Name: 바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 배우세요 담배 나무 잎에서 대사 산물과 RNA를 추출하고 분석하는 방법을. GC-MS와 RNA 시퀀싱을 활용하여 Nicotiana glauca의 대사 프로파일을 최적화하고 바이오 기반 산업에 활용 가능한 유용한 화합물을 식별합니다.

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도미닉 스윈튼 (녹색 연료), 토마스 로워 (녹색 연료), 샘 Buekenhout (Capax), 그리고 실비아 Drouven (Capax) : MultiBioPro 또한 프로젝트에 기여하는 다음과 같은 사람들에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 식물 소재 M2 전문 성장 매체를 포함하는 30cm 지름의 냄비는 담배 glauca 식물을 성장. 낮 20 ~ 25 ° C의 온도와 15 ° C.의 야간 온도, 온실에있는 식물을 성장 보조 빛 체제로 16 시간 빛과 8 시간의 어둠의 사이클을 사용합니다. 2. 샘플 준비 <ol><li> 차 대사 산물의 경우 : <ol><li> 수확 식물 재료 (나뭇잎과 N.의 glauca의 줄기)과 동결 재료 즉시. </li><li> 사흘 동안 동결 건조하여 냉동 식물 재료를 냉동 건조. </li><li> 금속 공 믹서 분쇄기에 의해 동결 건조 된 샘플을 갈기. </li><li> 2 ML의 원심 분리기 튜브 또는 유리 병에 나누어지는 미세 연마 건조 재료. </li></ol></li><li> 이차 대사 산물의 경우 : <ol><li> 수확 식물 조직 및 동결 재료 즉시. </li><li> m로 고정 된 식물 조직을 갈기스테인리스 공 또는 박격포와 유 봉으로 ixer 밀. </li><li> 2 ㎖의 원심 분리 관 (약 20 mg의 젖은 무게)로 나누어지는 미세 연마 조직. </li></ol></li></ol> GC-MS에 의한 차 대사 산물에 대한 대사 산물 프로파일 3. 추출 프로토콜 <ol><li> 나누어지는 지상 건조 식물 소재 (잎의 10 ㎎과 줄기 물질 20 ㎎)을 2 ㎖의은, 둥근 바닥 튜브 스크류 캡. </li><li> 10 초 동안 100 %의 메탄올과 소용돌이의 1,400 μl를 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 내부 정량적 기준과 소용돌이로 리비 톨의 60 μL (H 2 O 0.2 ㎎ / 밀리리터)를 추가합니다. </li><li> 하나의 스테인레스 스틸 (지르코니아) 공을 추가하고 25 Hz에서 2 분 믹서 밀 자료를 균질화. </li><li> 11,000 X g에서 10 분 동안 혼합을 원심 분리기. </li><li> 유리 병에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 클로로포름 750 μl를 추가합니다. </li><li> H 2 O 1500 μl를 추가하고 10 초 동안 혼합을 소용돌이. </li><li> 에서 150 μl를 전송신선한 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 상위 단계 (극성 단계). </li><li> 속도 진공 청소기를 사용하여 건조 샘플. 그것은 잔여 액체가 존재하지 않을 때까지 샘플을 3 내지 24 시간 동안 건조시킨다하는 것이 필수적입니다. </li><li> 메 톡시 아민 염산염 (피리딘 20 ㎎ / ㎖)의 40 μl를 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 수평 열 블록 통에 믹스를 흔들어 </li><li> 70 μl의 N-메틸-N을 추가 - (트리메틸 실릴) - 트리 플루오로 MSTFA 믹스. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 혼합을 흔들어 </li><li> 11,000 X g에서 ~ 1 분 짧은 원심 분리하여 커버에 방울을 스핀 다운. </li><li> GC-MS 분석에 적합한 유리 병에 액체를 전송합니다. </li></ol> LC-MS에 의한 이차 대사 산물에 대한 대사 산물 프로파일 4. 추출 <ol><li> 동토의 샘플을 500 ㎕의 메탄올을 추가합니다. </li><li> 70 ° C (1,000 초 -1)에서 15 분 동안 thermomixer 쉐이크. </li><li> 샘플을 (원심 분리기 5 마일N, 20,000 XG) 및 1.5 ㎖의 원심 관에 옮겨 액상. </li><li> 원심 증발기 (를 Speed​​vac)과 액상을 냉동 건조. </li><li> 건조 펠릿에 100 ㎕의 시클로 헥산 100 μL의를 MilliQ 물을 추가합니다. </li><li> 실내 온도 (사용 소용돌이)에서 5 분 동안 샘플을 흔들어. </li><li> 샘플 (5 분 20,000 XG)를 원심 분리기. </li><li> LC-MS 분석을위한 원뿔 바닥과 LC-MS 주입 작은 유리 병에 물을 단계 (낮은 단계)의 80 μl를 전송합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 XCMS 8을 구성하고 처리 할 수있는 데이터 분석을 선택합니다. </li><li> 표 1의 화합물의 종류에 따라 관심의 검출 된 피크의 테이블을 준비합니다. </li><li> 표준 화합물의 공동 용출 피크를 확인합니다. </li><li> 이후의 MSN 분석, 구조적 특성 알고리즘 9, 10, 문학의를 사용하여 검출 된 피크를 주석urvey 및 대사 데이터베이스 검색 (11, 12). </li></ol> 6. 탄화수소 추출 13 <ol><li> 갓 수확 N. 잠수함 2-20 분 동안 HPLC 급); glauca 잎 (메탄올, 에탄올, 클로로포름, 헥산 또는 석유 에테르 (비점 40 ~ 60 °의 C 또는 60-80 °의 C) 용매 (~ 200 mg)의 (5 ㎖. </li><li> 잎을 제거하고 회전 증발에 의해 완전히 용매를 건조. </li><li> 헥산을 Resuspend 샘플 (1 ㎖, HPLC 등급). </li><li> 가스 크로마토 그래피 및 5973MSD에 하이픈을 사용하여 GC-MS 분석을 수행합니다. 