Name: HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 학습하세요 루시퍼레이스 분석을 활용한 HIV-1 역전사 및 인테그라제 억제제의 빠른 선별 방법을. 약물 내성 바이러스에 대한 새로운 항레트로바이러스 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 NCI의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.

마스터 주식의 1. 준비 <ol><li> DMSO에서 테스트 할 수있는 화합물의 마스터 주식을합니다. 20 mm의 표준 농도로 주식을 준비합니다. 참고 : 10 mM의 위의 모든 농도 사용할 수 있습니다. 이 분석의 유효성을 검사하는 데 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수있는 화합물은 RAL, EVG 및 DTG 있습니다. </li><li> 확인 화합물은 15 초 동안 솔루션을 여러 번 볼 텍싱하고 1 시간 동안 실온에서 배양하여 DMSO에 용해된다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 어둠 속에서 20 밀리미터 주식 솔루션을 저장합니다. </li></ol> 화합물 스크리닝을위한 96 - 웰 플레이트의 2. 준비 <ol><li> 시험되어야하는 세포주 (예 HOS 또는 TZM-BL)을 선택하고, (미디어 (4000 세포 / 웰) 4 × 104 세포 / ml의 밀도로 그 세포 100 μl를 시드 예 둘 베코 변성 이글 또는 DMEM 배지 5 % (v / v) 소 태아 혈청, 5 % 갓 태어난 송아지 혈청, 페니실린 (50 유닛 / ㎖)이 보충 된 플러스 streptomycin). </li></ol> 바이러스 주식의 3. 세대 32 ~ 34 (그림 1, 1 단계에서와 같이) 293 세포를 형질 전환하여 VSV-G-pseudotyped HIV를 생산하고 있습니다. <ol><li> 종래 형질 일째에 1.5 × 106 세포의 밀도로 100mm 직경 접시에 293 세포를 접시. </li><li> 인산 칼슘 방법 35을 사용하고 4 VSV (pHCMV-G) ㎍의 - 형질의 날, 16 야생형 또는 돌연변이 HIV (ΔLUC pNLNgoMIVR) ㎍의와 293 세포를 형질. </li><li> 인산 칼슘 침전물 후 약 6 시간 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 두 번 293 세포를 세척하고 48 시간 동안 신선한 매체와 부화, 추가됩니다. [DMEM 5 % (v / v) 소 태아 혈청, 5 % 갓 태어난 송아지 혈청, 페니실린 (50 유닛 / ㎖) 플러스 스트렙토 마이신 (50 ㎍ / ml)로 보충]. </li><li> 100mm 직경에서 매체를 제거하여 상청액을 함유하는 바이러스를 수확식기류, RT에서 30 분 동안 터보 DNA 분해 효소와 상청액을 치료, 45 ㎛의 기공 크기 주사기 필터를 통해 상청액을 고를, 10 분간 3000 rpm에서 저속 원심 분리하여 상층 액을 명확히하고 감염 분석에서 제조에 대해 미디어의 상등액을 희석 . -80 ° C에서, 분량 씩 냉동 바이러스 상층 액을 저장 주 : 상등액에서 P24의 양은 HIV-1 P24 효소 - 결합 면역 분석 키트를 사용하여 결정된다. P24 농도는 시료에서 바이러스 양을 제어하는​​데 사용된다. 바이러스 약 500 NG 전에 감염에 하루에 1.5 × 105 세포 / 접시의 밀도로 60mm 직경 접시에 도금 된 HOS 세포에 첨가된다. 