Name: Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 배우세요 쥐 망막 신경절세포의 선택적 칼슘 이미징 및 면역조직화학 기법을 통한 신경과학 연구 방법. 이 기술은 세포 내 칼슘 역학과 전압 의존성 칼슘 채널 기여도를 정량적으로 분석할 수 있습니다.

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우리는 칼슘 이미징 프로토콜에 기여 박사 S. 스텔라와 헬렌 브엉 감사합니다. 우리는 인터뷰 장면을 촬영 박사 K. 시트 감사합니다. 우리는 원고에 그녀의 의견을 박사 아린 히라노 감사합니다. 이 연구 개발 프로젝트는 원격 진료 및 고급 기술 UCLA에서 의학의 데이비드 게펜 학교에서 저자에 의해 실시 된 미국 육군 의학 연구 및 물자 명령 (USAMRMC)에 의해 수여 및 투여 한 계약의 계약에 의해 가능하게되고, 계약 번호에서 MD 요새 Detrick에서 연구 센터 (TATRC) : W81XWH-10-2-0077. 이러한 연구에 대한 지원은 NIH의 EY04067 및 VA 훈장 검토 (NB)에서왔다. NCB는 VA 경력 연구원이다.

모든 실험은 인간의 실험실 동물의 관리 및 사용 및 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학 (UCLA) 동물 연구위원회에 미국 공중 보건 서비스 정책에 의해 발행 된 실험 동물의 복지에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 남성과 여성 성인 흰쥐 3-5주 세 사이 (찰스 리버 연구소, 윌 밍턴, MA)를 사용 하였다. Wholemount 망막 및 면역 프로토콜에 대한 1 동물 및 조직 준비 <ol><li> 해부 현미경, 아주 좋은 팁, ​​가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드와 두 집게 다음 재료 및 도구를 준비합니다. </li><li> 깊이 단두대로 잘린 다음 1-3% 이소 플루 란 (isoflurane)와 동물을 마취에 의해 밀폐 된 챔버에 쥐를 안락사. 세포 외 용액을 포함하는 페트리 접시에 홍채 가위와 장소 한 쌍의 눈을 제거합니다. A, 에임스 나 최대 절전 모드dium 또는 생리 학적 솔루션을 권장합니다. </li><li> [선택 단계 FLUO-4와 망막 신경절 세포의 채움이 필요한 경우]. 단계 2.3-2.4에 설명 된대로 FLUO-4 라벨을 수행합니다. </li><li> 해부 현미경 (광량 : 1.6 x 10 8 포톤 / mm 2 ⋅sec)를 사용하여, 안구의 전면을 차단하여 각막을 제거한다. 집게 안쪽 망막 표면에서 렌즈와 유리체를 제거합니다. 유리체를 제거하려면 한 forcep으로 꽉 공막을 잡고 안구를 안정. 조심스럽게 다른 forcep와 망막의 중앙으로 유리체 기반을 벗겨. 이 단계에서 준비 저온부에 사용되는 아이 컵, 불린다. 저온부에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 (14, 15)에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 아이 컵에서 망막을 제거합니다. 그런 다음, 네 상처는 망막 눕혀 할 수 있도록 할 수 있습니다. 조심스럽게 광 수용체 층 위로 현미경 슬라이드에 망막을 탑재합니다. 망막에 용액을 한 방울을 추가하고 CE 마크를 넣어망막에 llulose 필터 종이. 망막 여과지에 부착되면, 다시 용액 망막 배치. 필요한 경우, 브러시 또는 집게로 망막을 평평. </li><li> 고정 10 ~ 15 분 동안 4 % PFA에 wholemounted 망막을 놓습니다. </li><li> 0.1 M 인산염 완충액 (PB), pH가 7.4에서 30 분 동안 wholemounted 망막을 세 번 씻으십시오. 밤새 4 ° C에서 0.3 % 트리톤 X-100, 0.1 % NaN의 3을 포함하는 0.1 PB 5 % 정상 염소 혈청 또는 당나귀 혈청 망막을 차단합니다. 우리는 차단 솔루션과 항체를 저장하기위한 모든 단계 500 μL의 최종 볼륨을 권장합니다. </li><li> 다음 날, 4 ° C에서 차 항체 5-7일와 망막의 wholemounts을 배양한다. 최적의 희석은 사용자에 의해 결정되어야한다. </li><li> PB 0.1 M에서 망막 3 × 30 분 씻고 차 항체 (농도 1 : 1000)의 종류에 대하여 지시 된 해당 형광 접합 된 이차 항체에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다. </li><li> PB 30 분 각각의 세 최종 세척 후, 중간 장착의 망막을 탑재합니다. 장기간 보관을위한 매니큐어와 커버 슬립을 봉쇄. 