다음과 같이 작동 조건이되어야합니다; 캐리어 가스, 0.9 ㎖의 분 -1 / 11 PSI의 유량으로 헬륨. 280 ℃에서 splitless 인젝터 샘플 (1 μl를) 주입 4 ° C / 분 C. ° 320에 올렸 전에 5 분 동안 70 ° C에서 기체 크로마토 그래피 오븐을 잡고 67.5 분의 총 시간을 만들고, 추​​가로 10 분 동안 최종 온도를 잡습니다. 280 ° C와 P에서 MS와 인터페이스를 설정erform 70 eV의 EI +를 사용하여 전체 검사 모드에서 MS와 10 ~ 800 D.에서 스캔 </li><li> 처음 크로마토 그램의 자동화 된 MS의 컨볼 루션 및 확인 시스템 구성 요소 및 NIST 98 MS 라이브러리를 사용하여 식별 된 것을 처리합니다. </li><li> 알려진 확실한 기준을 유지 시간과 고전적인 조각의 패턴을 비교하여 포화 긴 사슬 알칸 탄화수소 (hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane 및 tritriacontane)의 신분을 확인합니다. </li><li> 정통 표준에서 생성 투여 량 반응 곡선 (0.07-2.5 MG)와 통합 피크 면적을 비교하여 정량적으로 탄화수소를 결정한다. </li><li> 수단 및 Excel 소프트웨어를 사용하여 수단 (SEM)의 표준 오차를 계산한다. </li></ol> 이소 프레 노이드 (14) 7. 분석 <ol><li> 2 절에서 설명한 바와 같이 균질화를 수행합니다. 원심 분리 관에 균질화 동결 건조 분말 10 ㎎에 무게.</li><li> 분말에 순차적으로 250 ㎖의 메탄올을 추가 혼합 한 후 500 ㎖의 클로로포름 (실험실 시약 급)을 추가하고, 소용돌이로 교반하여 혼합. </li><li> 20 분 동안 어둠 속에서 얼음에 샘플을 둡니다. </li><li> 현탁액에 250 ㎖의 트리스-HCl 완충액 (100 mM의, 산도 7.5) 또는 물 (HPLC 급)를 추가하고 소용돌이로 교반하여 혼합한다. </li><li> 수성 상으로부터 비극성을 분리하는 5 분 동안 12,000 rpm으로 (13,523 XG)에서 상기 혼합물을 원심 분리기. 이소 프레 노이드 추출물을 함유하는 비극성 클로로포름상은 아래쪽에있다. </li><li> 새로운 원심 관에 위상을 전송합니다. </li><li> 수성 상을 추가 500 ㎖의 클로로포름을 추가하고, 와동과 전술 한 바와 같이 원심 분리에 의해 두 번째 추출한다. </li><li> 클로로포름 추출물을 결합하고 분석 할 때까지 -20 ° C에서 증발기와 저장소를 사용하여 건조하는 샘플을 가져옵니다. </li><li> 재료를 재용하기 위해 건조 된 이소 프레 노이드 추출물을 50 ㎖의 에틸 아세테이트 (HPLC 급)를 추가합니다. </li><li> C18에 3 ㎖를 주입UPLC ACQUITY 분리 모듈을 사용하는 컬럼. 안료를 구분하는 데 사용되는 그라데이션을 포함한다; A : 메탄올 / H 2 0 (50:50) 및 B : 아세토 니트릴 / 에틸 아세테이트 (75:25), 초기 조건은 30 % (V / V) 및 B는 70 % (V / V) (100)로 이동해야합니다 6 분 % 이상 B. 0.6 ㎖ / 분의 유속을 사용한다. </li><li> 250 ~ 600 nm의에서 포토 다이오드 어레이 (PDA) 검출기를 지속적으로 용출액을 모니터링합니다. </li><li> 공동 크로마토 그래피 정통 표준, 베타 카로틴 (프로 비타민 A), phytoene, 리코펜, 루테인과 제아잔틴 사이의 스펙트럼을 비교하여 구성 요소를 식별합니다. </li><li> 용량 반응 곡선에서 정량화를 수행합니다. </li><li> LC-MS를 사용하여 화합물을 확인; 비슷한 크로마토 그래피 조건을 사용합니다. 검출 Q-TOF 악기와 긍정적 인 모드로 APCI 이온화를 사용하여 수행해야합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 50 ° C에서 6 % KOH에서 추출하고 비누화 된 25 mg의 동결 건조 된 물질로 토코페롤 결정에 대한 수정 작업을 수행합니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 8. RNA 시퀀서에 대한 RNA 추출 이 프로토콜은 높은 품질의 RNA를 얻기 위해 RNeasy 키트 트리 졸 RNA 추출을 결합한다. <ol><li> 믹서 분쇄기에 의해 금속 공 2 ㎖ 원심 분리기 튜브 냉동 식물 재료 100 mg의 갈기. </li><li> 1 ㎖ 트리 졸을 추가합니다. </li><li> 4 ℃에서 12,000 XG에 10 분의 재료를 원심 분리기 </li><li> 새로운 반응 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 200 ㎕의 클로로포름을 추가 튜브를 여러 번 반전, 실온에서 3 분을 품어. </li><li> 4 ℃에서 12,000 XG에 15 분 동안 혼합을 원심 분리기 </li><li> 새로운 반응 관에 위 수상 (약 700 μL)를 전송합니다. </li><li> 에탄올의 약 2.5 볼륨 (100 %)를 추가 튜브를 여러 번 반전, -80 ° C에서 30 분 동안 배양 </li><li> 키트에서 스핀 컬럼에 대한 침전물을 포함하는 샘플을 이동합니다. </li><li> 8,000 XG에 15 초 동안 열을 원심 분리기, 그리고 F를 폐기을 통해 저. </li><li> 8,000 X g에서 스핀 열 15 초 동안 원심 분리기 700 μL 버퍼 RW1을 추가합니다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 스핀 컬럼에 500 μL 버퍼 RPE를 추가하고 8,000 X g에서 15 초 동안 열을 원심 분리기. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 8,000 X g에서 스핀 열 및 2 분 동안 원심 분리기 500 μL 버퍼 RPE를 추가합니다. </li><li> 새로운 1.5 ㎖의 반응 관에 스핀 열을 배치하고 50 μL의 RNase가없는 물을 추가합니다. </li><li> RNA를 용출 8,000 XG에서 1 분 동안 열을 원심 분리기. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 Ambion의 DNA 프리 키트를 사용하여 잔류 DNA를 제거합니다. </li><li> RNA의 품질을 결정합니다. RNA는 8 위의 RNA 무결성 번호 (RIN)을해야한다. </li><li> 차세대 염기 서열의 RNA를 보냅니다. </li></ol>

