박층 크로마토 그래피 (T​​LC) 분판 및 식물 추출물의 생물학적 검정법은 항균 화합물을 확인하는

이 실험 절차의 전반적인 목표는 혐기성 박테리아에 대해 항균 활성을 가진 식물 대사산물을 식별하는 것입니다. 이는 먼저 박층 크로마토그래피(TLC)를 통해 식물 추출물을 분리함으로써 수행됩니다. 그다음, 크로마토그램을 하나 이상의 화합물이 포함된 구역으로 절단합니다.

그 다음 이 구역들을 혐기성 박테리아가 접종된 한천 배지에 올리고 배양합니다. 배양 후, 구역들을 제거하고 플레이트를 염색하여 박테리아 성장을 억제하는 화합물을 식별합니다. 결과 데이터는 항균 작용을 하는 식물 대사산물의 존재 여부를 나타냅니다.

이 방법은 특정 미생물의 영양소 이용에 식물 이차 대사산물이 미치는 영향과 같은 반추동물 영양학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 반추위 박테리아를 억제하는 식물 화합물을 밝혀내지만, 다른 박테리아나 곰팡이를 억제하는 화합물을 밝혀내는 데에도 적용할 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 레드 클로버의 페놀 화합물을 사용하여 접촉 생물학적 분석법(contact biography)을 통한 항균 화합물의 식별 방법을 시연합니다. 먼저 흄 후드 내에서 박층 크로마토그래피 또는 TLC 플레이트를 세척하는 것부터 시작하십시오. TLC 전개 챔버의 바닥면과 TLC 플레이트의 하단 가장이를 충분히 덮을 수 있을 만큼의 세척 용매를 준비하십시오.

챔버 내부를 설정한 후, 에틸 아세테이트와 메탄올을 2:1 비율로 혼합하여 준비합니다. 다음으로, 장갑을 착용하고 흄 후드 내에서 작업하십시오. 가위를 사용하여 알루미늄 또는 플라스틱 배면의 유연한 실리카 플레이트를 전개 챔버 크기에 맞게 자릅니다.

플레이트의 윗부분이 챔버 벽면에 기대도록 하여 챔버 안에 넣습니다. 이때 플레이트끼리 서로 닿지 않아야 합니다. 챔버의 뚜껑을 덮고 모세관 현상에 의해 용매가 플레이트를 따라 올라가게 합니다.

용매가 플레이트 상단에 도달하면, 챔버에서 플레이트를 꺼내 용매가 증발할 때까지 흄 후드 내에 세워 둡니다. 플레이트가 마르면, TLC 플레이트 상단 부근으로 불순물이 이동했는지 확인합니다. 불순물은 가시광선 아래에서는 노란색 띠로, 자외선 아래에서는 형광 띠로 나타납니다.

플레이트의 대부분에 여전히 노란색 색조가 남아 있다면, 동일한 용매를 사용하여 동일한 TLC 챔버에서 세척 과정을 반복하십시오. 챔버에서 TLC 플레이트를 꺼낸 후, 용매를 버리십시오. 프로토콜의 다음 단계를 위해 챔버를 사용하기 전, 잔류 용매가 완전히 증발하도록 하십시오.

다음으로 실리카 상에서 화합물의 이동에 영향을 줄 수 있는 잔류 수분을 제거하기 위해, 20 by 20 cm 플레이트의 경우 100 °C 건조기에서 10~15분 동안, 7 by 10 cm 플레이트의 경우 5분 동안 플레이트를 세워 둡니다. 플레이트가 건조되면 추출물을 로딩하기 전 상온까지 식힙니다. 추출물 분리를 위한 챔버를 준비하려면, 가위로 거름종이를 챔버 높이보다 약간 낮게, 너비는 챔버 둘레의 약 절반 정도로 자릅니다.

이 용지는 용매를 챔버 벽면을 따라 끌어올려 챔버 내부를 용매로 포화시키는 심지 역할을 하며, 이를 통해 분리의 재현성을 향상시킵니다. 흄 후드 내에서 용매를 혼합하십시오. 사용되는 용매는 에틸 아세테이트와 메탄올을 4:1 부피비로 혼합한 것입니다. 용매 혼합액을 챔버에 붓고 덮개를 덮으십시오.

연필을 사용하여 TLC 플레이트 상에서 전개 용매의 표면보다 높은 지점에 원점을 가볍게 표시합니다. TLC 플레이트의 흡착제가 부드러워 쉽게 손상될 수 있는 경우, 여기에서 보는 것과 같이 가장자리에 표시하십시오. 다음으로, 추출물을 충분한 양의 유기 용매에 녹여 탁한 현탁액이 아닌 농축된 용액으로 만듭니다.

여기에서 사용되는 용매는 메탄올입니다. 모세관 마이크로 피펫이나 마이크로리터 시린지를 사용하여 표준 물질과 시료를 좁은 밴드 형태로 로딩하며, 플레이트 양측면에 1cm의 여백을 남깁니다. 플레이트에 바람을 쐬거나 흄 후드 내에 넣어 밴드를 건조시키면 더 빠르게 건조할 수 있습니다. 밴드가 완전히 마르면, 동일한 지점에 시료를 다시 로딩하거나 오버스팟(over spot)합니다.

플레이트에 더 높은 농도의 시료가 필요한 경우, TLC 챔버에서 필요에 따라 이 과정을 반복하십시오. 심지 전체가 용매로 충분히 적셔졌는지 확인하십시오. 그다음 핀셋이나 집게를 사용하여 플레이트를 TLC 챔버 내부에 배치하십시오.

플레이트가 심지에 닿지 않아야 합니다. 챔버를 덮고 용매 전선이 플레이트 상단에 도달하기 전에 플레이트가 전개되도록 합니다. TLC 탱크에서 플레이트를 꺼내고 연필로 용매 전선의 높이를 표시합니다.

