Name: 에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리 초파리 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 배우세요 Drosophila 조직에서 유전자 태그 핵의 친화성 기반 격리 방법을 통해 특정 세포 유형의 유전자 발현을 정밀 분석하고 후속 분자생물학 연구에 활용하는 기술을 익히세요.

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우리는 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 플라스미드를 제공하는 제니스 피셔 감사합니다. mAB24B10 항체는 NICHD의 후원하에 개발 된 발달 연구 브리 도마 은행에서 얻은 아이오와 대학 생물학과에 의해 유지되었다. REPO-GAL4 재고 (BL7415)는 인디애나 대학 블루밍턴 증권 센터로부터 얻은 것입니다. 암 연구를위한 퍼듀 대학 센터 미국 암 학회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (IRG # 58-006-53)의 지원은 기꺼이 인정합니다. Jingqun 엄마는 퍼듀 대학에서 식품 및 농업 퍼듀 조교의 농업 연구에 의해 지원됩니다.

1. EGFP의 생성 및 특성 :: KASH 초파리 <ol><li> 크로스 인 Gal4 드라이버는 MSP-300 KASH 날아 UAS-EGFP :: 운항하는 항공사. 대안 적으로, 인 Gal4 드라이버와 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 형질 전환 유전자를 모두 전송할 재조합 파리 표준 유전 기술을 이용하여 생성 될 수있다. 자손의 큰 숫자가 필요한 경우이 두 번째 방법은 유리하다. </li><li> 표준 현미경 기술을 사용하여 EGFP :: KASH 마커의 발현을 특징. 참고 : EGFP 발현 또는 전체 유충, 해부 고정 초파리 조직에서 표준 기술 현미경에 의해 관찰 될 수 있고, 항체의 사용을 필요로하지 않는다. <ol><li> EGFP의 발현 패턴을 결정 :: 형광 해부 현미경으로 전체 유기체의 KASH 마커 (재료의 PDF 참조). 참고 : 그림 1의 REPO-GAL4 드라이버, 전시 N 포함한 많은 인 Gal4 드라이버를예를 들면 침샘과 같은 다른 애벌레 조직에서 표현의 onspecific 패턴 (결과를 참조하십시오). </li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 관심의 해부 조직에서 EGFP :: KASH 발현 패턴을 분석합니다. <ol><li> EGFP의 현지화 :: DNA에 KASH 태그 상대를 시각화하기 위해 0.1 μg / ML의 최종 농도에서 DAPI를 사용하여 최종 4 %의 농도 및 얼룩의 DNA에 포름 알데히드를 사용하여 그 조직을 고정합니다. </li><li> 그 조직의 크기에 따라 40 배 / 1.30 오일 침지 목적 또는 20X / 825 기름 침지 목표, 하나를 사용하여 이미지를 획득. 다음 여기 / 발광 조건은 화상 획득을 위해 이용 될 수있다 : 408 nm/425-475 NM (DAPI), 488 ㎚ / 525-550 NM (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. 초파리 애벌레 조직에서 핵을 분리 <ol><li> 애벌레 조직의 절개 및 이후의 핵 분리를 위해 장비를 준비합니다. 그 주전체 dechorionated 배아는 또한 원하는 경우, 출발 물질로서 사용될 수있다. 그것은 관심의 세포 유형은 같은 가상적인 디스크와 같은 특정 조직에있는 경우가 아니라 전체 유충보다 부분적으로 해부 유충의 조직을 사용하는 것이 좋습니다. 이 비특이적 감소하고, 또한 비 표적 세포의 일부 인 Gal4 드라이버의 발현에 의해 발생 될 수있는 문제를 제거합니다. <ol><li> (자료 PDF 참조) 날카로운 집게의 두 쌍의 준비, 하나의 실리콘 처리 9 잘 유리판 (재료 PDF를 참조), PBT (1X PBS, pH를 7.4, 0.1 % 트윈 20). </li><li> 자석 구슬에 GFP 항체를 Prebind. 