공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

세포 내 pH를 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만 이 중 세포질 및 소기관 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 비율계량 이미징을 통해 세포질과 소포 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 컨포칼 현미경으로 살아있는 세포의 소포 및 세포질 pH를 동시에 측정하는 것입니다. 이는 먼저 pH 감지 프로브인 HPTS 및 SNF F1을 사용하여 세포를 배양하여 달성하며, 이 프로브는 각각 엔도솜 및 리소좀 구획과 세포질을 라벨링합니다. 다음으로, 세포를 컨포칼 현미경 하에서 환경적으로 제어되는 챔버에 배치하고 소프트웨어는 챔버 내 프로브의 형광을 측정하도록 설정됩니다.

세포는 서로 다른 pH 보정 용액으로 배양됩니다. pH 표준 곡선은 비선형 회귀를 사용하여 구성됩니다. 지수 방정식은 두 프로브 모두에 대해 결정되며 이후에 샘플의 형광 강도를 pH 값으로 변환하는 데 사용됩니다.

이 방법을 사용하면 다양한 처리 후 샘플에서 소포 및 세포질 pH를 측정할 수 있으며 생물학적 공정 중 세포 내 pH 조절을 연구할 수 있습니다. 세포 내 pH 측정을 위한 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 방법을 통해 아티팩트 및 배경 소음을 제거하면서 살아있는 세포의 세포 내 pH 역학을 측정할 수 있다는 것입니다. 이미징 중에 이 방법을 시연하는 것은 세포 pH 보정을 위해 이 방법을 개발한 박사 과정 학생인 fess lucier가 될 것입니다. pH 5.5에서 7.5까지 0.5 단위로 5 개의 50 밀리리터 용액을 0.5 단위로 생성해야합니다.

일반 수산화칼륨 또는 염산을 적가하여 pH 값을 설정합니다. 그런 다음 각 pH 보정 용액에 0.05ml의 IOR gersin을 추가합니다. 10 밀리 몰에서 10 마이크로 몰의 최종 농도를 위해 리신은 섭씨 37도에서 24 시간의 배양에서 50 % 합류를 달성하는 것을 목표로 10 % 소 태아 혈청과 항생제를 함유 한 2 밀리리터의 배지로 35mm 배양 접시에 세포 외 칼륨의 탈분극 농도가 존재할 때 세포막 투과성을 증가시킵니다.

실험에 필요한 모든 플레이트를 시딩한 후 보정을 위해 추가로 5개의 플레이트를 시딩합니다. 이 플레이트를 이미징 24시간, 24시간 후, 이미징 16시간 전에 배양합니다. 다음 날 아침, 약 3시간 동안 용액 내 1밀리몰 HPTS의 최종 농도를 위해 1몰에 2마이크로리터의 소기관 라벨 HPTS를 추가합니다.

이미징 전에. PBS로 두 번 세척하여 HPTS를 제거합니다. 그런 다음 2ml의 무혈청 배지를 추가하고 세포가 최소 2시간 동안 더 배양하도록 합니다.

이미징 직전에 5마이크로몰 snf로 세포를 배양하고, 하나는 10마이크로리터의 1밀리몰 snf를 추가하고, 다른 하나는 SNF 1배양 기간 후에 배양합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 2ml의 무혈청 배지를 첨가한 다음 이미징을 진행합니다. 세포.

세포의 이미징은 전동 스테이지와 환경 챔버가 장착된 스펙트럼 도립 주사 컨포칼 현미경으로 수행되어야 합니다. 플라스틱 페트리 접시를 사용할 때는 40 x 대물렌즈가 가장 적합합니다. 소프트웨어는 소프트웨어에서 두 개의 가상 채널 세트에 대해 조정해야 하며 여기 파장과 방출 파장을 조정해야 합니다.

HPTS 및 SNF one의 경우 컨포칼 조리개는 기본적으로 175미크론으로 설정되며 최적 조리개는 300미크론으로 수동으로 설정해야 합니다. 챔버가 섭씨 37도까지 가열되면 보정을 시작하고 PBS를 사용하여 셀 플레이트를 두 번 더 세척한 다음 배지를 첫 번째 보정 용액으로 교체합니다. 이제 세포를 챔버에 넣고 두 pH 민감성 염료를 모두 보정하여 1분 간격으로 최대 30개의 타임랩스 이미지를 획득합니다.

