은 수준의 국소 및 전신 전염증성 매개체들을 유도합니다. LPS 투여 후 폐에서 상향 조절되는 일반적인 사이토카인에는 TNF, alpha IL one beta 및 IL six가 포함됩니다. 전신 사이토카인 수치는 장 평가에서 입증된 것과 동일한 기술을 사용하여 혈청에서도 평가할 수 있습니다.중력 변위 고정법은 팽창시키지 않은 폐나 중력으로 고정한 수동 팽창 폐와 비교하여 최적의 조직병리학적 평가 조건을 제공합니다. 팽창된 폐는 균일한 특징을 보여 정확한 점수 산정, 폐포 손상 감소, 시각화 향상 및 더 높은 해상도의 염증 평가가 가능합니다. 폐를 수동으로 팽창시키면 일반적으로 팽창 부위가 불균일하게 나타납니다. 이러한 부위는 종종 부분적으로만 팽창되어 조직 허탈이 발생하며, 이는 초보 검토자에 의해 병리적 특징으로 오인되는 경우가 많습니다.수동 팽창 또한 폐의 일부 영역을 과팽창시켜 폐포 공간에 광범위한 손상을 초래합니다. 팽창되지 않은 폐는 폐포 공간이 허탈된 모습을 보이며, 숙련된 훈련 없이는 이를 구분하고 평가하기 어렵습니다. 마찬가지로, 장기가 허탈된 상태이기 때문에 이 기법으로는 폐의 in situ 상태를 시각화할 수 없습니다.이 영상을 시청한 후, 간단한 비수술적 구인두 및 기관 투여 절차와 조직 채취를 통해 마우스에서 LPS 매개 급성 폐 염증을 유도하고 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

쥐 호흡 생리학과기도 염증 세포의 샘플링의 반복 측정이 바람직하지만, 일반적으로 가능하지 않습니다. 여기 구두기도 염증 세포의기도 기능 항 진성과 샘플링의 반복 측정을 허용 쥐를 intubating에 대한 반복 방법을 설명합니다.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

우리는기도를 통해 anesthetized 생쥐의 폐에 시험 물질의 비 수술 전달을 보여줍니다. 이 방법은 세균과 바이러스 병원균, 크린 시토킨, 항체, 구슬, 화학, 또는 염료로 폐 노출 수 있습니다. 우리는 더 이상 수확 및 유동세포계측법에 대한 폐, 폐 배수 림프절 (LDLNs) 처리 설명합니다.

유동세포계측법에 의해 폐, 폐 배수 림프절의 분석과 마우스의 비 수술 Intratracheal 떨어뜨림

우리는 2.0 mm 검경과 이경을 사용하여 직접 후두경을 통해 마우스에서 기관 내 삽관을위한 간단하고 신뢰할 수있는, 그리고 상대적으로 저렴한 방법을 개발했습니다. 이 기술은 atraumatic이고 만성 실험에서 반복 측정에 사용될 수있다. 우리는 우수한 기관 절개 또는 이전에 비수술 적 방법을보고 찾을 수 있습니다.

마우스의 기관 내 삽관<em&gt;를 통해</em이경 사용&gt; 직접 후두경

시약의 기관 내 삽관 매개 (IMIT) 점안 호흡기 질환뿐만 아니라 폐에 직접 치료 시약을 주액하는 방법을 연구 우수한, 비 침습적 방법이다. 이 임상 시험에 적합한 신속하고 재현성이 높은 방법이다.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

본 문서에서는 마우스 모델에서 BCG를 사용하여 비강 내 및 피하 면역에 의해 유도된 보호 효능 및 폐 면역 반응을 비교하기 위해 따랐던 방법론을 자세히 설명합니다. 본 연구의 결과는 폐 백신 접종의 이점을 보여주며, 백신 유도 보호에서 IL17 매개 반응의 역할을 시사한다.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

여러 가지 방법 마우스에서 세균성 폐렴 모델링 문헌에 기재되어있다. 여기서, 우리는 구강 인두로 피펫 세균 접종의 흡인 (즉, 흡입)를 통해 폐렴을 유도하기위한 비 침습적, 저렴하고 빠른 방법을 설명합니다. 폐 선천성 면역 반응의 평가를위한 다운 스트림 방법도 자세히 설명되어 있습니다.

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

폐의 건강 상태는 폐의 세기관지에있는 면역 세포의 유형과 수에 의해 반영됩니다. 우리는 비 흡착성 세포와 쥐의 하부 호흡기에서 용해되는 요소를 분리하고 연구 할 수있는 기관지 폐포 세척 기술에 대해 설명합니다.

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

여기에서 우리는 비침습적 구인두 기관내 삽관을 통한 기관내 지질다당류(LPS) 전달을 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 동물에 대한 수술 절차의 외상을 최소화하고 LPS를 기관으로 정확하게 전달한 다음 폐로 전달합니다.

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

배우세요 마우스에서 LPS 경구인두 기관 내 투여 및 폐포 세척을 이용한 호스트 면역 반응 평가 방법을. 이 기술은 정확한 투여량과 폐 침착을 가능하게 하여 염증 반응 및 조직병리학적 변화를 고해상도로 분석합니다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

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