배양 48 시간 후, 균체를 수확하고 원심 분리에 의해 회수하고, 세척하고, 100 ㎕의 PBS에 재현 탁. 발광 리포터 유전자 분석 시약의 동일한 금액을 추가하고 섹션 5.4.1에 설명 된대로 루시 페라 제 활성을 측정하고5.4.2. 단계 4.6에서 논의 된 바와 같이 이로부터 바이러스의 적절한 희석 할 수있다. </li></ol> 4. 96 - 웰 플레이트에서 상영 컴파운드 중으로 각 화합물을 스크린과 결과를 평균. 참고 : 바이러스 복제에 대한 각 화합물의 효과를 임의의 화합물의 부재하에 수득 복제 수준으로 정상화에 의해 보정된다. <ol><li> 상영하는 실험 농도 범위를 결정합니다. 참고 : 일반적으로, 11 직렬 희석와 화면을 열 7 시리얼 희석와 스크린에 의한 플레이트 열 화합물을 첨가하여 만든이 행에 의해 화합물을 첨가하여 만들어집니다. 우물 설정 한 세중는없는 복합 컨트롤에 예약해야합니다. 또한, 하나의 열 또는 한 행은 음 / 배경 제어 역할을하는 빈 남아 있어야합니다. 바이러스가 추가되면 마지막으로,이 세포 독성 또는 감염성 분석 여부를 지시 할 것이다. </li><li> 준비20 mM의 원액에서 시리얼 희석. (표 1에 나타낸 바와 같이) 농도는 시험 될 농도를 실험적으로 결정된 범위에 따라 선택된다. 최종 농도가 100 μM 될 것입니다 즉, 경우, 1 ㎜ 작업 주식을, 10 배 원하는 최종 농도 미디어의 희석을 준비합니다. 참고 : 50의 5-10 μM 위의 IC를 가진 화합물은 약물 개발을위한 일반적으로 좋은 후보가되지 않습니다. 초기 분석에서 우리는 WT 벡터에 대해 화합물을 테스트합니다. 효과적으로 WT 벡터를 억제 유망 화합물은 다음 약물 내성 돌연변이의 패널에 대해 테스트됩니다. </li><li> (도 1, 단계 2에 도시 된 바와 같이) 인큐베이터에서 96 - 웰 플레이트를 제거하고있는 삼중 웰에 시험 될 화합물의 연속 희석액을 추가한다. 주 : 웰에 첨가 볼륨이 최종 농도의 1 / 10 양이어야한다. 따라서, 22 μL / 잘 (최종 볼륨 P를 추가OST 바이러스의 추가 감염의 분석 220 μL)입니다. 세포 독성 분석의 경우, 11 μL / 잘 (최종 부피가 110 μL / 잘)를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에 96 - 웰 플레이트를 돌려줍니다. 세포 독성 화면의 경우, 37 ° C에서 96 - 웰 플레이트 48 시간을 배양하고 더 이상의 조작이 프로토콜 4에 필요하지 않습니다 : 프로토콜 5로 이동 감염성 시험 법의 경우, 프로토콜 4의 지침에 따라 계속합니다.. </li><li> 감염의 분석 만. 분석 할 수있는 화합물과 37 ° C에서 3 시간 배양 최소 후 인큐베이터에서 접시를 제거합니다. 주 :이 화합물은 HIV 벡터로 사전 감염 세포에 의해 흡수되도록한다. </li><li> 바이러스 (33)의 주식 희석을 준비, 34 (보통 약 1시 3분) 처리되지 않은 세포에서 0.2-1.5 상대 루시 페라 제 단위 (RLUs) 사이의 루시 페라 제 신호를 생성 것이다. 전체 판 dilu의 약 10 ㎖를 취할 것테드 바이러스. 8 또는 12의 멀티 채널 피펫을 사용하여, 각 웰에 100 ㎕의 바이러스의 추가. 음 / 배경 제어 우물에 바이러스를 추가하지 마십시오. 48 시간 동안 37 ° C의 배양기에 플레이트를 반환합니다. 참고 : 바이러스의 1:3 콘텐츠의 희석 상등액의 바이러스 농도가 약 500 ㎖에 1.0 ng를 있다는 취지 P24 분석에 근거 0.2 -1.5 RLUs 사이 루시페라아제 신호를 생성한다 전형적인 희석이다. </li></ol> 5. 