Name: 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 학습하세요 공 초점 현미경을 이용해 살아있는 세포에서 소포체와 세포질 pH를 동시 측정하는 방법을. HPTS 및 SNF F1 형광 탐침을 사용하여 정확한 산도 변화를 실시간으로 분석할 수 있습니다.

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원고를 비판적으로 읽어주신 Gilles Dupuis 박사님께 감사드립니다. 
자금 조달
이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research)의 지원을 받았으며 보조금 # MOP-126173을 받았습니다. C.M.D는 FRSQ(Fonds de la Recherche en Santé)의 자금 지원을 받는 Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel의 회원입니다.

셀룰러 산도 교정을위한 해결책 1. 준비 <ol><li> 교정에 사용되는 5 용액을 제조 5 개의 분리 50 ㎖ 원추형 튜브에 이하의 화합물을 추가 <ul><li> 염화나트륨 (1 M NaCl을 1 ㎖) (1 M NaCl을 10 ㎖의 H 2 0 = 0.58 g) </li><li> 의 KCl은 (7,425 1 M의 KCl ㎖) (1 M의 KCl은 10 ㎖의 H 2 0에서 825 g을 =) </li><li> 포도당 (1 M D-글루코스의 1 ㎖) (1M D-글루코스 = 10 밀리리터 H 1.80 g이 0) </li><li> MgS0 4 (0.05 1 M 망초의 ML) (1 M 망초 10 ㎖의 H 2 0 4 = 1.20 g) </li><li> 20 mM의 HEPES (1M HEPES 1 ㎖) (10 ㎖의 H 2 0 1 M HEPES는 = 2.38 g) </li><li> 염화칼슘 (1M 염화칼슘 0.05 ㎖) (10 ㎖의 H 1 M 염화칼슘 = 1.47 G 2 0) 두 번 증류 된 H 2 O (DDH 2 O)의 모든 솔루션을 준비합니다. </li></ul></li><li> DDH 2 O 35 ㎖로 각각의 솔루션을 완료하고 그렇게 할 때까지 자석 교반기로 혼합lution가 달성된다. </li><li> 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5의 pH 값을 얻기 위해 1 N KOH 또는 1 N HCl로 각 용액의 pH를 조정합니다. 이어서, 50 ㎖의 최종 부피의 탈 이온수를 사용하여 볼륨을 조절한다. </li><li> 측정 5 nigericin의 MG 및 원액 nigericin 10 밀리미터를 준비하는 무수 EtOH 670 μL에 추가합니다. 주의 : nigericin이 높은 독성과 큰 관심 (장갑, 보호 안경 및 마스크)로 처리해야합니다. nigericin가 완전히 용해 될 때까지 반전하여 솔루션을 섞는다. </li><li> 각각의 보정 용액에 10 mM의 nigericin (최종 농도 10 μM)의 0.05 ML을 추가합니다. Nigericin은 세포막 투과성을 증가시키고, 세포의 K + 탈분극 농도의 존재 하에서 세포 내 및 세포 외 pH를 평형화 원인 이온 운반체이다. </li><li> 교정 솔루션은 4 ° C에서 1개월까지 저장할 수 있습니다 </li></ol> 2. 휴대 준비 <ol><li> 생물학적 보안 시스템에서35mm의 Y 후드, 씨 세포 X 10mm 배양 접시 10 % 소 태아 혈청과 항생제가 보충 된 성장 배지 2 ㎖에. 24 시간 후에 약 50 % 합류점을 보장하기 위해 필요한 셀의 양을 사용한다. 주 : 우리의 실험에서, 우리는 HT-1080 세포주 및 플레이트 배양 접시 당 1 × 10 5 세포를 사용합니다. </li><li> 교정에 사용되는 실험 및 플레이트 (5 건) 문화 요리에 필요한 배양 접시의 수를 결정합니다. </li><li> 최소 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 넣고 배양 접시. </li></ol> pH를 감지 프로브 3. 준비 <ol><li> DDH 2 0에서 형광의 pH 프로브 8-hydroxypyrene-1, 3,6 trisulfonic 산, 삼 나트륨 염 (HPTS / pyranine)의 1M 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 실온에서 저장 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 는 thereâ라고, (및-6) - 카르 복실 seminaphthorhodafluor 아세 톡시 메틸 에스터 아세테이트 (C-SNARF-1 AM - 1 ~ 5 ㎜의 재고 솔루션을 준비합니다따고 SNARF-1) DMSO 1.76 ㎖에 SNARF-1의 1 MG를 용해하여. 