저장 샘플 4 ° C에서와 빛으로부터 보호합니다. </li></ol> 칼슘 표시기 염료와 쥐 Wholemount 망막의 신경절 세포와 축삭의 2 라벨링 <ol><li> 95 %, O2 / 5 % CO 버블 포유 동물 링거 포함 125 염화나트륨, 3의 KCl, 2 염화칼슘, 1.25의 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2를, 25 탄산 수소 나트륨 (mm 단위)의 1,000 ml의 10 포도당을 준비 &#173; 2. </li><li> 단계 1.2-1.4에 설명 된대로 절개를 수행합니다. </li><li> 주사기를 사용하여 안구에 약 1mm 후방 시신경 그루터기에 FLUO-4 pentapotassium 염 (H 2 O에서 40 밀리미터 주)의 0.5 μl를, 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)와 축색 돌기를로드 삽입하려면 . [CA에 신경절 세포의 동적 인 상승을 측정하기 2+ </SUP&gt;] 나는 그런 FLUO-4 345 nm의의의 K의 D와 높은 친 화성을 ​​가진 지표는 최적입니다. FLUO-4에 결합 할 때 칼슘&gt; 100 배의 방출 증가의 결과로 매우 높은 양자 효율을 갖는 추가적인 이점을 제공한다. </li><li> 포유 동물 링어의 95 % O 버블 2 / 5 % CO에 아이 컵을 놓고 &#173; 이 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안. </li></ol> 망막 신경절 세포와 축삭을위한 3 칼슘 이미징 프로토콜. <ol><li> 단계 1.1 ~ 1.4에 설명 된대로 눈, 렌즈와 유리체를 제거합니다. 아이 컵에서 망막을 분리하고 사분면으로 나눕니다. 마운트 사분면의 신경절 세포의 유리 슬라이드에면을 위로하고 안정 하프 슬라이스 그리드를 사용합니다. 어두운 적응 다른 조각을 유지 포유 동물 링어의 95 % O 버블 2 / 5 % CO에 &#173; 나중에 사용하기 위해 얼음에 2. </li><li> 포유류 링거액으로 기록 챔버와 Superfuse95 %, O2 / 5 % CO 2와 함께 지속적으로 버블 링 솔루션을 유지한다. </li><li> 이미지 현미경 조직. 실온 (~ 23 ° C에서) 또는 행동 실험, 무대를 따뜻하게 시편에서 물 목욕을 가열 또는 시료의 표면에 따뜻한 공기를 적용하여 생리 온도를 얻을 수 있습니다. 주 : 많은 세포 기능은 세포 내 항상성 (16)를 유지에 중요한 역할을 온도에 의해 조절된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 그러나 온난화 대책의 도입은, 열팽창 17 의한 중간 포커스 드리프트의 증발을 photobleaching에의 속도를 증가시킬 수있다. 실내 온도의 사용은 FLUO-4 (18)의 세포 내 구획화을 감소시킨다. </li><li> 약물의 부재에 두 쌍의 높은 K + 펄스들의 제어를 수행한다. 활성화하기 위해 각 펄스 동안 33 초 60는 3mm O를 [K +]를 높여 망막 신경절 세포와 축삭 RGC을 탈분극여덟 채널 중력 구동 superfusion 시스템 VGCCs. 높은 K + 용액 isosmolarity을 유지하기 위해 57 mm 정도 나 +를 줄입니다. </li><li> 일반 또는 특정 칼슘 채널 차단제의 사용과 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여를 평가한다. 예를 들어, 비 특정 칼슘 채널 차단제, 코발트 투여 칼슘 신호의 감소는, 높은 K + -evoked 칼슘 신호 VGCCs의 기여의 반 정량적 측정 값을 제공 하였다. </li><li> (도 2) 관심 망막 신경절 세포 주변의 관심 (ROI)의 영역을 배치하여 형광 강도 값을 획득. </li><li> 제 높은 K + 피크에 의해 생성 된 변화에 제 높은 K + 피크에 의해 생성 된 형광 강도의 변화를 정규화한다. 이어서, 특정 칼슘 채널 차단제의 테스트를 위해, 단지 한 쌍의 제 높은 K + 펄스 동안 약물을 적용하고이 피크에 대해 정상화제 1 피크 값. 이 높은 K + 피크에 약물의 영향을 측정하기 위해 제의 의하여 제 K + 피크의 진폭을 나눈다. 분석은 약물의 부재하에 측정 한 쌍의 높은 K + 피크로부터 유도 그들의 정합 제어에 대하여 이러한 값을 수행하여야한다. </li><li> 5 초 간격으로 이미지를 획득. 광 탈색을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 구동을 유지한다. 광전자 증 배관은 505 나노 LP 필터로 형광 방출을 수집하면서, 아르곤 레이저의 488 nm의 라인으로 음원을 제공한다. </li></ol>