준비 및 96 - 웰 플레이트에 세포 독성 및 감염성 측정 <ol><li> 우물에서 미디어를 대기음 (미디어 페놀 레드하는 루시 페라 제 신호를 방해 할 수 있습니다.) 끝 부분에 부착 된 200 μL 피펫 팁과 유리 피펫을 사용합니다. 미디어의 상단에 시작하고 천천히 잘 하단 모서리쪽으로 아래로 작동합니다. 우물의 바닥에 너무 많은 시간을 낭비하지 마십시오, 또는 세포가 잘 제거 할 수 있습니다. </li><li> PBS의 추가 100 ㎕를 0.5 m로 보충물론 각 M MgCl2를. 이것은 세포가 건조되지 않도록 용지가 제거 된 직후에 수행 될 필요가있다. </li><li> 만 세포 독성 분석을 위해, 공급 동결 건조 된 시약의 각각의 병에 발광 ATP 탐지 분석에서 기판 버퍼의 5 ML을 추가합니다. 한 바이알을 96 - 웰 플레이트에 충분하다. <ol><li> 물론 각각에 발광 ATP 탐지 분석에서 세포 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 컴팩트 thermomixer를 사용 5 분간 RT에서 700 rpm으로 96 - 웰 플레이트를 흔들어. </li><li> 부정적인 제어 / 배경 우물을 제외한 모든 웰에 재구성 발광 ATP 탐지 분석 시약의 5​​0 μl를 추가합니다. 컴팩트 thermomixer를 이용 5 분 동안 실온에서 700 rpm으로 흔들어. 신호 개발을위한 시간을 허용하기 위해 20 분 동안 RT에서 플레이트를 배양한다. </li><li> 마이크로 루미를 사용하여 96 - 웰 플레이트를 참조하십시오. 참고 : SoftMax 프로 마이크로 루미 프로그램을 엽니 다. 확인 루미는 루미를 측정하기 위해 설정되어 있는지 확인5 판독 / 웰의 감도에 nescence. </li></ol></li><li> 만 감염의 분석을 위해, 공급 동결 건조 된 시약의 각각의 병에 발광 리포터 유전자 분석에서 기판 버퍼 10 ML을 추가합니다. 하나 유리 병 각 96 - 웰 플레이트에 충분하다. <ol><li> 물론 각 재구성 발광 리포터 유전자 분석 시약 100 μl를 추가합니다. 신호 개발을위한 시간을 허용하기 위해 20 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 섹션 5.3.3에서 수행으로 마이크로 루미를 사용하여 96 - 웰 플레이트를 참조하십시오. </li></ol></li></ol> 화합물에 대한 CC (50)와 IC 50 값의 6. 결정 <ol><li> 엑셀 스프레드 시트에 마이크로 루미에서 루시 페라 데이터를 전송합니다. <ol><li> 보통 둘 중으로 및 배경 / 제어 신호 데이터에서 루시페라아제 데이터. 전체 농도 범위에 대한 평균 삼중 신호로부터 평균 배경 / 제어 신호를 뺀다. </li> &lt;리&gt; 배경이 억제 백분율을 결정하기 위하여 임의의 화합물의 부재에서, 세포 독성 또는 감염성인지, 활동에 대해 농도 범위에 대한 평균 신호를 보정 정규화. 주 : 억제율은 100을 곱하여 약물의 부재하에 루시퍼 라제 활성으로 나눈 약물의 존재 하에서 루시퍼 라제 활성으로 정의된다. </li></ol></li><li> CC (50) 및 IC (50)의 값을 구하는 것이 칼레이다 소프트웨어 프로그램을 사용 <ol><li> 실험적으로 결정된 농도 범위 및 칼레이다으로 루시퍼 라제 활성의 억제 백분율을 모두 전송. </li><li> X 축상에서의 농도 범위 및 y 축 루시퍼 라제 활성의 억제 백분율로 데이터를 플롯. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