철저 반복 피펫으로 혼합. SNARF-1 솔루션은 -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호되어야한다. </li></ol> 4. 셀 라벨 <ol><li> 열 여섯 시간 라이브 세포 이미징 전에 완전 배지 2 ㎖를 포함하는 각 배양 접시에 1M HPTS 원액의 2 μL (최종 농도 1 ㎜)를 추가합니다. </li><li> 배양기에 배양 접시를 돌려줍니다. HPTS 프로브 따라서 라벨에 프로브는 세포 작용에 의해 흡수되어야한다 소기관, 세포 impermeant입니다. 이 조건은 HPTS와 세포 배양 혈청이 첨가 된 배지에서 수행해야합니다. </li><li> HPTS와 배양 후, 멸균 PBS로 두 번 세포를 세척하고 적어도 2 시간 동안 무 혈청 배지 2 ㎖를 추가합니다. SNARF -1 인큐베이션 혈청은 프로브의 흡수를 방지 할 수 있으므로 무 혈청 배지에서 수행 될 필요가있다. </li><li> AF를 얻기 위해 1 ㎜ SNARF-1 원액의 10 μl를 추가합니다원고 판 5 μM의 농도와 세포가 희미한 빛 아래에서, 37 ° C에서 20 분 동안 배양 할 수 있습니다. C-SNARF-1 농도와 배양 시간은 세포의 종류에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 부화의 끝에서, 멸균 PBS에 두 번 세포를 세척하고 무 혈청 배지 2 ㎖를 추가합니다. </li></ol> 산도 변조기 5. 추가 <ol><li> 이 방법은 세포에 pH 변화를 감지 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 세포 내 산도를 조절하는 다른 시약을 사용할 수 있습니다 : <ul><li> Bafilomycin A1, V-ATPase의 5 특정 억제제 </li><li> NA + / H의 + 교환기 이소 형 1 (NHE-1) ~ (6) </li><li> NH 4 망할 CIA, 세포 내 pH가 7 증가 약한베이스 </li></ul><ol><li> 위에서 언급 한 시약의 주식 솔루션을 준비 : <ul><li> Bafilomycin A1 : 100 μM의 원액을 얻기 위해 DMSO 160 μL에 bafilomycin A1의 10 μg을 추가 </li><li> EIPA :는 obtai 메탄올 1.67 ml로 EIPA의 25 밀리그램을 추가50 mm의 최종 농도 NA </li><li> NH4Cl 등 : 1 mM의 최종 농도를 구하는 DDH 2 O 10ml에 염화 암모늄 0.53 g을 용해. </li></ul> 참고 : 모든 주식 솔루션은 -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호되어야한다 bafilomycin의 A1을 제외하고 4 ° C에 보관해야합니다. </li><li> 별도의 배양 접시에서, 아래에 설명 된대로 시약 중 하나를 추가합니다 : <ul><li> 100 μM의 bafilomycin A1의 2 μL (최종 농도 100 NM) </li><li> 50 mM의 EIPA 1 μL (최종 농도 25 μM) </li><li> 1M NH4Cl 등 (최종 농도 20 ㎜)의 40 μL </li></ul></li><li> 37 ℃에서 30 분 동안 세포를 품어 </li></ol></li><li> 이미지 수집을 진행합니다. </li></ol> 6. 라이브 세포 이미징 현미경의 사양 및 취득 설정 <ol><li> 사용하여 라이브 세포 이미징을 수행 40X 목적은 스펙트럼 반전 스캐닝 공 촛점 microsco에 장착퍼가기 전동 XY 스테이지, 환경 제어 (온도, 습도, CO 2) 단계 인큐베이터에서 유리 바닥 문화 요리를 수용하는 챔버를 탑재. </li><li> 여기에 사용 된 공 초점 악기 (올림푸스 FV1000)가 장착되어 있습니다 : <ul><li> 다이오드 레이저 405 nm의 </li><li> 40 mW의 아르곤 레이저 (458 nm의, 488 nm의, 515 nm의) </li><li> 헬륨 네온 레이저 (543 nm의) </li><li> 형석 10X 목적, NA0.4 </li><li> LUCPLFLN 40X 목적, NA0.60 </li><li> PLAPONSC PLAN APO 60X 오일 목적, NA1.4 </li><li> 다이크로 익 미러 DM 