이 단계는 해부를 시작하기 전에 시작해야합니다. 세척 버퍼 400 μL에 (자료 PDF를 참조 로슈) 자석 구슬의 10 μL (인비 트 로젠은, 재료 PDF 참조) GFP 항체의 2 μg을 추가 (1X PBS, pH를 7.4, 2.5 mM의 MgCl2를) 1.5 ML 튜브에 . 필요한 경우 사용되는 비즈와 항체의 양은 샘에서 타겟의 양에 기초하여 최적화 될 수있다PLE 및 비드에 항체의 결합 친화도. </li><li> 상온에서 적어도 30 분 동안 회전 구슬과 항체를 품어. </li><li> 자기 랙에 구슬과 항체를 포함하는 1.5 ML 튜브를 (자료 PDF 참조) 놓고 구슬이 약 1 ~ 2 분 동안 자기에 바인딩 할 수 있습니다. 언 바운드 항체를 포함하는 상층 액을 제거하고 1 ㎖ 피펫을 사용하여 버퍼를 씻어. 비드를 자석에 인접한 측면에 1.5 ㎖의 튜브의 벽에 결합되어 유지된다. </li><li> 2.1.4 섹션에 설명 된대로마다 버퍼 세척 1 ㎖로 두 번 구슬을 씻어. 자기 랙에서 1.5 ML 튜브를 제거하고 구슬을 혼합하고 각 세척 단계에서 버퍼를 씻어 짧게 반전. </li><li> 단계 2.7 계속할 준비가 될 때까지 세척 버퍼 항체 결합 구슬을 저장합니다. 구슬은 프로토콜의 모든 단계에서 건조하도록 허용 할 수 없습니다. </li></ol></li><li> PBT의 유충의 조직을 해부하고 해부 조직을 전송9 잘 요리 잘 하나. 일반적으로, 100 번째 령 유충의 눈 엽과 눈, 상상 디스크의 해부는 핵 격리 다음 하류 유전자 발현 분석을위한 충분한 자료를 제공합니다. </li><li> 핵 추출 버퍼에 고립 된 조직을 씻어 (10 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.5, 2.5 mM의 MgCl2를 2, 10 밀리미터의 KCl) 1.5 ML 튜브에. 신선한 핵 추출 버퍼의 1 ㎖가 들어 얼음에 (자료 PDF 참조) 1 ㎖ 다운스 균질에 고립 된 유충의 조직을 전송합니다. 5 분 동안 얼음에 품어. 이 RNA는 핵 다음 분리 추출 할 경우 프로테아제 억제제를 추가 할 필요가 없다. </li><li> 느슨한 유봉 20 스트로크에 의해 조직을 방해하고 세포가 팽창 할 수 있도록 10 분 동안 얼음에 샘플을 품어. 꽉 유봉과 함께 15 선을 사용하여 세포에서 핵을 추출합니다. 느슨한 꽉 방앗 공이와 스트로크의 수는 다른 조직과 세포 유형에 최적화 될 필요가; 초과 균질화가 발생할 수 있습니다부족 균질화가 조직에서 모든 핵을 추출하는 것은 아니지만 핵 전단. </li><li> 핵 균질화 버퍼 prerinsed 된 40 μm의 기공 크기의 여과기 (재료 PDF 참조)을 통해, 핵 및 세포 파편을 포함하는 균질를 필터링합니다. 신선한 튜브에 여과 균질를 수집합니다. </li><li> 핵 수율, 핵의 무결성을 확인하고, 격리 핵 이전에 표적 유전자의 전사 수준을 결정하기 위해 후속 분석을 위해 사전에 격리 샘플을 수집합니다. <ol><li> 피펫을 사용하여 새로운 1.5 ML 튜브로 전송 필터링 된 균질의 50 μL. 이것은 사전에 격리 샘플입니다. 트리 졸 시약 500 μl를 추가 이후의 RNA 분리 (3.1 단계) -20 ° C에서, 혼합하는 반전 및 저장 (재료 PDF,주의 참조). </li><li> 새로운 1.5 ML 튜브로 전송 필터링 균질 20 ㎕. <ol><li> 0.1 μg / ML의 최종 농도에 DAPI를 추가하고, INC10 분 동안 얼음에 ubate 샘플. </li><li> 폴리 라이신 코팅 커버 슬립에 DAPI 염색 핵을 전송하고, 현미경 슬라이드에 배치합니다. 명확한 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 봉인. </li><li> 핵 무결성 및 형광 현미경을 사용하여 그 GFP - 태그 핵의 존재를 확인합니다. 