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</ol>

이러한 결과로 이어지는 연구 보조금 계약 번호 311804에서 유럽의 제 7 차 프레임 워크 프로그램 ([FP7/2007-2013])로부터 자금을 받았다.

여기에 제시된 프로토콜은 대사와 성적 증명서에 담배 나무 잎을 분석 할 수있는 포괄적 인 프레임 워크를 제공합니다. 그것은 이러한 공동 노력은 탄화수소이 조직에 존재하는 높은 가치의 화합물의 합성 및 압출의 기초가되는 과정에 새로운 통찰력으로 우리를 제공해야한다는 예상된다. 이러한 접근 방식은 따라서 우리에게 화합물 합성되는 방법에 대한 더 나은 이해를 제공한다. 작품의 담배 트리 양태에 더하여, 또한, 특히 보조 벽 구조 lignification 타겟팅, 또한 우리가 유용한 화합물의 추출을 위해 수피를 사용할 수 있는지 여부를 탐구 포플러 생물량을 개선하는 것을 목표로한다. 본 논문에서 제시하는 방법은 신진 대사 프로파일에 대한 표준화 된 방법의 약간의 수정이다. 이러한 방법은 물론 알려진 신진 대사 프로파일로 제한하고 있으며, 그것은 몇 가지 새로운 신진 대사 피크 승으로 취득 할 수 있습니다 것이 가능하다HICH 더 화합물은 알 수 없습니다. 우리는 개발 시간 시리즈에 대사와 성적 증명서의 동작을 결합하여 다른 대사에 상황에서 이들 화합물을 넣을 수 있도록 노력하겠습니다. 여기에 제시된 방법 중 어느 것도 상당히 일반적으로 식물 재료에 사용되는 방법을 변경하지 않습니다. 흥미로운 점은 담배 나무 잎에서 주로 긴 사슬의 탄화수소 생산 및 수정을위한 기본 프레임 워크를 이해하는 방법의 조합에있다. 이러한 정보를 얻기위한 중요한 단계 중 하나는 서로 다른 데이터 형식의 후속 조합이다. 우리는 첫 번째 평가와 같은 데이터가 개발 통해 이들 데이터는 대사 물질 행동 대 사본을 추론하는데 사용되며, 또한 잠재적 인 경로로 특정 대사 산물을 할당하는 대사 / 사체의 동작에 따라 서로 다른 클러스터로 분할 될 것으로 구상 . 또한,보다 정교한 네트워크 기반 분석은 다음 t를 구상 아르오 인과 관계를 악용. 여기에 제시된 분석 프로토콜은 또한 현장 시험 및 바이오 매스 산업 개발을위한 기초를 제공 할 것입니다. 이 작업을 수행하기 위해 MultiBioPro 컨소시엄은 능력을 가지고 여러 산업 파트너가 더 바이오 디젤, 바이오 에탄올 등 고 부가가치 화합물을 제공하는 것을 목표로, 바이오 매스를 탐험이 포함되어 있습니다. 바이오 매스 개발의 이러한 유형의 기반으로 평가 될 것이다; (1) 생산 된 바이오 제품의 안정성과 품질을 테스트 (일반 산업 표준 테스트가 생성 된 제품은 좋은 시장 가치를 보장하기 위해 실시됩니다), (2), 기술, 경제, 사회, 환경 평가를 수행 할 것 문학 소스, 인터뷰 및 현장 실험 및 파일럿 플랜트 바이오 리파이너리 평가시 발생되는 재료를 사용하여. 이러한 활동은 비용 혜택 및 라이프 사이클 분석, 환경 서류 및 시장과 사업 동료의 생성을 포함합니다SS 전략. 우리는이 파이프 라인은 학계의 유용한 조화 될 것이라고 믿고, 소비자 최종 제품에 대한 더 포플러와 담배 나무 바이오 매스에 과학 및 산업 개발을 적용했다.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51393/transcript-metabolite-profiling-for-evaluation-tobacco-tree-poplar-as">Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry</a>.
There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from: 
Juan Pedro Navarro
to:
Juan Navarro-Avi&#241;&#243;