405/458/488/543 </li><li> SDM (560) 및 SDM (640), 다이크로 익 필터 </li><li> BA655-755 차단 필터 </li><li> 빔 스플리터 BS20/80 </li><li> 이미지 수집 및 분석을위한 데이터 분석 소프트웨어, </li></ul></li><li> 무대 인큐베이터가 37 ° C로 예열하고 현미경이 설정되면, 이전에 촛점 무대 영상 실에 HPTS와 SNARF-1 배양 배양 접시를 놓습니다. </li><li>관심 영역을 위치 따고, 소프트웨어 취득 설정도 1을 조정한다. <ul><li> 두 개의 가상 채널 세트를 설정합니다. </li><li> 525 nm의 570에서 543 nm의 방출 수집에 SNARF-1 여기 - - 600 nm의 505에서 405 nm의 방출 수집에 HPTS 여기에 해당하는 첫 번째 단계를 시작합니다. </li><li> 525 nm의 640에서 543 nm의 방출 수집에 SNARF-1 여기 - - 650 nm의 505에서 458 nm의 방출 수집에 HPTS 여기에 해당하는 두 번째 단계를 시작합니다. </li><li> 공 초점 조리개는 기본적으로 175 μm의 설정 및 최적의 조리개를 수동으로 300 μm의에서 설정 될 필요가있다. </li><li> 0.4 μm의 두께의 직렬 수평 광학 절 (800 × 800 픽셀)를 적층하여 이미지를 가져 가라. </li></ul></li></ol> 참고 : 40X 목적은 동시에 여러 개의 세포를 관찰하는 데 유용하고 세포 기관보기에 적합합니다. 그러나, 공간 해상도 및 신호 강도는 베티 아르R은 60X 오일 목적을 사용하여 달성. 또한,이 색소 사이의 여진 또는 발광 크로스 토크는 없다. pH를 감지 프로브의 7. 교정 <ol><li> 교정하기 전에, 이전에 HPTS와 SNARF-1 배양 배양 접시에서 매체를 제거 멸균 PBS로 두 번 세척 한 다음 다섯 교정 솔루션 중 하나 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 공 초점 무대 챔버로 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 다음 설정에 따라 시간 경과 이미지 수집을 진행 : <ol><li> 실험에 대한 이미지와 간격 기간의 횟수를 설정합니다. 참고 : 우리는 일반적으로 최대 30 분 동안 이미지 사이에 1 분 간격을 사용합니다. </li><li> 각 이미지의 취득 사이에 닫습니다 셔터를 프로그램. </li></ol></li><li> 스프레드 시트 소프트웨어에 분당 형광 강도를 기록하고 형광 강도가 상승 할 때의 시간을 결정한다. 20 분 - 세포 내 pH는 15 일 이후 일반적으로 안정적이다. </li><li> REPEAT는 나머지 각 교정 솔루션을위한 새로운 배양 접시를 사용하여 7.4 7.1 단계를 반복합니다. </li></ol> 8. 데이터 수집 <ol><li> 교정이 완료되면, 필드 당 15 ~ 20 세포를 포함하는 4-5 무작위로 선택한 분야에서 샘플 데이터를 수집. 두 이미지는 각 필드에 대해 얻을 수 있습니다 : HPTS 라벨 (소포)와 SNARF-1 라벨 (세포질)에 대한 두 번째 하나. </li><li> 배경 형광 (세포 외 영역)는 디지털 두 프로브의 형광 이미지에서 차감됩니다. 각각의 저장된 이미지에서 레이블이 소포 및 세포질은 바이너리 마스크를 사용하여 선택됩니다. 각각의 pH를 감지 프로브를 들어, 형광 강도는 수치 척도 (0-4,095 회색 수준의 규모)에 측정된다. 소기관 또는 세포질 내의 모든 픽셀의 평균 휘도가 계산되고 형광 값의 비율을 계산하는 데 사용된다. </li></ol> 9. 데이터 분석 <ol><li> 다양한 소프트웨어 패키지는 데이터 분석을위한 상업적으로 이용 가능하다. 즉Fluoview 소프트웨어. </li><li> 다음 스프레드 시트, 레코드 값과 형광 비를 계산 HPTS의 경우, R = (F 458 ㎚ / F 405 NM)와, SNARF-1, R = (F 644 ㎚ / F 584 ㎚의 경우 ). </li><li> 같은 그래프 패드 프리즘 과학적 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 그린다. 플롯은 산도 (X 축)의 함수로서 형광 비율 (Y 축) 묘사한다. 커브 피팅 비선형 회귀 분석을 사용하여 달성된다. </li><li> 단계 20.7에 기재된 바와 같이 샘플의 형광 농도 모아서 형광 비율을 계산한다. pH 값으로 비율을 변환하는 보정 곡선을 사용합니다. </li></ol>