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<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
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1) 면역 조직 화학 망막 wholemounts의 신경절 세포에 FLUO-4 현지화를 보여, 2) 칼슘 이미징 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 분석하기 위해이 문서에서 우리는 두 가지 기술을 설명했다. wholemounts을 사용하여 면역 조직 화학 20-23 망막 설치류에서 단백질의 현지화를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 몇 가지 제한이있다. 염색의 품질은 그 각각의 항원과 관심 특정 층에 망막 조직에 침투하는 능력을 인식하는 항체의 능력에 크게 의존한다. 이러한 문제는 신경절 세포 층을 통해 항체의 확산을 허용하도록 여과지없이, 최대 7 일까지 차 항체의 잠복기를 증가 트리톤-X의 농도를 증가 및 / 또는 망막을 배양함으로써 개선 될 수 있고, 광 수용체. 또 다른 제한은 durati입니다에와 고정의 농도. 조직이 한 시간 동안 고정 될 때 다른 항체가 짧은 고정 기간을 필요로하지만 어떤 항체는 더 나은 작동합니다. 특정 항체가 4 % ...

현재 1,2 채널 Ca는 전체 셀의 이들 성분의 약리 봉쇄를 통해 결정된 바와 같이 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포는) L-, N-, P / Q- 및 T 형 VGCC 표현. VGCC 송신기 자료, 유전자 전사, 세포 조절과 시냅스 가소성의 3,4,5에 참여하는 횡단 다중 체 단백질이다. 한 기공 채널의 생물 물리학 적 및 약리학 적 특성, 주로 세포 외 보조 α이 δ 소단위와 세포 내 β 서브 유닛을 설정 서브 유닛을 형성 α 대형, 횡단 : 기능 VGCCs은 서브 유닛 중 적어도 세 가지 클래스로 구성되어 있습니다. 다른 한 α 소단위와 후자의 두 형태 heteromeric 복합체와 세포막 6 채널의 게이팅 동력학 및 매매를 변경. 최근 수십 년 동안 많은 기술은 단백질 expre을 연구하기 위해 사용되었다이러한 면역 조직 화학, 효소 면역 분석법, 서부 분석 및 유동 세포 계측법 등 ssion. 이러한 기술은 주어진 관심 단백질의 검출을 위해 특정 항체의 사용을 필요로하고 다른 조직에서 지역화 특정 단백질의 분포를위한 강력한 도구를 제공한다. 항체가 용이하지 않을 때 예컨대 노던 블롯 분석과 같은 특정 단백질의 mRNA 발현 수준을 검출하고 정량화하기 위해 사용되는 기술은, RT-PCR은 실시간 정량 RT-PCR은, 동일계 하이브리드 화에서의 cDNA 마이크로 어레이 및 리보 뉴 클레아 제 보호 어 세이는 대안적인 접근법을 제공한다 특정 단백질을 사용할 경우 또는 발현 수준 7 낮다. 그러나, 이러한 분자 기술의 사용에 대한 제한은 하나의 유전자 서열의 신분증이다. 망막에서 단백질을 지역화하기 위해 면역 조직 화학 염색은 wholemount 망막 수행 할 수 있습니다. 망막 신경절 세포의 접근성, wholemount 인해준비는 RGC의 세포체와 축색 돌기 특정 단백질의 현지화를 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 현지화 외에도, 망막 신경절 세포에서 VGCCs 일부 기능적 특성은 칼슘 이미징 기술의 사용을 통해 입증 될 수있다. 우리는 선택적으로 세포 내 칼슘의 동력학을 측정하는 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포에 레이블 칼슘 촬상 프로토콜을 설명한다. 다른 세포 구획에서 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여도는 특정 서브 타입 칼슘 채널 차단제를 이용하여 분리 할 수​​있다. 아마도 여기서 설명 칼슘 이미징 기술의 가장 이로운 측면 중 하나는 독립적으로 동시에 다수의 망막 신경절 세포 및 그들의 축삭에서 기록하는 기능이다. 이러한 전체 세포 패치 클램프 녹음 등 많은 생리 학적 기술은 높은 시간 해상도 막 전류의 기록, 신체 또는 살전의 축삭 소스를 제공하지만기록 된 전자 전류는 구별 될 수없고 레코딩은 한번에 하나의 신경 세포로부터 제조 될 수있다. 다중 전극 배열 (다자간)는 동시에 여러 셀들로부터 스파이크를 기록 할 수 있지만, 검출되지도의 활성화를 구별, 칼슘 채널의 예를 들면, 상이한 서브 타입 둘 수있다. 우선적으로 대형 스파이크 구를 생성하는 세포에서 주어진 전극 (8) 기록에 가까이에있는 세포에서 기록 MEAS. 광학 이미징 방법은 단일 세포 미세 전극 및 패치 클램프 기록 MEA 기록에 의한 정보로 통합 될 수있는 세포의 전체 인구의 동시 독립적 녹화 가능하도록 대체 전략을 제공한다. 여기에 설명 된 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포의 칼슘 동역학을 연구하기 위해 사용되었지만, 패치 클램프 및 다자간 또한 상기 이온 전류 및 망막 신경절 세포의 특성을 규명 급상승 병렬로 사용될 수있다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 변위 무 축삭 세포 10 망막 마우스의 신경절 세포 층에서의 신경 인구의 약 60 %를 차지하기 때문에, 우리의 목표는 선택적으로 합성 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포를 라벨 로딩 기술을 사용하는 것이었다 wholemount 준비. 합성 칼슘 지표 염료는 세포 내 칼슘 역학 연구를위한 훌륭한 플랫폼을 제공하지만, 널리 사용은 효과적으로 주어진 네트워크 내에서 신경 세포의 특정 인구를로드 할 수없는 방해하고있다. 같은 대량로드 (11)와 일렉트로의 8,12와 같은 많은 기술은 세포의 전체 인구는, 그러나, 이러한 기술은 특정 세포 유형을 구별하지 않는로드하기 위해 수행되었다. 유전자 칼슘 지표 선택적으로 세포의 특정 집단 레이블을 할 수있는 능력을 제공하는 부호화 그러나 이러한 방법은 형질 전환 동물 (13)의 생성을 요구한다. 우리의 기술 방식 운전 방식을 설명d를 선택적으로 칼슘 지시 염료의 시신경 그루터기 주입을 통해 wholemount 준비 망막 신경절 세포 레이블을. 이와 함께,이 문서에 설명 된 구조와 생리 학적 기술은 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 현지화 및 칼슘 신호에 VGCCs의 기여를 공부하는 플랫폼을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>스트레이트 가위</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>스트레이트 집게</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>곡선 홍채 가위</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>셀룰로오스 여과지</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp; productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>벡터</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp; rct=j& q=& esrc=s& 출처 = web& cd=1& cad=rja& sqi=2& ved=0CC0QFjAA& url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279& ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw& usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA& sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg& bvm=bv.48705608,d.cGE">형광용 매체 장착</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 펜타칼륨</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>마취</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) 대물렌즈 렌즈</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG (H+L) 항체</td><td>분자 프로브</td><td>A-11034</td><td>보조 항체</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>토끼 다클론 항체&nbsp; RBPMS의 N-terminus에 대해 생성되었습니다. 폴리펩티드(RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, 상업 공급업체(ProSci, Poway, CA)에 의해.</td></tr></tbody></table>

wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

본 논문에서 우리는 도구, 시약 및에 필요한 실제적인 단계를 설명 : 면역 조직 화학 염색에 대한 wholemount 망막의 1) 성공적인 준비를하고, 망막에서 칼슘 신호 전달을 매개 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCC)의 연구를위한 2) 칼슘 이미징 신경절 세포. 칼슘 촬상 방법 우리 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 우회 관한 문제를 설명한다.

특정 항체를 Immunolabeling은 망막과 칼슘 이미징 기술에 대한 관심의 특정 단백질의 현지화를 연구하는 플랫폼을 제공하는 망막 신경절 세포 축색 돌기의 칼슘 역학 VGCCs의 기여에 대한 연구를 허용합니다. 신경절 세포 단백질 RBPMS에 대해 선택적으로 망막 신경절 세포 (19) 레이블 (다중 접합와 RNA 결합 단백질)을 항체를 사용하여, 우리는 FLUO-4 라벨은 신경절 세포 (그림 1)로 제한되어 있음을 보여줄 수 있었다. 루터 주입이 기술에서 예상 할 수있는 모든 신경절 세포의 라벨로 이어질하지 않습니다. 토끼 폴리 클로 날 항체는 상업적 공급 업체 (표 1)에 의해, RBPMS 폴리펩티드 (RBPMS 4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR의 N-말단에 대해 생성 하였다. RBPMS 높은 포유 동물...