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Erratum: Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

인구와 경제 성장은 음식, 물과 연료에 대한 수요 증가가 발생했습니다. 이러한 공급의 대부분은 생산, 가공 및 석유와 같은 유한 한 화석 기반의 수단을 사용하여 전송된다. 그것은 이러한 행위가 지속되지 않고, 다른 자원의 개발이 매우 중요하므로 1 건 것이라고하지만, 분명하다. 대부분의 재생 에너지는 현재 바람, 물, 운동, 태양 광, 지열 등의 악용되고, 다양한 각도로, 그리고 기반의 에너지 소스를 파. 또 다른 지속 가능하고 미개발 자원은 식물에서 바이오 매스이다. 이 자원은 또한 연료 2에 태양 유도 에너지를 변환하는 매우 비용 효율적인 방법을 제공합니다. 외에도 바이오 기반 연료를 제공부터, 식물 바이오 매스는 플라스틱, 세제, 가치있는 화학 물질을 포함하여 다른 제품에 대한 독특한 기회를 제공합니다. 주로 설탕 기반의 폴리머로 구성되어 식물 세포 벽, MAK식물의 바이오 매스의 주요 대부분을 ES 및 많은 노력이 현재 바이오 에탄올로의 효율적인 전환에 투자되고있다. 나머지 바이오 매스 이후 바이오 가스와 석유 관련 제품 3로 처리 될 수 있습니다. 셀룰로오스 계 바이오 매스의 대량 생산 풀과 나무 등의 다년생 식물 종의 대부분은 일반적으로 온대 지역에서 가장 성장. 그러나, 토지 면적의 약 20 %는 반 건조, 또한 그러므로 가뭄 4 경향이있다. 물론, 그것은 또한 효율적으로 에너지와 물질의 지속 가능한 생산에 기여할 수있는 식물이 건조한 땅을 육성하기 위해 관심을 가질 것입니다. 이 식물은 최적의 물 사용의 효율성과 가뭄 저항을하고 담배 나무 (는 담배 glauca)과 용설란 속에서 종을 포함 할 필요가있다. MultiBioPro 컨소시엄이 중요 CR을 이용하여, 통합 바이오 리파이너리 파이프 라인을 구현하는 것을 목표영업 이익 종, 포플러, 담배 나무. 포플러는 빠르게 성장하고있다으로, 유망한 바이오 연료 작물로 부상 쉽게 clonally 전파하고 기후와 토양 조건의 넓은 범위에 높은 적응력했다. 또한, 목재, 섬유, 연료 목재 및 기타 임산물 5의 넓은 범위를 제공합니다. 담배 나무는 바이오 연료 및 바이오 리파이너리 목적에 적합한 식물로 떠오르고있다. 그것은 일반적으로 바이오 매스의 상당한 수량을 생산하고, 비 구조적 탄수화물 6의 높은 금액을 포함하고, 또한 바이오 디젤에 적합합니다 (긴 사슬 C 29-C 31 포화 탄화수소 및 트리 테르 페 노이드 포함) 쉽게 추출 못 먹는 오일의 대량 축적하는 드문 능력을 가지고 생산. 담배 나무는 또한, 유전 개선 의무가 높은 발아 능력을 가지고 있으며, 식품 생산에 사용되지 반 건조 토양에 행복하게 성장입니다. 따라서 포플러와 담배 나무가 모두 multip에 대한 본질적인 가능성이 나타납니다즉, 통합 바이오 기반 산업의 새로운 고 부가가치 원료로 urpose 작물. 본 논문에서 우리는 어떻게 담배 나무 예금 긴 사슬의 탄화수소를 분별하는 방법의 다양한 세트에 초점을 맞 춥니 다. 잎담배의 포화 장쇄 탄화수소의 생산 및 분비를 책임 근본적인 분자기구를 식별하기위한 시도에서, 우리는 기술을 기반으로 현대 &quot;오 믹스&quot;를 적용한다. 이 발달 잎 시리즈 (10 개 단계)의 RNA 서열을 포함하고 다중 대사 산물 프로파일 링은 사용 LC와 GC-MS를 (극성과 비극성 대사와 lipidomics에) 접근한다. 이러한 데이터는 유전자와 상관 식 또는 선행, 위에 나타낸 분자의 생합성의 발병에 채굴하는 데 사용됩니다. 이러한 노력의 투자 유망 유전자와 경로는 모델 종 애기 장대의 기능 테스트를 위해 사용되며, 궁극적으로 TOB에있는 생명 공학 기술에 대한 의무가 될 수있다ACCO 나무.