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<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

다른 세포 구획의 라이브 세포 이미징 양적 pH 측정은 정확하게 외부의 도전에 대한 세포 반응에서의 pH의 변화를 측정하기 위해 필요합니다. 그러나 남아있는 주요 장애물 중 하나는 쉽게 구체적으로 세포 구획을 대상으로하는 것입니다. 이 점에서, 몇 가지 연구는 일렉트로 또는 마이크로 인젝션 8-10 의해 세포 내로 도입 세포 내 pH를 지표로 HPTS의 사용을 강조했다. 이 기술은 즉 일렉트로 세포에 광범위한 피해를 발생시키고 미세 주입은 특수 장비 및 기술 능력을 필요로 심각한 결점으로 고통. 그 중에서, 힌튼 외. 이전 HPTS가 세포 작용의 과정에 의해 세포에 의해 다루어 SNARF-1 및 HPTS의 조합 / 리소좀 구획 3 세포질과 엔도 솜의 pH를 모니터링하는데 사용될 수 있다는 될 수 있다고보고했다 . 우리는 리소좀 / 엔도 좀 compartm에서의 pH 변화를 기록하기 위해이 속성을 사용했습니다라이브 HT-1080 세포의 이비인후과. HPTS이 구획에 위치했다...

<table><tbody><tr><td>교정</td><td></td><td></td><td></td>용 용액</tr><tr><td>: 염화나트륨</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr>, <tr><td>염화칼륨</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr>, <tr><td>D-포도당(덱스트로오스)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr>, <tr><td>황산마그네슘</td>, <td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>흡입 또는 피부 접촉에 의해 독성</td></tr><tr><td colspan="4">4°C에서 빛으로부터 보호하십시오. C</td></tr><tr><td>배양 접시 & 35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>pH 감지 프로브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>실온에서 빛을 멀리하십시오</td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF&reg;-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>-20 &deg에서 빛과 습도로부터 멀리 유지하십시오. C</td></tr><tr><td>디메틸 수폭사이드(DMSO)</td><td>피셔</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>해로운</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20g</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td>성 <td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115g</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td>성 <td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20g</td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>1L</td></tr><tr><td>오토클레이브를 만들고 pH를 7.4</td><td>로 조정합니다.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50ml</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40.5g</td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>N/A</td><td></td><td>5L</td></tr><tr><td>pH 조절제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드(EIPA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄 피</td><td>셔</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 ph 측정