우리는 세포 독성 및 WT 및 약물 내성 HIV-1 모두의 복제를 억제하는 능력에 대해 화합물을 선별하는 데 사용될 수있는 빠르고, 효율적이고, 재현성 분석을 기술한다. 신속 화합물을 식별하고 그들의 효능 및 독성을 시험하는 능력은 HIV-1에 대하여 새롭게 개선 약의 개발에 중요하다. 납 화합물이 식별되면, 리드 화합물의 유사체를 제조하고 동일한 분석을 이용하여 시험 될 수있다. 분석은 비교적 간단하다. 사용자가 가장 일반적인 문제 (독성 화합물, 벡터 stock 문제)을 진단 할 수 모두 긍정적이고 부정적인 컨트롤이 있습니다. 무첨가 화합물 웰 중으로 세트의 사용은 바이러스 성 감염이 발생했음을 나타낸다. 세포 독성 분석은 독립적으로 측정하고 있다는 사실은 바이러스 복제에 대한 구체적인 효과로서 세포 독성에 기인 한 루시 페라 제의 감소를 잘못 해석하​​는 것을 피한다. 중요한 단계세포가 균일 웰의 각각에 바이러스의 동일한 양을 첨가하고 루시퍼 라제 활성을 측정, 웰 시험 될 화합물의 적절한 농도를 가지고, 웰에 분포되도록 프로토콜에 플레이트를 준비 CC (50)와 IC 50 값을 결정합니다. 분석은 안전하고 양적 및 재현성. 벡터는 복제에 결함이 있기 때문에 분석은 안전합니다. 그것은 정확하고 편리하게 정량 할 수있는 루시 페라 제를 표현하는 하나의 라운드 벡터를 기반으로하기 때문에 분석은 양적 및 재현성. 다중 라운드 바이러스 복제 검정법에서 측정 된 IC (50)는 바이러스의 생활주기의 수에 의존한다; 분석은 WT와 크게 다른 복제 능력을 가질 수있다 약물 내성 바이러스를 모두 포함 할 때 특정 문제입니다. 여러 효소 분석은 할 수 있습니다 이전에보고 된 바있다IN 억제제에 대한 화면으로 사용할 수도 있습니다. 통합 DNA를 측정하는 실시간 PCR 기술을 포함 분석법 더욱 노동 집약적 및 36, 37 고가 모두 정제 재조합 단백질 (들)을 필요로하며, 일반적으로이다. 그것이 다른 바이러스 효소 (RT 및 프로테아제)의 화합물의 영향을 측정하기 위해 효소 분석법을 사용하는 것이 가능하지만, 각 효소는 자신의 분석 시스템을 필요로한다. 한 라운드 벡터 분석은, 한 바와 같이, RT 억제제에 대한 화면으로, 수정없이 사용할 수 있습니다. 비슷한 분석은 단백질 분해 효소 억제제에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다; 그러나, 프로테아제 억제제의 분석에서, 화합물은 벡터를 생성하기 위해 사용 된 세포에 첨가되어야한다. 관련 분석은 다른 세포 및 벡터를 사용하여, 또한 엔벨로프 (ENV) 및 엔트리 HIV 융합 억제제 스크리닝하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 분석은 자동화 된 로봇 식 디스펜서와 함께 대규모로 사용될 수있다. 따라서, 분석은 WT 및 m에 대해 화합물의 대형 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수있다utant HIV. 그러나, 사실은 분석은 데이터 해석의 제한 바이러스 생활주기의 다른 단계 점에 작용 HIV 복제의 억제제를 검출 할 수있다. 자체 분석은 수명주기의 단계는 화합물에 의해 차단되는 정의하지 않습니다. 이 문제가 발생하면, 그것은 또한 분석 실험 38 시간을 사용하여 해결하고, 정제 된 재조합 바이러스 단백질에 대한 화합물을 테스트하여 할 수 있습니다. 불행하게도, 항 HIV 약물의 성공에도 불구하고, 저항 및 독성 두 문제는 여전히있다. 효과적인 안티 HIV 백신의 부재에서, 기존의 약제 내성 뮤턴트에 대하여 효과적 일 것이다, 또한 바이러스의 확산을 감소시킬 수 예방 약물을 개발하기위한 새로운 치료제를 개발하기 위해 단지 요구된다. 항 HIV 약물의 예방 적 사용은 감염되지 않은 사람들의 치료를 침골 경우,이 방법은 L이되는 약물을 개발에 특별한 부담이됩니다ittle 없거나 장기 독성.

