Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

이 절차의 전반적인 목표는 칼슘 지시 염료의 시신경 그루터기 주사를 통해 전체 마운트 준비에서 망막 신경절 세포를 선택적으로 라벨링하는 것입니다. 이것은 먼저 flow four와 같은 매우 높은 친화성 칼슘 지시 염료를 시신경 그루터기에 주입함으로써 달성됩니다. 다음으로, 망막은 아이컵에서 분리되어 사분면으로 나뉘어 유리 슬라이드에 장착됩니다 생리학적 조건을 모방하도록 설정된 기록 챔버에서 칼슘 신호에 대한 전압 게이트 칼슘 채널의 기여.

망막에서 신경절 세포는 채널 차단제를 사용하여 탈분극된 세포에서 측정할 수 있습니다. 궁극적으로, 결과는 높은 칼륨 유발 칼슘 신호와 같은 신호에 대한 전압 교육 칼슘 채널의 기여도에 대한 반정량적 측정을 제공할 수 있습니다. 전기천공법(electroporation)과 벌크 로딩(bulk loading)과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 전체 마운트 준비 저장소에서 망막 신경절 세포와 축삭돌기를 선택적으로 라벨링하고, rad eyes를 절제하고, 목표 배지 또는 유사한 용액을 동면할 수 있다는 것입니다.

이제, 칼슘 이미징 실험을 수행하고자 한다면, 망막 신경절 세포를 flow four로 다시 채우십시오. 0.5 마이크로 리터의 40 밀리 몰 흐름 4 펜타 칼륨 염을 시신경에 주입하고 안구 약 1mm 뒤쪽에 그루터기를 만듭니다. 안구를 포유류 링거로 옮깁니다.

산소 95%, 이산화탄소 5% 또는 실온에서 한 시간 동안 거품을 일으킵니다. 준비를 어두운 곳에 보관하십시오. 광도를 조절한 현미경으로 눈을 해부합니다.

면도날을 사용하여 안구 앞쪽을 부드럽게 절개하여 각막을 제거합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 내부 망막 표면에서 수정체를 제거합니다. 공막을 단단히 잡으십시오.

다른 집게로 유리체를 제거할 때는 망막 중앙을 향해 유리체 바닥을 부드럽게 벗겨냅니다. 그 결과 I 컵이라고 하는 제제는 면역조직화학 전체 마운트 제제, 칼슘 이미징 제제로 처리하거나 횡방향 망막 절편을 위해 처리하여 면역조직화학 전체 마운트 제제를 만들 수 있습니다. 먼저 망막을 네 번 절개하여 평평하게 놓이도록 합니다.

망막을 신경절 세포층이 아래를 향하도록 하여 유리 덮개 슬라이드에 놓습니다. 둘째, 망막에 용액 한 방울을 떨어뜨리고 필요한 경우 셀룰로오스 여과지로 덮고 브러시나 집게로 망막을 평평하게 만듭니다. 셋째, 망막이 완전히 평평해지고 여과지에서 분리되면 용액에 다시 넣습니다.

제제를 먼저 처리하려면 10-15분 동안 4%파라폼 알데히드로 옮깁니다. 그런 다음 pH 7.4의 0.1 몰 인산염 완충액에서 30분 동안 총 90분 동안 망막을 세 번 세척합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 차단 용액에 망막을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

이 용액은 다음 5-7일 동안 0.3% 트리톤과 0.1% 아지드화나트륨이 함유된 인산염 완충액에 5% 정상 염소 혈청 또는 당나귀 혈청을 투여하고 섭씨 4도의 1차 항체 용액에서 망막을 배양합니다. 이 해결책의 구성은 경험적으로 도달해야 합니다. 고정제를 씻어낸 것처럼 기본 항체 용액을 씻어냅니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1에서 1000의 농도로 2차 항체의 망막을 배양합니다. 3회 더 세척하고 인산염 완충액으로 2차 항체를 제거합니다. 그런 다음 시각화를 위해 망막을 장착하고 매니큐어로 밀봉합니다.

이 슬라이드는 섭씨 4도의 어두운 곳에 보관해야 합니다. 링거에서 I 컵에서 칼슘 이미징 전체 마운트 준비를 만드는 것으로 시작하십시오. 먼저 망막 조직을 사분면으로 자릅니다.

신경절층이 위를 향하도록 기록실에 한 사분면을 평평하게 놓고, 따라서 광수용체층이 아래를 향하도록 놓습니다. 김 물티슈로 주변을 조심스럽게 말리고 기름칠한 하프를 티슈에 부드럽게 올려 놓습니다. 이제 리그에 망막 준비물을 로드하고 8채널 중력 구동 초융합 시스템 설정을 마칩니다.

하프를 놓은 후 장착된 망막이 움직이면 하프를 조심스럽게 제거하고 청소하십시오. 망막 주변을 말리고 하프 슈퍼를 다시 장착합니다. 기록 챔버를 포유류 링거 용액으로 융합하고 용액을 95%의 산소, 5%의 이산화탄소로 계속 거품을 일으키도록 합니다.

먼저, 약물을 사용하지 않은 대조군으로 33초 동안 3밀리몰에서 60밀리몰까지 두 쌍의 고칼륨 펄스를 수행합니다. 탈분극, 망막 신경절 세포는 제제가 작동하는 경우 전압 의존성 칼슘 채널을 활성화해야 합니다. 이제 실험을 진행하십시오.

니페디핀(Nifedine) 및 L형 전압 개폐 칼슘 채널 차단제(Ltype voltage gated calcium channel blocker)는 탈분극 유발 칼슘 신호 코발트에 대한 L형 전압 개폐 칼슘 채널의 기여도를 평가하는 데 일반적으로 사용됩니다. 비특이적 칼슘 채널 차단제는 전압 개폐 칼슘 채널을 비선택적으로 차단하는 데 사용할 수 있습니다. 5초마다 준비물을 스캔하여 형광 rgc의 이미지를 시각화하고 획득합니다.

가능한 한 낮은 레이저 출력을 사용하십시오. 여기(excitation)는 488나노미터로 설정해야 하며 방출은 505나노미터 LP 필터로 수집해야 합니다. 기술된 프로토콜을 사용하여, 다중 스플라이싱 흐름을 가진 RNA 결합 단백질인 신경절 세포 단백질 R-B-P-M-S에 대해 면역 표지를 수행했습니다. 4.

염색은 실제로 항체 사양에 따라 신경절 세포에 국한되었습니다. 다음으로, Rgc에서 얻은 형광 강도 값을 사용하여 R GC의 칼슘 신호에 대한 전압 개폐 칼슘 채널의 기여도를 연구했습니다. 기준선 수준에서, 망막 신경절 및 망막 절막 절막 축삭은 흐름 4로 표지된 것을 볼 수 있습니다.

형광 강도 값을 얻기 위해, ROI는 신경절 세포, 소마타 및/또는 축삭돌기에 배치되었습니다. 전체 마운트 준비에 높은 칼륨을 적용한 후 RG C'S의 형광 신호가 증가했습니다. 그 다음에는 두 번째 높은 칼륨 펄스 동안 코발트가 존재할 때 형광 강도 값이 감소했습니다.

이 비디오를 시청한 후, 전체 마운트 준비에서 합성 칼슘 지시약 다이가 있는 망막 신경절 세포를 선택적으로 로드하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.