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

세포 내 pH는 엄격하게 조절되며 세포질과 세포 기관 간의 pH 차이가 보고되었습니다1. 세포 pH의 조절은 단백질, DNA 및 RNA 합성, 소포 이동, 세포 성장 및 세포 분열을 포함하는 생리학적 과정의 항상성 제어에 중요합니다. 세포의 pH 항상성의 변화는 해로운 기능적 변화를 일으키고 다양한 질병의 진행을 촉진할 수 있다2. 세포 내 pH를 측정하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있지만 세포질과 세포 기관에서 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포에 대한 컨포칼 현미경을 사용하여 세포질과 소기관 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법에 대해 자세히 설명합니다3. 이 목표는 선택적 세포 구획 분할을 갖는 두 가지 pH 감지 비율계량 염료를 사용하여 달성됩니다. 예를 들어, SNARF-1은 세포질 내부에 구획화되어 있는 반면 HPTS는 엔도솜/리소좀 소기관 내부에 구획화되어 있습니다. HPTS는 일반적으로 세포질 pH 지시약으로 사용되지만, 이 염료는 pinocytosis3,4에 의해 흡수된 후 엔도솜-리소좀 경로를 따라 소포를 특이적으로 표지할 수 있습니다. 이러한 pH 감지 프로브를 사용하면 내포성 및 세포질 구획 내에서 pH를 동시에 측정할 수 있습니다. HPTS의 최적 여기 파장은 pH에 따라 달라지며 SNARF-1의 경우 최적 방출 파장이 달라집니다. SNARF-1 및 HPTS를 사용한 로딩 후, 세포는 서로 다른 pH 보정 용액에서 배양되어 각 프로브에 대한 pH 표준 곡선을 구성합니다. 컨포칼 현미경 검사에 의한 세포 이미징을 통해 아티팩트와 배경 소음을 제거할 수 있습니다. HPTS의 스펙트럼 특성으로 인해 이 프로브는 약산성 엔도솜 구획을 측정하거나 엔도솜/리소좀 소기관의 알칼리화를 입증하는 데 더 적합합니다. 이 방법은 데이터 분석을 단순화하고 pH 측정의 정확도를 개선하며 외부 문제에 대한 세포 반응 중 pH 조절과 관련된 근본적인 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.

세포 내 엔도 좀 / 리소좀 세포 구획 모두에서의 pH의 동시 측정을 위해, 비율 계량 형광 pH를 감지 SNARF-1 프로브 및 HPTS를 사용 하였다. HPTS가 엔도 솜 / 리소좀 구획의 비율 계량 산도를 측정 할 수있는 반면 SNARF-1은 세포 내 구획으로 제한됩니다. 16 시간 동안 HPTS있는 셀로드는 엔도 좀 / 리소좀 4의 선택적 지역화 할 수 있습니다. pH를 감지 프로브와 함께로드 HT-1080 세포에서 기록 된 형광의 전형적인 예는 그림 2A에 표시됩니다. HPTS는 엔도 좀과 리소좀 두 구획 레이블 증거는 알렉사 546 - 복합 트랜스페린 (엔도 솜) 또는 형광 lysotrophic 프로브 (Lysotracker 깊은 Reddye)와 공동 염색을 얻었다. 데이터는 명확하게 HPTS 두 구획 그림 2A 스테인드 것으로 나타났다. 상술 된 방법을 사용하여 살아있는 세포에서의 세...

세포 내 pH를 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만 이 중 세포질 및 소기관 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 비율계량 이미징을 통해 세포질과 소포 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