<table><tbody><tr><td>Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>101986</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>G2938-90034</td><td></td></tr><tr><td>2100 전기영동 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 및 2 ml Safe-Lock 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086, 0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Steel balls</td><td>Geyer Berlin GmbH</td><td>VA2mm</td><td></td></tr><tr><td>믹서 밀 MM 300</td><td>Retsch</td><td>YO-04182-09</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr></tbody></table>

바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

식품, 사료, 에너지와 물에 대한 글로벌 수요가 미래 세대를위한 특별한 도전을 포즈. 그것은 재생 가능한 자원의 탐사를위한 강력한 플랫폼은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요한 것은 분명하다. 다국적 프레임 워크 MultiBioPro 내에서 우리는 식물 바이오 매스의 사용을 최대화하기 위해 바이오 리파이너리 파이프 라인을 개발하고있다. 보다 구체적으로, 우리는 당화, 이소 프레 노이드, 긴 사슬 탄화수소 내용, 섬유 품질 및 suberin 리그닌 내용을 개선하기위한 대상 작물로 포플러와 담배 나무 (는 담배 glauca)를 사용합니다. 이러한 출력을 얻기 위해 사용하는 방법은 GC-MS, LC-MS와 RNA 시퀀싱 플랫폼을 포함한다. 대사 파이프 라인이 잘 이러한 유형의 데이터를 생성하는 도구를 설립, 또한 만이 아니라 특징 대사 산물의 제한을 사용할 수 있습니다됩니다. 깊은 순서는 우리가 모든 담배 나무 잎의 발달 단계 중 현재 성적 증명서,하지만 시간을 포함 할 수된 담배의 순서로 다시 매핑 할로. 이러한 셋업으로, 우리는 기본 프로세스에 대한 기본적인 이해를하고 결과를 악용하는 산업 프레임 워크를 구축을 목표로하고 있습니다. 보다 장기적인 관점에서, 우리는 여기에서 생성 된 데이터를 원료로 포플러와 담배 나무를 사용하여 지속 가능한 바이오 리파이너리 공정 수단을 제공 할 것이라고 생각합니다. 샘플의 대사 산물의 기초 수준을 날짜하려면 분석되었으며, 사용 된 프로토콜은이 문서에서 제공됩니다.