HIV-1 바이러스의 생활주기의 몇 가지 중요한 단계를 대상으로 약물의 가용성이 크게 HIV-1 감염의 치료 및 장기 생존을 개선했다 조합 약물 치료 (고 활성 항 레트로 바이러스 치료라는, 또는 HAART)되었다 환자의. 일반적으로 두 뉴 클레오 시드 역전사 효소 (RT) 억제제와 단백질 분해 효소 억제제 또는 비 뉴 클레오 시드 RT 억제제 중 하나의 조합을 사용 HAART는 이제 평생 조건 1-5으로 치명적인 질병을 전환했다. 그러나, 바이러스 복제의 지속적인 억제에 HAART의 많은 성공에도 불구하고, 그것은 한계가있다. HAART는 HIV를 근절하지 않기 때문에 환자는 경화되지 않고 치료 수명 길다. 약물의 독성 및 약물 내성 균주의 출현에 문제가 있습니다. 저항은 HIV 인테그라 (IN)을 대상으로 새로 승인 된 약물을 포함하여 승인 된 항 HIV 약물, 모두에게 발생할 수 있습니다. 약물 저항 가능성이 BECA를 발생바이러스 복제 (3 × 10-5 돌연변이 /베이스 / 복제주기의 오류율) 중에 발생하는 자연 돌연변이의 사용 6. 돌연변이는 항 레트로 바이러스 약물의 대상을 코딩하는 유전자에서 발생하는 경우, 이러한 돌연변이의 작은 하위 집합은 약물에 바이러스 균주의 감수성의 감소로 이어질 것입니다. 약제 내성의 발달을 방지하기 위해, 약물 농도가 완전히 HIV 복제를 억제하는 수준으로 유지되어야한다. 치료 처방에별로 준수 문제를 더욱 악화 및 저항 7-9의 급속한 발전으로 이어질 수 있습니다. 약물 농도 인해 서로 다른 흡수, 대사, 분포, 배설 수준에 환자에서 다를 수 있지만, 높은 약물 농도가 독성 (10)로 이어질 수 있습니다. 치료는 환자의 생명을 계속하기 때문에, 항 레트로 바이러스의 장기 독성에 대한 심각한 안전 문제가 있습니다. 일반적 HAART에 사용 항 레트로 바이러스는 악영향을 미칠 수차 부작용은 생명이 11-15을 위협 한 그런 일이 있었다. 환자는 저항 및 독성의 발전과 함께 발생 문제를 효과적으로 거의없는 장기 독성 바이러스의 일반적인 약물 내성 균주의 복제를 차단하는 새로운 약물을 개발해야 할 필요성을 기초. 따라서, 신속하게 바이러스 생활주기에서 필수적인 단계를 차단할 수있는 화합물에 대한 스크리닝 분석이 필요하다. 여기서 우리는 화합물 및 신속하고 효율적 WT 및 약물 내성 HIV 균주 모두의 복제를 차단하는 능력의 세포 독성을 평가하기 위해 사용될 수있는 효율적인 분석을 기술한다. 우리가 사용하는 분석은 환자의 16 ~ 18에서 분리 된 바이러스의 약제 내성에 대한 화면으로 개발 된 분석과 유사하다. 분석은 HIV 역전사를 차단할 수있는 화합물에 대한 화면 수정없이 사용할 수 있지만, 우리는 DESCR 것IBE 억제제에서 평가하는 분석을 사용하여. IN은 세포의 게놈 (19)에 바이러스 DNA를 삽입 필수적인 바이러스 성 효소이다. 억제제 유망의 숫자가 개발되고 있지만, 그 중 일부는 현재, ISENTRESS 20, 21 (도 Raltegravir 또는 RAL라고도 함) 임상 시험을 진행하고 최근에는 Elvitegravir은 (EVG) 22 Dolutegravir (DTG) 23했습니다 FDA에 의해 승인했다. 이들 화합물은 HIV B 세포 배양 비 B 아형 모두에 대해 환자 24, 25에서 활성화됩니다. 그러나, RAL 치료는 Y143R, N155H 및 G140S/Q148H 24, 26-31 등의 돌연변이에 약제 내성 HIV-1에 대한 선택합니다. N155H 및 G140S/Q1​​48H는 이러한 저항 돌연변이에 효과가 가닥 전달 억제제 (INSTIs)에서 두 번째 세대를 설계 및 개발의 필요성을 강조 EVG의 효과를 줄일 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite 발광 ATP 검출 분석 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus 고감도 발광 리포터 유전자 분석 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 Microwell White 폴리스티렌 플레이트</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA 필터 장치, 0.45 & 마이크로; M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl 세포</td><td>NIH AIDS 시약 프로그램</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&Delta; Env.LUC</td><td>NIH-NCI HIV 약물 내성 프로그램 - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI HIV 약물 내성 프로그램 - Hughes Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