다음 실험의 전반적인 목표는 공초점 현미경을 이용하여 살아있는 세포 내 소낭 및 세포질의 pH를 동시에 측정하는 것입니다. 이는 먼저 엔도좀 및 리소좀 구획과 세포질을 각각 표지하는 pH 감지 프로브인 HPTS와 SNF F1로 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 그다음, 세포를 공초점 현미경 하의 환경 제어 챔버에 배치하고, 소프트웨어를 설정하여 챔버 내 프로브의 형광을 측정합니다.세포를 서로 다른 pH로 보정된 용액과 함께 배양합니다. 비선형 회귀 분석을 사용하여 pH 표준 곡선을 작성합니다. 두 프로브 모두에 대해 지수 방정식이 결정되며, 이후 샘플의 형광 강도를 pH 값으로 변환하는 데 사용됩니다.이 방법은 다양한 처리 후 샘플의 소낭 및 세포질 pH를 결정할 수 있게 하며, 생물학적 과정 중 세포 내 pH 조절에 관한 연구를 가능하게 합니다. 기존의 세포 내 pH 측정 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이미징 과정 중 아티팩트와 배경 노이즈를 제거하면서 살아있는 세포 내의 pH 역동성을 측정할 수 있다는 점입니다. 본 절차의 시연은 이 방법을 개발한 박사 과정 학생인 fess lucier가 진행할 것입니다. 세포 pH 보정을 위해 pH 5.5에서 7.5까지 0.5 간격으로 총 5가지의 50 milliliter 용액 시리즈를 제조해야 합니다.pH 값을 맞추기 위해 수산화칼륨 또는 염산을 한 방울씩 첨가합니다. 그런 다음 각 pH 교정 용액에 0.05 mL의 IOR gersin을 첨가합니다. 최종 농도가 10 µM이 되도록 10 mM로 희석한 risin은 탈분극 농도의 세포 외 칼륨 존재 하에 세포막 투과성을 증가시킵니다. 후드 내에서 10% fetal bovine serum과 항생제가 포함된 배지 2 mL를 사용하여 35 mm 배양 접시에 세포를 분주하며, 37 °C에서 24시간 배양 후 50% confluence를 달성하는 것을 목표로 합니다.실험에 필요한 모든 플레이트에 세포를 분주한 후, 보정을 위해 5개의 플레이트를 추가로 분주합니다. 이 플레이트들을 24시간 동안, 그 후 다시 24시간 동안, 그리고 이미징 전 16시간 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 약 3시간 전에 1 M 농도의 오가넬 라벨 HPTS 2 µL를 첨가하여 용액 내 최종 농도가 1 mM HPTS가 되도록 합니다.이미징 전, PBS로 2회 세척하여 HPTS를 제거합니다. 그 후 무혈청 배지 2 mL를 첨가하고 세포를 최소 2시간 더 배양합니다.이미징 직전에 1 mM SNF 10 µL를 첨가하여 5 µM SNF로 세포를 배양하고, 이어서 SNF 1차 배양 과정을 수행합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 2 mL의 무혈청 배지를 첨가한 후, 이미징을 진행합니다. 세포를.세포 이미징은 전동 스테이지와 환경 챔버가 장착된 스펙트럼 역전 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 플라스틱 페트리 접시를 사용하는 경우 40x 대object lens가 가장 적합합니다. 소프트웨어에서는 두 개의 가상 채널 세트를 설정하고, 여기 파장과 방출 파장을 조정해야 합니다.HPTS 및 SNF one의 경우, 공초점 조리개(confocal aperture)는 기본적으로 175 microns로 설정되어 있으며, 최적의 조리개 값인 300 microns로 수동 설정해야 합니다. 챔버가 37 °C로 가열되면 캘리브레이션을 시작하고, 세포 플레이트를 PBS로 두 번 더 세척한 다음 배지를 첫 번째 캘리브레이션 용액으로 교체합니다. 이제 세포를 챔버에 넣고 두 가지 pH 민감성 염료를 캘리브레이션하며, 1분 간격으로 최대 30장의 타임랩스 이미지를 획득합니다.각 이미지 스택은 0.4 microns 두께와 800 square pixels로 수집할 수 있습니다. 이미지 촬영 사이에는 셔터가 닫힌 상태로 유지되도록 설정해야 합니다. 통상적으로 20분 정도 지나면 안정화되는 형광 강도를 매분 기록하십시오.형광이 안정되면, 15~20개의 세포와 두 종류의 프로브가 모두 포함된 4~5개 구역의 이미지를 촬영합니다. 이 이미지들은 곡선 계산에 사용됩니다. 각 보정 용액에 대해 이 과정을 반복하십시오.그 다음, 세척이 필요 없는 실험 조건 플레이트의 이미징을 진행합니다. 각 이미지를 분석할 때, 먼저 배경 외세포 형광을 디지털 방식으로 감산합니다. 그런 다음, 이진 마스크를 사용하여 저장된 이미지에서 표지된 소낭과 세포질을 선택합니다. 각 pH 감지 프로브의 형광 강도는 0에서 4,095까지의 척도로 측정됩니다.소기관 또는 세포질 내 모든 픽셀의 평균 강도를 계산합니다. 이 값들을 사용하여 HPTS와 snf의 형광 비율을 계산하십시오. 보정 곡선을 작성하기 위해, 각 보정 용액에서 얻은 형광 비율을 pH의 함수로 도식화하며, 보정 곡선 피팅은 지수 방정식을 사용하여 수행해야 합니다.마지막으로, 검정 곡선을 사용하여 비율을 pH 값으로 변환함으로써 실험 조건 하의 살아있는 세포 내 세포질 및 소기관 pH 값을 얻습니다. Alexa 546이 접합된 트랜스페린을 사용하여 엔도솜을 염색하거나 형광 리소좀 추적기인 Lyso Tracker로 공동 염색함으로써, HPTS가 엔도솜과 리소좀 구획 모두를 라벨링한다는 명확한 증거를 얻었습니다.HT 10 80 cells에서 설명한 대로 각 프로브에 대해 딥 레드 타임랩스 이미지를 수집하였습니다. 5가지 보정 용액을 테스트하여 pH 6 및 pH 7.5 용액과 같은 용액 내에서 15분 후 형광 접근 안정성을 확인하였습니다. 주어진 pH에 대한 보정 곡선에서 데이터는 HPTS의 경우 558 nm 대비 405 nm의 형광 강도 비율을, SNF 1의 경우 644 nm 대비 584 nm의 형광 강도 비율을 나타냅니다. 두 곡선 모두 지수 방정식으로 피팅되었습니다.세포 내 pH를 증가시키는 약염기인 염화암모늄을 사용하여 생체 HT 10 80 내 방법의 효율성을 평가했습니다. 이 염기는 세포질과 소포의 pH를 모두 증가시켰습니다. 또한 v-ATPase 억제제인 B mycin, A one을 사용하여 해당 방법을 평가했습니다. B mycin, A one은 엔도솜과 리소좀 구획 모두의 알칼리화를 유도했으나, 세포질 pH는 변화시키지 않았습니다.마지막으로, NHE1 억제제인 EIPA를 테스트했습니다. 이는 세포질을 pH 6.62까지 산성화시켰으나, 지금까지 pH에는 영향을 미치지 않았습니다.세포 내 pH 항상성 연구는 세포 내부에서 일어나는 급격한 pH 변화와 세포 내 pH를 연구하기 위한 도구의 부족으로 인해 그동안 제한적이었습니다. 본 영상에서는 단일 살아있는 세포 내에서 세포질과 엔도솜의 pH를 동시에 측정할 수 있는 간단한 단계별 접근 방식을 설명합니다. 이는 돌연변이나 약물이 엔도솜 구획 내 양성자의 유입 및 유출에 영향을 줄 수 있는 세포의 세포 내 pH 항상성 연구에 특히 중요합니다.