참고 : 핵 문제를 해결하기 위해, 또는이 슬라이드는 (24 시간 이내) 준비 다음 합리적으로 신속하게 분석하는 경우 GFP에 얼룩 할 필요가 없습니다. </li></ol></li><li> 새로운 1.5 ML 튜브로 전송 필터링 된 균질의 10 μL 및 세척 버퍼 90 μL (1X PBS, pH를 7.4, 2.5 mM의 MgCl2를)를 추가합니다. 0.1 μg / ML의 최종 농도에 DAPI를 추가하고 10 분 동안 얼음에 품어. 10X 공기 목적에 따라 표면 형광을 사용하여 DAPI 양성 핵을 계산하는 혈구를 사용하여 사전에 격리 샘플의 핵 수익률을 결정합니다. </li></ol></li><li> 자기 랙에 (2.1.6 절에서 제조) 항체 바인딩 비드를 포함하는 1.5 ML 튜브를 놓고,및 2.1.4 장에 설명 된대로 자기 구슬이 적어도 2 분 동안 자석에 바인딩 할 수 있습니다. 1 ㎖ 피펫을 사용하여 항체 결합 구슬에서 세척 버퍼를 제거하고, 1 ㎖ 피펫을 사용하여 1.5 ML 튜브에 2.5 단계에서 필터링 된 균질를 추가합니다. </li><li> 부드럽게 섞어 튜브를 여러 번 반전, 최종 통해 엔드 교반과 함께 30 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 가능하면 이러한 핵의 응집을 초래할 수 있기 때문에 튜브에 거품을 피하십시오. </li><li> 자기 랙에 항체 결합 구슬과 균질를 포함하는 1.5 ML 튜브를 배치하고 2.1.4 섹션에 설명 된대로 자기 구슬이 적어도 2 분 동안 자석에 바인딩 할 수 있습니다. 1 ㎖ 피펫을 사용하여 언 바운드 핵 분획을 포함하는 균질를 제거합니다. </li><li> 세척의 배 1 ㎖를 할 때마다 버퍼 샘플을 씻으십시오. 설명 된대로 구슬, 바인딩 핵을 포함하는 1.5 ML 튜브를 제거하고 랙에서 버퍼를 씻어 여러 번 섞어 반전 후 자기 랙에 튜브를 배치단계 2.9 및 1 ㎖ 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 대상 핵에 결합해야한다 구슬로 세척 버퍼 150 μl를 추가합니다. 이 후 격리 샘플입니다. 현미경 분석과 이후의 RNA 추출을 위해 샘플을 준비합니다. <ol><li> 새로운 1.5 ML 튜브와 DAPI와 얼룩으로 환승 후 격리 샘플 20 ㎕ 및 2.6.2 절에 설명 된대로 분석 할 수 있습니다. GFP + / DAPI +와 GFP-/DAPI + 후 격리 샘플의 농축 GFP + 핵의 순도를 결정하는 자석 구슬에 의하여 촬영 된 핵을 계산합니다. </li><li> , 후 격리 샘플의 나머지 부분에 트리 졸 시약 1 ㎖를 추가 혼합하는 반전 및 저장 이후의 RNA 분리 (3.1 단계) -20 ° C에서. 참고 : 트리 졸의 샘플은 필요한 경우 -20 ℃에서 몇 주 동안 저장 될 수있다 그것은, 트리 졸 시약을 사용하여 이전의 RNA 추출에 자석 구슬에서 핵을 용출 할 필요가 없습니다 becaus전자 구슬은 이후의 RNA 분리에 방해가되지 않습니다. </li></ol></li></ol> 3. 애벌레 조직에서 고립 된 핵의 성적 수준을 결정 <ol><li> 다음과 같은 수정과 (재료 PDF 참조) 트리 졸 기반의 RNA 추출을위한 기술 표준 프로토콜을 사용하여 섹션 2.6.1과 2.11.2에서 제조 된 사전 차단 및 사후 격리 샘플에서 RNA를 분리 : <ol><li> RNA 펠렛의 침전 후, 펠릿에 RNase가없는 물 19.2 μL 및 RNASecure 시약의 0.8 μL (재료 PDF 참조) 추가 RNAses을 비활성화하는 20 분 동안 60 ° C에서 알을 품다. </li></ol></li><li> 제조 업체의 프로토콜을 다음 QubitR 2.0 형광을 사용하여 이러한 큐 비트 RNA 분석 키트와 같은 형광 RNA 결합 염료 (재료 PDF 참조) RNA의 농도를 결정합니다. </li><li> 그러한 EpiScr로 증폭 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성IPT는 제조업체의 지침에 따라 효소 키트 및 oligodT 프라이머 역. 참고 : 일반적으로 RNA의 50 ~ 100 NG가 여러 유전자 발현 분석을 수행 할 수있는 cDNA를 생성합니다. 