HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

다음 실험의 전반적인 목표는 관심 화합물을 스크리닝하여 세포 독성 및 야생형 또는 약물 내성 HIV를 단일 라운드 감염성 분석에서 억제하는 능력을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 흡수를 위해 화합물에 노출시킨 다음 야생형 또는 약물 내성 HIV ONE을 발현하는 루시퍼라아제로 처리된 세포를 배양함으로써 달성됩니다. 그런 다음 바이러스의 루시퍼라제 활성을 측정할 수 있습니다.

궁극적으로, 루시퍼라제 판독 신호는 화합물에 의한 HIV V one 바이러스 벡터 복제 억제를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 약물 내성 HIV에 대해 더 나은 효능을 나타내는 새로운 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있으므로 치료적 의미가 있습니다. 이러한 화합물은 HIV 1 환자의 항레트로바이러스 요법에 잠재적으로 사용될 수 있습니다 전날 transfection plate 2 100mm 접시에 1, 500, 000 세포의 밀도로 93 세포.

다음 날, 인산칼슘 방법 앱을 사용하여 16마이크로그램의 야생형 또는 돌연변이 HIV와 4마이크로그램의 VSV로 세포를 transfection합니다. 6시간 후, 2,93개의 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 48시간 동안 새로운 배지로 배양합니다. 2 일 후, 직경 100mm의 접시에서 S 상등액을 포함한 바이러스를 채취하고 상온에서 1, 620Gs에서 10 분 동안 저속 원심 분리로 상등액을 정화합니다.

다음으로, 45마이크로몰 공극 크기의 주사기 필터를 통해 상층액을 여과하고 터보 DNA로 바이러스 현탁액을 처리합니다. 실온에서 30분 후 바이러스를 새 배지로 희석하여 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 실험 전날 감염성 분석에서 화합물 스크리닝을 수행하기 위해 관심 세포 4, 000개를 96개의 각 웰에 시드합니다.

100 마이크로 리터의 매체에 웰 플레이트를 넣고 5 % 이산화탄소에서 섭씨 37 도에서 배양합니다.24 시간 후, 원액의 화합물을 새로운 매체로 연속적으로 희석합니다. 선택된 최종 농도는 표에 설명된 대로 경험적으로 결정된 농도 범위에 따라 달라집니다.

다음으로, 화합물의 연속 희석액을 웰에 삼중으로 첨가합니다. 최종 농도의 10분의 1 부피에서 화합물의 적절한 희석액을 최소 3시간 동안 세포와 함께 배양합니다. 배양 후 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100마이크로리터의 희석된 바이러스를 추가합니다.

음의 대조군 웰을 수락합니다. 그런 다음 플레이트를 다시 48시간 동안 배양합니다. 배양 후 200 마이크로 리터 피펫 팁이 장착 된 유리 피펫을 사용하여 배지 상단에서 시작하여 웰의 하단 모서리를 향해 천천히 내려가는 웰의 배지를 흡입합니다.

즉시 0.5 밀리몰 염화마그네슘이 보충된 PBS 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가한 다음 루시페라제 활성을 측정하고, 공급된 동결건조 시약의 각 바이알에 발광 리포터 유전자 분석에서 10 마이크로리터의 기질 완충액을 추가합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 재구성된 시약을 각 웰에 추가하고 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양하여 신호가 발생하도록 합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 광도계를 사용하여 96웰 플레이트를 판독합니다.

성공적인 화합물 스크리닝 절차의 루시퍼라제 값이 표에 나와 있습니다. 잠재적으로 강력한 화합물은 이 대표적인 Kaleido 이식편에서 가장 높은 신호를 나타내는 대조군과 함께 증가하는 루시페라제 활성을 나타냅니다. 화합물의 농도 대 루시퍼 활성의 억제율은 화합물이 야생형 또는 약물 내성 HIV의 복제를 억제하는 데 효과적인지 여부를 결정하기 위해 표시되었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 플레이트의 모든 웰에 균일한 양의 세포와 바이러스를 정확하게 분배하고 각 웰에 적절한 농도의 화합물을 넣는 것이 중요합니다.