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐의 대뇌 동맥 분절의 내피 세포에서 세포 내 칼슘 수치와 막 전위의 변화를 동시에 측정하는 것을 보여줍니다. 분리된 내피관에는 형광 칼슘 지시약이 적재되어 세포 내 칼슘 방출을 유도하는 약물로 처리되어 막 전위의 변화를 일으킵니다. 지표의 형광을 통해 칼슘 수치를 측정할 수 있으며, 기록 전극을 세포에 삽입하여 막 전위의 변화를 측정합니다.

Simultaneous Measurement of Intracellular calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium(쥐 대뇌 내피에서 세포 내 칼슘 및 막 전위)

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagosomal pH는 식좀 성숙, 산화제 생성, 식체 사멸 및 항원 제시에 영향을 미칩니다. 여기에서는 형광 현미경을 사용하여 살아있는 식세포에서 개별 식체의 시간 경과 및 종말점 pH 변화를 측정하기 위한 비율계량 방법을 설명합니다.

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

이 논문은 phagosomal의 pH 및 영역뿐만 아니라 비율 적 지표 seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, 또는 S-1을 사용하여 인간 및 마우스 호중구의 세포 내 pH를 측정하는 간단한 방법을 설명한다. 이 라이브 셀 공 초점 형광 현미경 및 이미지 분석을 사용하여 얻을 수있다.

호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

이 프로토콜은 개별 인간 말초 혈액 단핵 세포의 사이토카인 분비 역학을 정량적으로 측정하기 위한 고급 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 예를 들어 지질다당류로 자극된 각 개별 세포에 대해 최대 3개의 사이토카인(IL-6, TNFα 및 IL-1β)을 병렬로 측정합니다.

개별 다기능성 세포의 동시 및 순차적 사이토카인 분비를 해결하기 위한 미세유체 접근법 

학습하세요 공 초점 현미경을 이용해 살아있는 세포에서 소포체와 세포질 pH를 동시 측정하는 방법을. HPTS 및 SNF F1 형광 탐침을 사용하여 정확한 산도 변화를 실시간으로 분석할 수 있습니다.

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

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