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

이 절차의 전반적인 목적은 칼슘 지시 염료를 시신경 단단에 주입하여 전층 표본(whole mount preparation) 내의 망막 신경절 세포를 선택적으로 표지하는 것입니다. 이는 먼저 Flow four와 같은 매우 높은 친화도의 칼슘 지시 염료를 시신경 단단에 주입함으로써 이루어집니다. 다음으로, 망막을 안구 컵에서 분리하고 4분면으로 나누어 유리 슬라이드에 마운팅합니다. 생리학적 조건을 모방하여 설정된 기록 챔버 내에서, 칼슘 신호에 대한 전압 개폐성 칼슘 채널의 기여도를 분석합니다.채널 차단제를 사용하여 탈분극된 세포에서 망막 신경절 세포를 측정할 수 있습니다. 최종적으로, 이 결과는 고농도 칼륨 유도 칼슘 신호와 같은 신호에 대해 전압 의존성 칼슘 채널의 기여도에 대한 반정량적 측정값을 제공할 수 있습니다. 전기천공법이나 벌크 로딩과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전장 표본 준비물, 해부된 쥐의 눈, 그리고 보존액 또는 이와 유사한 용액 내에서 망막 신경절 세포와 그 축삭을 선택적으로 표지할 수 있다는 점입니다.이제 칼슘 이미징 실험을 수행하려는 경우, flow four를 이용하여 망막 신경절 세포를 역충전하십시오. 물로 재구성한 40 millimolar flow four penta potassium salt 0.5 µL를 안구 뒤쪽으로 약 1 mm 지점의 시신경 단단면에 주입하십시오. 그 후 안구를 포유류 링거액(mammalian ringers)으로 옮기십시오.95% 산소, 5% 이산화탄소로 버블링하거나 실온에서 1시간 동안 둡니다. 준비물은 암소에 보관하십시오. 빛의 세기가 조절된 현미경 하에서 안구를 해부합니다.면도날을 사용하여 안구 앞부분에 조심스럽게 작은 절개를 넣고 각막을 제거합니다. 그다음 핀셋을 사용하여 망막 내측 표면에서 수정체를 제거합니다. 공막을 단단히 잡으십시오.다른 포셉으로 유리체를 제거할 때, 유리체 기저부를 망막 중심 방향으로 조심스럽게 벗겨냅니다. 이렇게 만들어진 I 컵(I cup) 표본은 면역조직화학적 전체 마운트(whole mount) 표본, 칼슘 이미징 표본으로 처리하거나, 면역조직화학적 전체 마운트 표본 제작을 위한 망막 횡단면 절편으로 준비할 수 있습니다. 먼저, 망막이 평평하게 펴지도록 네 군데를 절개합니다.망막의 신경절 세포층이 아래로 향하도록 유리 커버 슬라이드 위에 놓습니다. 둘째, 망막에 용액 한 방울을 가하고 필요한 경우 셀룰로오스 필터 페이퍼로 덮은 뒤, 브러시나 핀셋을 사용하여 망막을 평평하게 폅니다. 셋째, 망막이 완전히 평평해지고 필터 페이퍼에서 떨어지면, 이를 다시 용액 속으로 넣습니다.준비물을 처리하기 위해 먼저 4% paraform aldehyde에 10~15분 동안 옮깁니다. 그다음 pH 7.4의 0.1 molar 인산염 완충액에서 망막을 3회 세척하며, 회당 30분씩 총 90분 동안 세척합니다. 이어서 500 µL의 블로킹 용액에 망막을 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.이 용액은 인산 완충액에 5% 일반 염소 혈청 또는 당나귀 혈청, 0.3% Triton 및 0.1% sodium azide를 포함합니다. 이후 5~7일 동안 4°C에서 1차 항체 용액에 망막을 배양하십시오. 