hiv 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

항 HIV 약물의 숫자가 승인되어 있지만, 독성 및 약물 내성에 대한 문제는 여전히있다. 이것은 최소한의 독성을 가진 일반적인 약물 내성 HIV-1 균주에 의한 감염을 억제 할 수있는 새로운 화합물을 식별 할 필요를 보여준다. 여기에서 우리는 빠르게 세포 독성 및 WT 및 돌연변이 바이러스 균주에 대해 화합물의 효능을 결정하기 위해 사용될 수있는 효율적인 분석을 기술한다. 원하는 목표 세포주가 96 - 웰 플레이트에 접종하고, 24 시간 배양 후, 시험 될 화합물의 순차적 희석 물을 첨가한다. 더 이상의 조작은 세포 독성 시험 법에 대한 필요가 없습니다; 반대로 대한 HIV는 루시퍼 라제를 세포에 첨가되어 표현 WT 또는 약물 내성 HIV-1 벡터 중 하나의 소정의 양을 분석. 세포 독성은 ATP 의존적 발광 분석법 및 감염성에 대한 화합물의 영향을 이용하여 측정하고는 lucife의 양을 결정함으로써 측정된다존재 또는 추정되는 억제제의 부재에 칼자국을 내다. 이 심사 분석은 완료 4 일이 소요되고 여러 화합물은 병렬로 검사 할 수 있습니다. 화합물 3 중으로 스크리닝 및 데이터는 대상 화합물의 부재하에 감염성 / ATP 수준으로 정규화된다. 이 기술은 잠재적 항 HIV 화합물의 효능과 독성의 신속하고 정확한 측정을 제공한다.