사전 분리 및 포스트 분리 RNA의 당량은 cDNA를 생성하는데 사용되어야한다. </li><li> 이 10 배 전에 실시간으로 정량 PCR (qPCR에) 분석을 희석하기 위해 20 μL의 cDNA를 샘플로의 nuclease없는 물 180 μl를 추가합니다. 희석 된 cDNA 샘플 qPCR에 억제 할 수 있기 때문에 희석는 중요한 단계이다. </li><li> 중합 효소와의 dNTPs, 4 pmole의 앞으로의 각각의 qPCR 마스터 믹스를 준비하고 역방향 프라이머, 20 μL의 최종 반응 부피에 멸균 물과 함께했다. <ol><li> 관심의 세포 유형에서 발현 될 것으로 예상되는 유전자들을 대상으로 한 조직이 수집되는 발달 단계에서의 qPCR하도록 프라이머를 설계한다. 인트론에 걸쳐하는 디자인 프라이머 가능하면되도록 게놈과cDNA를 PCR 제품은 구별 될 수있다. 주 : 표적 세포 분류 유전자 발현 프로파일이 알려지지 않은 경우, 태그 핵 인구에서 구체적으로 표현되어야 EGFP 대하여 프라이머는 특정 세포 유형과 조직 (표 1)에 대한 프로토콜을 최적화 할 수있다. </li></ol></li><li> 전체 조직에서 준비하는 cDNA의 희석 시리즈에 비교하여 사전 차단 및 사후 격리 샘플에 대한 관심의 각 유전자의 상대적 성적 수준을 결정합니다. 표적 유전자의 전사 수준은 Rpl32 (또는 바람직하게는 몇 개의 표준 발현 유전자)와 같은 참고 유전자로 정규화한다. </li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 Drosophila의 배아 또는 애벌레 조직에서 혼합 된 세포 집단에서 특히 태그 핵을 분리 또는 매우 풍부하게하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 핵은 약 1 시간에 해부 조직으로부터 단리 할 수​​있다. 고립 된 핵의 순도와 수율은 실험적으로 각 세포 유형에 대해 결정해야합니다. 이 때문에 시료 내에 존재 구슬 혈구를 사용하여 프로토콜의 후 분리 단계에서 비드 바인딩 핵을 정량화하기 어렵다. 핵의 정확한 숫자는 다운 스트림 응용 프로그램에 필요한 경우 따라서, 이러한 DNA 함량 등의 다른 방법에 따라 핵 수익률을 추정 할 필요가있을 것입니다. RNA가 성공적으로 분리되고 정량화 될 수 있다면 핵 수율의 정확한 계산은 유전자 발현 분석을 위해 필요하지 않다. 우리가 발견 한 것처럼 그것은, RNA 수율을 정량화 형광 기반의 방법을 사용하는 것을 권장합니다 RNA 농도의 분광 결정이러한 낮은 농도의 샘플에서 매우 변수입니다. ...

이러한 중추 신경계로서 초파리 조직 세포 유형의 복합 혼합물을 포함한다. 따라서, 초파리 조직으로부터 세포 특정 유전자 발현 프로파일을 분석하는데, 이는 다운 스트림 애플리케이션을 활성화하기에 충분한 양으로 특정한 세포 균질 집단을 분리하는 제 필요하다. 손상 조직에서 세포를 분리하는 방법은 레이저 미세 절제하고, 전체 세포 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀 (가) 있습니다. FACS는 1-3 프로파일 유전자 발현과 크로 마틴에 초파리의 배아에서와 예쁜 꼬마 선충의 세포와 핵을 분리하는 데 사용되었지만, FACS 및 레이저 미세 절제는 매우 혼합 세포 유형 또는 해당 포함 세포를 포함하는 조직에서 성공적으로 수행하기가 어려울 수 있습니다 뉴런과 같은 불규칙한 형태. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 오히려 세포보다 핵은 특정 세포 유형에서 분리 및 후속 세대를 위해 사용될 수있다전자 발현 프로파일 링. 중요한 것은, 핵 RNA 샘플을 사용하여 마이크로 어레이 기반의 mRNA 발현 분석은 그 전체 RNA 4, 5를 이용하여 수행 일반적으로 대등 한 결과를 나타낸다. 더욱이, 핵 RNA를 이용한 유전자 발현 분석은 성공적 C. 등 여러 유기체에서 유전자 발현을 연구하기 위해 사용되었다 엘레, 애기 장대, 초파리, 인간 4, 5, 2, 3. 여러 가지 방법이 최근 유전자 발현 분석 및 / 또는 염색질 면역 침전에 적합한 초파리 조직으로부터 레이블 핵의 특정 집단의 분리를 위해 설명되었다. 