이 용액의 조성은 실험적으로 결정해야 합니다. 고정액을 세척했던 것과 동일한 방식으로 1차 항체 용액을 세척하여 제거하십시오.그 후 망막을 1:1000 농도의 2차 항체에서 4°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 2차 항체를 인산 완충액으로 세 번 더 세척하여 제거합니다. 그런 다음 시각화를 위해 망막을 마운팅하고 매니큐어로 밀봉합니다.이 슬라이드들은 4°C의 암소에 보관해야 합니다. 링거액에 담긴 I 컵으로 칼슘 이미징 전체 마운트 표본 제작을 시작합니다. 먼저, 망막 조직을 4분면으로 절단하십시오.강글리온 층이 위를 향하도록(즉, 광수용체 층이 아래를 향하도록) 사분면 하나를 기록 챔버 위에 평평하게 놓습니다. Kim wipe로 주변 영역을 조심스럽게 닦아내고, 그리스를 바른 하프를 조직 위에 부드럽게 올립니다. 이제 망막 표본을 장치에 장착하고 8채널 중력 구동 초과관류 시스템 설정을 완료합니다.하프를 설치한 후 고정된 망막이 움직이면, 하프를 조심스럽게 제거하고 세척하십시오. 망막 주변 부위를 건조시킨 후 하프를 다시 장착하십시오. 기록 챔버를 포유류 링거 용액(mammalian ringer solution)으로 채우고, 95% oxygen, 5% carbon dioxide 혼합 가스로 용액에 계속해서 기포가 발생하도록 유지하십시오.먼저 약물을 처리하지 않은 대조군으로서, 3 mM에서 60 mM까지의 고칼륨 펄스를 33초 동안 두 차례 쌍으로 실시합니다. 준비 과정이 정상적이라면, 탈분극 시 RGC의 전압 개폐 칼슘 채널이 활성화되어야 합니다. 이제 실험을 진행하십시오.Nifedipine과 같은 L형 전압 개폐성 칼슘 채널 차단제는 탈분극으로 유도된 칼슘 신호에 대한 L형 전압 개폐성 칼슘 채널의 기여도를 평가하는 데 흔히 사용됩니다. 비특이적 칼슘 채널 차단제를 사용하여 전압 개폐성 칼슘 채널을 비선택적으로 차단할 수 있습니다. 형광 RGC의 이미지를 시각화하고 획득하기 위해 5초마다 표본을 스캔하십시오.가능한 한 낮은 레이저 출력을 사용하십시오. 여기(Excitation)는 488 nanometers로 설정하고, 방출(emission)은 505 nanometer LP 필터로 수집해야 합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여, 다중 splicing flow를 가진 RNA 결합 단백질인 신경절 세포 단백질 R-B-P-M-S에 대해 면역 표지를 수행하였습니다. Four.항체 특성에 따라 염색은 실제로 신경절 세포로 제한되었습니다. 다음으로, rgc에서 획득한 형광 강도 값을 이용하여 R GCs 내 칼슘 신호에 대한 전압 개폐형 칼슘 채널의 기여도를 연구했습니다. 기저 수준에서 RGC 및 RGC 축삭이 flow four로 표지된 것을 확인할 수 있습니다.형광 강도 값을 얻기 위해 신경절 세포, 세포체 및 또는 축삭에 ROI를 설정하였습니다. 전층 표본 준비물에 고농도 칼륨을 처리하자 RGC의 형광 신호가 증가하였습니다. 이후 두 번째 고농도 칼륨 펄스 동안 코발트가 존재하는 상황에서 형광 강도 값이 감소하는 것이 관찰되었습니다.이 영상을 시청하신 후에는, 전체 마운트(whole mount) 표본 제작 시 합성 칼슘 지시약 염료를 사용하여 망막 신경절 세포를 선택적으로 염색하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