그림 1의 HPLC 프로파일은 N.의 이소 프레 노이드 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다 glauca 잎 추출물. 위의 다른 C40의 이소 프레 노이드와는 포토 다이오드 어레이 (PDA) 검출기를 사용하여 검출 하였다. 피크 공동 크로마토 그래피 정통 표준, 베타 카로틴 (프로 비타민 A), phytoene, 리코펜, 루테인과 제아잔틴 사이의 스펙트럼 비교를 기반으로 주석했다. 도 2에서 두 개의 MS 크로마토 그램에서 N. 차 대사 산물의 분석 결과를 보여준다 glauca 잎과 줄기 소재, 각각. 세린 (화살표로 표시)에 대응하는 피크의 MS 스펙트럼은 또한 예를 들어 설명한다.도 3 Bioanalyzer가 RNA의 품질과 장치의 대표적인 출력을 결정하기 위해 사용 나타낸다. 크로마토 그램의 두 가지 주요 피크는 샘플에있는 그대로 RNA를 나타내는 18 S 25 S의 리보솜 RNA에 해당. 파편이 늑골의 추가 피크osomal RNA는 부분적으로 또는 크게 저하 RNA의 경우에 나타납니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig1.jpg" /> 그림 1. N.에서 잎 추출물에 존재하는 이소 프레 노이드를 보여주는 HPLC 프로필 glauca. 위의 C40과 대부분의 이소 프레 노이드는 GC-MS 분석에 순종하지 않습니다. 따라서 우리는 포토 다이오드 어레이 검출을 HPLC 분리를 사용했습니다. 450 nm에서 기록 전형적인 크로마토 그램이 표시됩니다. 카로티노이드 색소는 루테인 두드러진 광합성 조직의 전형이다. 또한 현재는 높은 빛 스트레스 아래에 배치하지 않는 한 거의 잎 조직에서 발견되는, 제 아크 산틴된다. 제아잔틴의 수준이이 가치가 높은 화합물의 좋은 소스합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51192/51192fig1highres.jpg" target="_blank">큰 V를 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 ersion. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig2.jpg" /> 그림 2. MS 크로마토 그램과 N.의 스펙트럼 glauca 조직 추출물. 총 이온 MS 잎의 크로마토 그램 (TIC) 및 GC-MS에 의해 측정 추출물 줄기는 (70~6백m / Z) 제공됩니다. GC-MS 분석은 (15)에서 전술 한 바와 같이 수행 하였다. 검출 된 피크는 질량 스펙트럼 태그 라이브러리를 사용하여 주석이되었다. 세린 (2TMS)의 MS 스펙트럼을 예로 표시됩니다. MS 크로마토 그램 : X 축 및 Y 축이 보유 시간 (분) 및 신호 강도 (풍부)을 나타내는, MS 스펙트럼 : X 축과 Y 축이 M / Z 비율 및 신호의 강도 (풍부)을 나타내였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51393/51393fig2highres.jpg" target="_blank">더 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이미지. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51393/51393fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51393/51393fig3.jpg" /> 그림 3. N.의 RNA 서열을 준비 RNA의 Bioanalyzer 측정 glauca 잎 재료. 우리는 트리 졸 시약을 사용하여 RNA를 추출하고, 그 후 RNeasy 미니 키트 (Qiagen 사, 힐덴, 독일)에서 열을 사용하여 RNA를 정제 RNA 서열에 필요한 고순도의 RNA를 얻었다. 우리는 Bioanalyzer (애질런트, Waldbronn의, 독일)의 왼쪽에 표시를 사용하여 RNA의 품질을 결정했다. Bioanalyzer 출력의 예는 오른쪽에 기재되어 있습니다. 샘플의 두 가지 주요 피크는 18 S 25 S의 리보솜 RNA를 나타냅니다. 우리의 샘플은 잘 8 필요한 값보다 9.2 RNA 무결성 번호 (RIN)을 보여 주었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51393/51393fig3highres.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하십시오</a>더 큰 이미지를 볼 수 전자.

식물 바이오 매스 연료, 사료, 음식과 다양한 재료를 포함한 여러 제품에 대한 재생 가능한 자원을 제공합니다. 본 논문에서 우리는 담배 나무 (는 담배 glauca)과 바이오 리파이너리 파이프 라인 포플러으로 적합 소스의 속성을 조사합니다.