분석 (도 1, 단계 1 및 2)가 성공적으로 수행 된 경우, 루시페라아제 값은 표 2에 제시된 데이터 유사해야 농도 범위에 걸쳐 스캔.; 잠재적으로 강력한 화합물을 왼쪽에서 오른쪽으로 루시퍼 라제 활성을 증가 계시하고, 제어는 높은 루시페라아제 활성을 가져야한다. 루시퍼 라제 활성이 농도 범위에 걸쳐 0.1 상대 루시페라아제 단위 (RLUs)을 초과하지 않는 경우에, 이는 일반적으로 화합물이 세포를 살해 것을 나타낸다. 루시퍼 데이터는보다 크거나 모든 일련의 희석에 걸쳐 2.0 RLUs 같으면 다음 화합물은 시험 된 농도에서 HIV-1 감염을 억제 할 수 없었다. 칼레이다 (표 3, 파트 A)에서 루시퍼 라제 활성의 억제 백분율 대 화합물의 농도를 플롯 팅, 선형 회귀 분석을 수행 한 후, t와 유사한 결과를 얻을<html> 표 3 부분 B.에 나타낸 호스 <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> HIV-1 바이러스 성 주식과 세포 독성 및 단일 라운드 감염성 시험 법의 설치 그림 1. 준비. 1 단계에서 293T 세포 pNL4.3ΔEnv.LUC 및 VSV-G로 형질하고 바이러스 34을 생산하기 위해 48 시간 동안 배양 . 이 감염의 분석에 사용될 때까지 바이러스는 (분량 씩 -80 ° C에서 냉동) 수확 및 저장됩니다. 2 단계의 경우, HOS 세포를 96 - 웰 플레이트에 시딩하고 24 시간 동안 배양 하였다. 세포는 그 다음 3 시간 동안 시험 될 화합물의 연속 희석 물과 함께 예비 인큐베이션 한 후 바이러스 (WT 또는 약물 내성 하나)로 감염된다. 48 시간 배양 한 후, 루시 페라 제 활성을 측정한다. le1.jpg &quot;폭 =&quot;300 &quot;/&gt; 표 1. 직렬 희석 프로토 타입을 상영 의약품. 더 엄격한 검사는 일반적으로 10 μM에서 시작 0.0005 μM에서 종료 11 시리얼 희석을 포함한다. 시리얼 희석은 10 배를 준비가되어 있습니다; 세포 100 μL 잘 각 바이러스의 100 μL)가있다. 이 볼륨이 계산 다음에, 직렬 희석은 전체 96 - 웰 플레이트의 3 행에 대해 충분합니다. 세포 독성 분석은 유사하게 제조된다; 그러나 11 시리얼 희석 250 μM에서 시작하여 0.05 μM에서 끝. 희석의 11 μL가 세포의 100 μl를 포함 접시에 우물에 추가됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; 표 2. 루시퍼 라제 신호 데이터 읽기 및 루시퍼 라제 활성의 억제 백분율의 결정. 데이터 테이블은 성공적인 화합물에 대한 루시페라아제 데이터의 전형적인 세트를 도시한다. 이 표는 루시퍼 라제 활성의 억제 백분율 및 CC (50)와 IC 50 값을 결정하는 데 필요한 추가 계산을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> 표 3. 선형 회귀 분석 데이터 테이블. 부품. 칼레이다에서 루시퍼 라제 활성의 억제 백분율 대 사용 농도 범위를 그래프로하면 적절한 억제 곡선을 생성 할 것이다. 파트 B는 억제 곡선은 세 파라 메트릭에 의해 정의 된S 자형 기능과 선형 회귀하여 데이터에 적합 (18)를 분석합니다. 이 데이터 테이블이 다음 50 %, 예를 들어 IC (50)와 CC (50)에 의해 바이러스 통합 및 세포 독성을 억제하는 데 필요한 약물 농도를 계산하기 위해 Microsoft Excel과 함께 사용된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 세포 독성을 설명하고 화합물의 신속하고 정확한 검사를 허용 한 라운드 감염의 분석은 세포 독성 (CC 50)을 결정하고, WT 및 약물 HIV-1 저항에 대한 IC 50 값.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