망막 보철물은 시각적 지각을 생성하는 능력이 있습니다. 새로운 보철물의 개발을 앞당기기 위해서는 이식 전에 장치를 테스트하기 위한 생체 외 방법이 필요합니다. 이 논문은 전기 자극을 받았을 때 망막 신경절 세포층의 칼슘 활성을 연구하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)는 감각 뉴런 신호에 대한 강력한 집단 수준 분석을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 쥐의 삼차신경절 뉴런 활동의 생체 내 GECI 시각화를 가능하게 하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다.

생체 내 쥐 삼차신경절(Rat Trigeminal Ganglion)의 감각 뉴런의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 전체 마운트 마우스 망막을 분리하고 모든 망막 신경절 세포(RGC)를 표지하기 위해 면역염색을 수행하는 절차를 설명합니다. 그 다음에는 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 망막 신경절 세포를 이미징하고 자동으로 계수하여 전체 마우스 망막에서 망막 신경절 세포를 정량화하는 간단하고 빠르며 정확한 방법을 제공합니다.

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells(전체 마운트 면역염색 및 마우스 망막 신경절 세포의 자동 계수)

배우세요 쥐 망막 신경절세포의 선택적 칼슘 이미징 및 면역조직화학 기법을 통한 신경과학 연구 방법. 이 기술은 세포 내 칼슘 역학과 전압 의존성 칼슘 채널 기여도를 정량적으로 분석할 수 있습니다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

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