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

본 절차의 전반적인 목표는 시스템 생물학 기반의 추정을 위해 담배 나무 잎 시료로부터 대사체 및 RNA 시퀀싱 데이터를 구축하고 최적화하는 것입니다. 이는 먼저 발달 단계별 잎 시리즈의 생물학적 시료를 수집함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 후속 분석에 따라 적절한 용매를 사용하여 시료의 추출을 수행하는 것입니다.다음으로, 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GCMS)을 사용하여 대사산물과 탄화수소를 측정하고, RNA 시퀀싱 데이터 획득을 통해 전사체를 분석합니다. 최종적으로, 대사체 프로파일링과 RNA 시퀀싱을 통한 전사체 프로파일링의 결합을 통해 담배나무 잎이 어떻게 장쇄 탄화수소 및 기타 중요한 화합물을 생성하는지 보여줍니다. 이 방법은 담배나무 잎에서 생성되는 중요하고 유용한 대사산물을 식별하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.이 방법은 담배나무의 대사체에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 담배 또는 관련 종과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 담배나무 잎에서 양질의 RNA를 추출하기가 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.본 Bioo PRO 통합 영상에서는 FERNA 그룹의 연구원들이 대사물을 추출하고 분석하는 과정을 살펴보겠습니다. 또한 GCMS를 사용하여 Fraser 그룹의 연구원이 탄화수소를 추출하는 과정과, 본 연구 그룹의 연구원이 RNA 시퀀싱을 위해 RNA를 추출하는 과정을 확인하시게 됩니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로, M2 professional 성장 배지가 담긴 30 cm 직경의 화분에서 *Oceaana glauca* 식물을 재배하십시오. 일차 대사물을 준비하려면 식물의 잎과 줄기를 수확하여 즉시 급속 냉동하십시오. 냉동된 식물 시료를 3일 동안 동결 건조하여 동결 건조시키고, 금속 볼이 들어 있는 믹서 밀(mixer mill)로 동결 건조된 시료를 분쇄하십시오. 이렇게 얻은 미세 분말 상태의 건조 시료를 2 mL 원심분리 튜브나 유리 바이알에 소분하십시오. 다음으로, 분쇄된 건조 식물 시료 중 잎 10 mg 또는 줄기 20 mg을 2 mL 스크류 캡 라운드 바텀 튜브에 소분하십시오.100% methanol 1.4 milliliters를 첨가하고 10초 동안 vortexing합니다. 그 다음, 내부 정량 표준물질로 rib atol 60 microliters를 첨가한 후 다시 vortexing합니다. 스테인리스강 볼 하나를 추가하여 10초 동안 더 vortexing한 뒤, mixer mill을 사용하여 25 hertz에서 2분 동안 시료를 균질화하고, 10분 동안 원심분리합니다.11,000 ×g에서 원심분리한 후, 상층액을 유리 바이알로 옮깁니다. 클로로포름 750 µL와 물 1.5 mL를 첨가한 다음, 혼합물을 10초 동안 볼텍싱합니다. 그 후 상층에서 150 µL를 취해 새로운 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, speed vac을 사용하여 샘플을 건조합니다. 잔류 액체가 남지 않을 때까지 3시간에서 24시간 동안 샘플을 완전히 건조시키는 것이 필수적입니다. 건조가 완료되면, 40 µL의 methin hydrochloride를 첨가합니다.그 다음, 혼합물을 수평 가열 블록 쉐이커에서 37 °C로 2시간 동안 흔들어 줍니다. 70 µL의 M-S-T-F-A 혼합물을 첨가한 후, 다시 37 °C에서 2시간 동안 흔들어 줍니다. GC MS 분석에 적합한 유리 바이알에 액체를 옮기기 전, 짧은 원심분리를 통해 커버에 맺힌 방울들을 아래로 모아줍니다.GC-MS 이후, 질량 분석 데이터 분석을 위한 소프트웨어를 설정하고 처리할 데이터 분석 항목을 선택하여 데이터를 분석합니다. 화합물 종류에 따라 검출된 주요 피크의 표를 작성합니다. 표준 화합물과의 대조를 통해 피크를 식별하고, 이어서 질량 분석, 구조 분석 알고리즘, 문헌 조사 및 탄화수소 추출물 대사체 데이터베이스 검색을 사용하여 검출된 피크를 주석 처리합니다.갓 수확한 ncoa glauco 잎 약 200 milligrams를 용매에 2~20분 동안 담근 후, 잎을 꺼내 회전 증발기를 사용하여 용매를 완전히 건조시킵니다. 그 다음, 샘플을 HPLC 등급의 hexane 1 milliliter에 다시 현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 매개변수를 사용하여 샘플의 GCM s 분석을 수행하십시오.먼저 자동화된 MS.Deconvolution 및 식별 시스템과 NIST 98 MS.Library를 사용하여 크로마토그램 성분을 처리합니다. 머무름 시간과 전형적인 단편화 패턴을 기지의 인증 표준물질과 비교하여 포화 장쇄 알칸 탄화수소의 식별을 확인합니다. 다음으로, 적분된 피크 면적을 용량 반응 곡선과 비교하여 탄화수소를 정량적으로 결정합니다.표준물질을 사용하여 Excel 소프트웨어로 평균과 평균 표준 오차를 계산합니다. 본 프로토콜은 고품질의 RNA를 얻기 위해 TRIOL RNA 추출법과 RN easy 키트를 결합한 방식입니다. 믹서 밀(mixer mill)을 이용하여 2 mL 원심분리 튜브에 넣은 100 mg의 냉동 식물 조직을 금속 볼로 분쇄합니다. 시료 균질화 후, 12,000 ×g, 4 °C 조건에서 10분간 원심분리하고 1 mL의 triol을 첨가합니다.상층액을 새로운 반응 튜브로 옮깁니다. 클로로포름 200 microliters를 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어준 뒤, 실온에서 3분 동안 배양합니다. 혼합물을 15분 동안 원심분리합니다.이전과 마찬가지로, 상층 수용액을 새로운 반응 튜브로 옮깁니다. 약 2.5배 부피의 에탄올을 첨가합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어준 후 -80 °C에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 침전물을 포함한 샘플을 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 컬럼을 8,000 ×g에서 15초 동안 원심 분리하고 통과액을 제거합니다. 추출 키트에 제공된 700 µL의 세척 버퍼 RW1을 스핀 컬럼에 넣고 원심 분리합니다.다시 한번, 통과액을 버린 후 키트에 제공된 두 번째 세척 버퍼인 RPE 500 µL를 스핀 컬럼에 넣습니다. 컬럼을 다시 원심분리하고 통과액을 버린 다음, 다시 버퍼 RPE를 추가하고 원심분리합니다. 이전과 마찬가지로, 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 반응 튜브에 넣고 RNase-free water 50 µL를 추가한 후, 8,000 ×g에서 1분 동안 컬럼을 원심분리하여 RNA를 용출합니다.제조사의 지침에 따라 DNA free kit를 사용하여 잔류 DNA를 제거하십시오. 마지막 단계로 RNA의 품질을 측정합니다. 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing)을 위해 RNA를 보내기 전, RNA integrity number가 8 이상이어야 합니다.HPLC 프로파일은 ncoa glauca 잎 추출물의 이소프레노이드 분석에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. C 40 이상의 다양한 ISOPRENOIDS가 포토다이오드 어레이 검출기를 사용하여 검출되었습니다. 각 피크는 공동 크로마토그래피 및 표준품과의 스펙트럼 비교를 기반으로 주석이 지정되었습니다.두 개의 MS 크로마토그램은 ncoa, glauco 잎과 줄기 시료의 1차 대사산물 분석 결과입니다. 세린(serine)에 해당하는 피크의 MS 스펙트럼 또한 제공되었으며, 예시로서 RNA 품질 결정을 위해 사용된 바이오분석기의 대표적인 출력 결과가 제시되었습니다. 크로마토그램의 두 주요 피크는 18 s 및 25 s 리보솜 RNA에 해당하며, 이는 이 시료 내의 RNA가 손상되지 않은 상태임을 나타냅니다.RNA가 부분적으로 또는 심하게 분해된 경우에는 분절된 리보솜 RNA의 추가 피크가 나타날 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 빠르게 수행할 수 있으며, 본 절차 이후에 다른 대사물질 분석과 병행할 수 있습니다. 소형 RNA의 생성이나 특정 유전자의 발현과 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 실시간 PCR 또는 다른 RNA 분석 방법들을 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 담배나무에서 대사체 데이터를 추출하고 평가하는 방법에 대해 매우 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 내용과 polyphenolic의 리그닌의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