각 이미지 스택은 0.4미크론 두께와 800제곱 픽셀로 수집할 수 있습니다. 그리고 이미지 사이에는 셔터가 닫힌 상태로 유지되도록 프로그래밍해야 합니다. 1분마다 형광등 강도를 확인하면 일반적으로 약 20분 동안 안정화됩니다.

형광등이 안정화되면 15-20개의 세포와 두 프로브를 포함하는 4개 또는 5개의 필드에서 이미지를 가져옵니다. 이러한 이미지는 곡선 계산에 사용됩니다. 각 보정 용액에 대해 이 과정을 반복합니다.

그런 다음 세척이 필요하지 않은 실험 상태 플레이트의 이미징을 진행하여 각 이미지를 분석할 때 먼저 배경 세포 외 형광을 디지털 방식으로 제거합니다. 그런 다음 binary mask를 사용하여 저장된 영상에서 labeled vesicles 및 cytosol을 선택합니다. 각 pH 감지 프로브에 대해 형광 강도는 0에서 4, 095까지의 척도로 측정됩니다.

소기관 또는 세포질의 모든 픽셀에 대한 평균 강도를 계산합니다. 이 값을 사용하여 HPTS 및 snf에 대한 형광 비율을 계산합니다. 검량선(calibration curve)을 위한 하나는 pH 검량선 피팅(Fitting)의 함수로서 각 검량용액에 대해 얻은 형광비를 표시하는 것으로, 지수 방정식을 사용하여 수행해야 합니다.

마지막으로, 검량선을 사용하여 비율을 pH 값으로 변환하여 실험 조건에서 살아있는 세포의 세포질 및 소기관 pH 값을 얻습니다. HPTS가 엔도솜을 염색하기 위해 Alexa 5 46 conjugated transferrin으로 cos 염색하거나 형광 ly 위축성 프로브를 사용하여 엔도솜 및 리소좀 구획을 모두 라벨링한다는 명확한 증거를 얻었습니다. 리오 트래커.

HT 10 80 셀에 설명된 대로 각 프로브에 대해 짙은 빨간색 타임 랩스 이미지를 수집했습니다. 주어진 pH에 대한 검량 곡선에서 pH 6 및 pH 7.5 용액과 같은 용액에서 15 분 후 5 개의 교정 용액을 형광 접근법 안정성으로 테스트했으며, 데이터는 HPTS의 경우 558 - 405 나노 미터 또는 SNF 1의 경우 644 - 584 나노 미터에서 형광 강도의 비율을 나타냅니다. 두 곡선 모두 지수 방정식이 적용되었습니다.

살아있는 HT 10 80에서 방법의 효율성은 세포 내 pH를 증가시키는 약한 염기인 염화암모늄을 사용하여 평가되었습니다. 염기는 세포질과 소포 모두의 pH를 증가시켰습니다. 이 방법은 또한 B 마이신, A 하나, va a TPAs bamy의 억제제, A 하나는 엔도솜 및 리소좀 구획 모두의 알칼리화를 유도했지만 세포질 pH는 변경하지 않았습니다.

마지막으로, NHE 1의 억제제인 EIPA를 시험하였다. 그것은 세포질을 pH 6.62까지 산성화시켰지만 pH에는 영향을 미치지 않았습니다. 지금까지.

세포 pH 항상성에 대한 연구는 세포 내에서 발생하는 급격한 pH 변화와 세포 내 pH를 연구할 수 있는 도구의 부족으로 인해 제한되어 왔습니다. 오늘은 살아 있는 단일 세포에서 세포질 pH와 엔도솜 pH를 동시에 측정하는 간단한 단계별 접근법에 대해 설명합니다. 이는 돌연변이 또는 약물이 엔도솜 구획 내 양성자의 유입 및 유입에 영향을 미칠 수 있는 세포의 세포 pH 항상성 연구에 특히 중요합니다.