플레이트를 건조시킵니다. 흄후드 내에서, 일반적으로 닫아둔 상태로 하루 동안 사용 가능한 동일한 TLC 전개조를 사용하여 남은 TLC 플레이트들을 전개합니다. 전개조 내의 용매 양이 눈에 띄게 줄어들면, 플레이트가 건조된 후 용매 혼합물을 추가로 제조합니다.

가시광선 또는 UV 광원 아래에서 밴드를 시각화합니다. 특히 254 nm 단파장 UV와 365 nm 장파장 UV 화합물을 모두 검출할 수 있는 휴대용 UV 램프가 장착된 뷰잉 챔버를 사용하면 편리합니다. 연필을 사용하여 밴드의 위치를 표시하고, 상단 UV 및/또는 가시광선 조명이 설치된 겔 사진 기록 시스템을 사용하여 플레이지의 이미지를 얻습니다.

마지막으로, 밴드의 특성을 분석하기 위해 먼저 화합물이 이동한 거리를 측정하고, 그다음 용매가 이동한 거리를 측정하여 전자를 후자로 나누어 머무름 인자(retention factor) 또는 RF 값을 계산합니다. 밴드 위치를 표시한 후, 플레이트는 나중에 사용하기 위해 보관할 수 있습니다. 이후 바이오어세이(bioassay)에 사용하십시오.

플레이트를 플라스틱으로 감싼 후 호일로 덮습니다. 플레이트를 -20 °C에서 보관하십시오. 실리카는 중성이 아니므로, 최대 보관 시간은 화합물의 안정성에 따라 달라집니다.

일부 화합물은 TLC 플레이트 상에서 분해될 수 있습니다. 접촉 생물학적 분석(contact biography assay)을 준비하기 위해, 혐기성 조건에서 과잉 암모니아 생성균(hyper ammonia producing bacteria) 또는 HAB 배지를 준비하고 접종하십시오. 이 실험에서 사용된 배양균은 Clostridium sticklandii 균주 sr.입니다.

배양물을 39 °C에서 대수 성장기 또는 정지기로 성장시킵니다. 혐기성 미생물을 다룰 때는 멸균 혐기성 기술을 사용하십시오. 0.75% w/v로 준비합니다.

박테리아 배양에 사용된 것과 동일한 배지의 한천(agar) 온도가 60 °C 미만으로 낮아지면, 용융된 한천에 배양액을 1% v/v 비율로 접종하고 가볍게 섞습니다. 즉시 혐기성 챔버로 옮겨 15 x 100 mm 플라스틱 페트리 접시에 붓습니다. 가위로 TLC 플레이트에서 관심 밴드가 포함된 영역을 절단합니다.

네임펜을 사용하여 플레이트의 뒷면에 표시를 합니다. 대조군으로 사용되지 않은 TLC 스트립을 한서 플레이트에 놓습니다. 그런 다음 밴드 면이 아래로 향하게 하여 플레이트 위에 올립니다.

플레이트를 혐기성 챔버 내 배양기에서 39°C로 24시간 동안 배지 면이 아래로 향하게 하여 배양하십시오. 혐기성 챔버 내에서 핀셋을 사용하여 아가 플레이트로부터 TLC 밴드를 제거하십시오.

테트라 올레움 레드(tetra oleum red)를 한 방울씩 한천 배지 표면에 첨가합니다. 색이 나타날 때까지 최소 20분 동안 둡니다. 대조군 배지가 완전히 붉게 변하면, 혐기성 챔버에서 배지들을 꺼냅니다.

Clostridium stick Landi는 혐기성 박테리아이므로 혐기 챔버에서 꺼낸 직후부터 생존력이 떨어지기 시작하지만, 색상은 24시간 이상 안정적으로 유지됩니다. 디지털카메라를 사용하여 충분한 대비를 제공하는 배경에서 가시광선 하에 플레이트를 촬영하십시오. 살아있는 세포가 염색되면 밝은 붉은색이 관찰됩니다.

죽은 세포는 염색되지 않습니다. 페놀 화합물을 포함하는 레드 클로버 추출물의 대표적인 실리카 TLC 분리 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 에틸 아세테이트와 헥산의 9:1 혼합 용매로 8.5 cm 동안 전개한 결과, 5개의 밴드가 나타났으며, 그중 하나는 원점에서 완전히 분리되었습니다.

로딩된 표준 물질은 Formin Bio Canon A와 Genine이었습니다. 이 플레이트에서 네 개의 밴드를 Clostridium stick Landi(반추위의 고암모니아 생성 박테리아)가 배양된 배지에 24시간 동안 처리한 후, 여기에 설명된 대로 tetra oleum red로 염색하였습니다. 박테리아가 도말된 한천 배지에서 밴드 1 Bio Canon A 및 밴드 2 일부인 four Monon nein과 함께 배양한 결과, 명확한 억제대(zone of inhibition)가 형성되었습니다.

하지만 밴드 2의 나머지 부분과 밴드 3 및 4를 함께 배양했을 때는 세균 성장이 억제되지 않았습니다. 이러한 결과는 bio Canon A가 see stickland eye의 성장을 억제하지만, form aone Nein은 그렇지 않다는 것을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때, 해당 기법은 유연하게 조정 가능하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

적절한 배지를 선택하고, 본 절차를 따를 때 분리 화학 및 검출 방법이 호환되는지 확인하기 위한 대조군을 포함한다면 다른 시험 미생물을 사용할 수 있습니다. 생물학적 분석(bioassay)에서 확인된 항균 화합물의 특성을 규명하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법과 같은 다른 기술을 사용할 수 있습니다.