식물 바이오 매스 샘플을 다수의 당화 잠재력을 결정하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 분석을 위해 자동화된 플랫폼은 96 접시와 잘 풀어 설탕의 전처리, 가수 분해 및 부량의 후속 성능 분석을위한 식물 바이오 매스의 준비를 포함한다.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

신진 대사를 통해 유전체학, 공동 발현 유전자 분석 및 대상 화합물의 식별의 조합은 유전자 기능 주석을 제공합니다.

결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

이중 가닥 RNA 간섭 (dsRNAi) 기술은 옥수수 신나 코엔자임에게 낮은 식물 리그닌 함량에 대한 환원 (ZmCCR1) 유전자를 하향 조절하기 위해 사용된다. 세포벽에서 리그닌 다운 규제는 현미경 분석에 의해 시각과 Klason 방법에 의해 정량화된다. 헤미셀룰로오스 및 결정 셀룰로오스의 조성 변화를 분석됩니다.

의 리그닌 아래로 규제<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; dsRNAi 및 Klason 리그닌 분석을 통해

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

효과적으로 담배에서 숙주 세포 단백질 (HCP가)의 90 % 이상을 제거 침전 방법 나타난 세 개의 열은 다른 정제 단계 이전에 추출한다. 공장 HCP가이 비가 역적으로 60 ° C 이상의 온도에서 집계.

본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

이 문서는 즉 떼루아 개념에 대한 통찰력을 얻기 위해 포도 베리 성적 증명서 및 대사에 타겟이 불분명 한 대사 체학, transcriptomics 및 다변량 통계 분석의 응용 프로그램을 설명 베리 품질 특성에 대한 환경의 영향.

포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

여기에서는 비교적 짧은 시간 내에 나무 2차 줄기 조직에서 유전자 및 프로모터 구조의 중간에서 높은 처리량의 기능적 특성화를 용이하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 효율적이고 사용하기 쉬우며 다양한 나무 종에 널리 적용할 수 있습니다.

나무 형성 및 보조 스템 개발에 관여하는 유전자 및 발기인 유학을위한 유도 체세포 업종 분석 (ISSA)의 사용

Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

여기서 우리는 대장균 또는 니코티아나 벤타미아나에서생합성 효소의 합성 발현을 통해 디테르페노이드 대사산물을 생산하고 정화하기 위한 프로토콜을 쉽게 사용하고 크로마토그라피 생성물을 제시합니다. 정화. 생성된 대사산물은 분자 구조 특성화, 효소 기능성 연구 및 생체 활성 검정을 포함한 다양한 연구에 적합합니다.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

액체 크로마토그래피 고분해능 질량 분석법과 결합된 13C 6-Glucose 라벨링의 개발된 방법은 다재다능하며 약용 식물에서 2차 대사 산물의 합성에 관여하는 1차 장기 및 경로에 대한 향후 연구와 이러한 2차 대사 산물의 포괄적인 활용을 위한 토대를 마련합니다.

13명LC-MS와 관련된 C6-포도당 라벨링: 2차 대사산물 합성에서 식물 일차 장기 식별

배우세요 담배 나무 잎에서 대사 산물과 RNA를 추출하고 분석하는 방법을. GC-MS와 RNA 시퀀싱을 활용하여 Nicotiana glauca의 대사 프로파일을 최적화하고 바이오 기반 산업에 활용 가능한 유용한 화합물을 식별합니다.

바이오 기반 산업을위한 원료로 담배 나무와 포플러의 평가에 대한 성적 증명서 및 대사 산물 프로파일

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