다음 실험의 전반적인 목적은 단일 라운드 감염 분석법을 통해 관심 화합물들을 스크리닝하여, 세포 독성 및 야생형 또는 약물 내성 HIV-1의 억제 능력을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 화합물에 노출시켜 흡수시킨 후, 처리된 세포를 루시페라아제를 발현하는 야생형 또는 약물 내성 HIV-1과 함께 배양함으로써 달성됩니다. 이후 바이러스의 루시페라아제 활성을 측정할 수 있습니다.최종적으로 루시퍼레이스 판독 신호를 사용하여 화합물에 의한 HIV-1 바이러스 벡터 복제의 억제 정도를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 약물 내성 HIV에 대해 더 나은 효능을 보이는 새로운 화합물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있어 치료적 함의를 갖습니다. 이러한 화합물은 HIV-1 환자의 항레트로바이러스 치료에 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 트랜스펙션 전날, 100 mm 디쉬에 293 세포를 1,500,000 cells 밀도로 분주합니다.다음 날, 인산칼슘법을 사용하여 16 µg의 야생형 또는 돌연변이 HIV와 4 µg의 VSV를 세포에 형질전환합니다. 약 6시간 후, 293 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 신선한 배지에서 48시간 동안 배양합니다. 2일 후, 100 mm 직경의 디쉬에서 S 함유 바이러스 상청액을 수집하고, 상온에서 1,620 ×g로 10분 동안 저속 원심분리하여 상청액을 정제합니다.다음으로, 상층액을 45 µm 공극 크기의 시린지 필터로 여과하고 바이러스 현탁액을 turbo DNase로 처리합니다. 실온에서 30분 후, 바이러스를 신선한 배지로 희석하여 -80 °C에서 보관합니다. 실험 전날 감염성 분석을 통한 화합물 스크리닝을 수행하기 위해, 96-웰 플레이트의 각 웰에 목적 세포 4,000개를 분주합니다.100 µL의 배지가 담긴 웰 플레이트에 세포를 분주하고 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 24시간 후, 스톡 솔루션으로부터 화합물을 새 배지에 단계별로 희석합니다. 최종 농도는 표에 기술된 실험적으로 결정된 농도 범위에 따라 선택합니다.다음으로, 화합물의 단계 희석액을 웰에 3반복으로 추가합니다. 최종 농도 부피의 1/10에 해당하는 적절한 희석도의 화합물을 세포와 함께 최소 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 희석된 바이러스 100 µL를 추가합니다.음성 대조군 웰을 확인합니다. 그런 다음 플레이트를 48시간 동안 더 배양합니다. 배양이 끝나면 200 µL 피펫 팁이 장착된 유리 피펫을 사용하여, 배양액의 상단부터 시작하여 웰의 바닥 모서리 방향으로 천천히 내려가며 배양액을 흡입하여 제거합니다.각 웰에 0.5 millimolar 염화 마그네슘이 첨가된 PBS 100 microliters를 즉시 첨가합니다. 그런 다음 루시퍼레이스 활성을 측정하기 위해, 제공된 동결 건조 시약의 각 바이알에 발광 리포터 유전자 분석 키트의 기질 버퍼 10 microliters를 첨가합니다. 이어서, 재구성된 시약 100 microliters를 각 웰에 첨가하고 상온에서 20분 동안 플레이트를 배양하여 신호가 발생하도록 합니다. 마지막으로, 마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 96 웰 플레이트를 판독합니다.성공적인 화합물 스크리닝 절차를 통해 얻은 루시퍼레이스 값들이 표에 제시되어 있습니다. 잠재적으로 강력한 화합물들은 루시퍼레이스 활성이 증가하는 양상을 보이며, 본 대표 Kaleido 이식편에서는 대조군이 가장 높은 신호를 나타낸다는 점에 유의하십시오. 화합물의 농도에 따른 루시퍼레이스 활성의 억제 백분율을 그래프로 도식화하여, 해당 화합물이 야생형 또는 약제 내성 HIV의 복제를 억제하는 데 효과적인지 판단하였습니다.이 절차를 수행할 때는 플레이트의 모든 웰에 세포와 바이러스를 균일한 양으로 정확하게 분주하고, 각 웰에 적절한 농도의 화합물을 넣었는지 확인하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.

RNA 바이러스의 넓은 스펙트럼 화학 억제를위한 높은 처리량 검사

항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

이 보고서는 급성 감염 세포의 세포질 추출물에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 사전 통합 복합체(PIC) 관련 통합 활성을 측정하기 위한 체외 분석에 대해 설명합니다. PIC 관련 HIV-1 DNA를 이종 표적 DNA에 통합하는 것은 중첩된 실시간 중합효소 연쇄 반응 전략을 사용하여 정량화됩니다.

측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

이 작품에서, 우리는 높은 처리량 선별 형식으로 Zika 바이러스 복제의 억제제를 선별하기 위하여 보충 기지를 둔 바이러스성 효소 기지를 둔 분석에서 이용된 프로토콜을 기술합니다.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

이 연구는 인실리코(in-silico ) 전략을 사용하여 Enumerated Etravirine이 HIV에 대한 유망한 치료제임을 확인했습니다. 분자 상호 작용 및 역학에 대한 우리의 발견은 가능한 HIV 치료 대안으로서 새로운 NNRTI의 합리적인 설계를 뒷받침합니다.

비뉴클레오티드 역전사효소 억제제의 정량적 구조-활성 관계, 활성 예측 및 분자 역학

학습하세요 루시퍼레이스 분석을 활용한 HIV-1 역전사 및 인테그라제 억제제의 빠른 선별 방법을. 약물 내성 바이러스에 대한 새로운 항레트로바이러스 치료제 개발에 활용할 수 있습니다.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

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