면역 (비트 칩) 방법에 대한 조직 특정 염색질의 배치 격리 핵 지역화 GFP 2의 세포 유형 특정 표현에 기초하여 고정 핵을 분리하기 위해 FACS를 사용합니다. 이 접근법은 SU왔다ccessfully 초파리 배아 2 중배엽으로부터 고립 핵 염색질 면역 침전을 사용하여 히스톤 변형 및 전사 인자의 분포를 분석하기 위해 사용했다. 그러나, FACS 기반의 접근 방식으로 인해 다운 스트림 애플리케이션에 적합한 번호를 얻기 위해 필요한 증가 정렬 시간에 혼합 인구의 작은 비율을 구성하는 표시 핵을 분리 덜 적합 할 수있다. 이러한 한계를 극복하기 위해 여러 그룹은 특정 세포 유형의 특정 항원에 표시되어 핵을 정화하는 선호도 기반 격리 기술을 활용했다. 애기 장대 (6, 7)에 사용하기 위해 개발 된 특정 세포 유형 (를 본래) 방법에 태그 핵의 분리는 최근 초파리 8에 사용하기 위해 적응하고있다. 이 방법에서는, 생체에 대한 바이오 티 닐화 기질 인 핵 엔벨로프 융합 단백질이다 coexpres특정 세포 유형에서 대장균 비오틴 리가 피라와 SED. 비오틴 - 표지 된 핵이어서 스트렙 타비 딘 - 기반 선호도 분리를 이용하여 혼합 집단으로부터 정제 될 수있다. 이 방법을 사용하여, 핵이 성공적 핵막 융합 단백질 중배엽 특정 인핸서 8의 제어하에 발현되는 초파리 배아 중배엽으로부터 표지와 분리 하였다. 저자는 또한 인 Gal4 조절 서열, UAS (9)의 제어하에 임의의 세포 유형에서 발현 될 수 핵막 융합 단백질을 생성. 이 방법은 빠른 속도로 혼합 인구에서 레이블 핵의 하위 집합을 분리 할 수​​ 있지만, 별도의 세 가지 유전자 구조를 필요로하며, 따라서 특정 유전자 응용 프로그램에 적합하지 않은 경우가 있습니다. 최근 접근법은 SUN (S AD1 및 UN C-84) 핵막의 내막에 집중 도메인 - 함유 단백질이 태그로 된 설명되었다형광 단백질과 Gal4/UAS 시스템 (10)의 제어하에 표현. 핵은 핵막의 외막을 제거하는 비이 온성 세제의 존재 하에서 단리하고, 항-GFP 항체에 결합 된 자성 비드를 이용하여 친 화성 정제 하였다. 이 접근법은 성공적 초파리 (10)의 성인의 뇌 신경 세포 내의 특정 아형에서 표지 된 핵의 작은 집단을 분리하기 위해 사용되었다. 여기에, 초파리 유충의 조직에서 세포의 혼합 인구에서 레이블 핵의 분리를위한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 독립적으로 개발하지만, 헨리 등. 10 첫째로 기술 된 방법과 유사하고, 핵은 혼합 인구에서 태그 핵의 후속 분리를 용이하게하기 위해 만 초파리 melanogaster의 특정 세포 유형에 표현되는 형광 물질로 표지 된 선호도 기반의 접근 방식을 사용하여. 핵 레이블을하려면,KASH (K의 larsicht / NC-1 / S의 yne H는 omology) 도메인을 활용 하였다. KASH 도메인은 핵 주변 공간 (11) 내에서 SUN 도메인 함유 단백질과의 상호 작용을 통해 부분에있는 핵 봉투의 외부 막에 지역화 횡단 도메인입니다. 자신의 N-말단 도메인과 같은 세포질 12-14에서 액틴 세포 골격 또는 미세 소관과 같은 단백질과 상호 작용하는 동안 같은 초파리 MSP-300 및 Klarsicht 같은 단백질의 C-말단 도메인은 KASH, 아우터 핵막으로 이들 단백질을 고정. 구문이있는 초파리 MSP-300의 KASH 도메인이 pUAST-attB 벡터 15, 16 인 Gal4 조절 서열, UAS의 제어하에, EGFP의 C-말단에 융합 된 생성 된. phiC31 사이트 별 통합을 사용하여 형질 전환 초파리는 생성 된 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH의 유전자가 염색체에 attP2 궤적에 삽입 된에3L 17. UAS-EGFP :: MSP-300 KASH는 파리 관심의 세포 유형의 외부 핵 막에 EGFP의 대상 표현의 결과로, 특정 세포 유형의 인 Gal4 드라이버를 표현 파리 교차 할 수있다. 표지 된 핵은 자성 비드에 결합 GFP에 대한 항체를 사용하여 혼합 된 세포 집단으로부터 정제 될 수있다. 이 방법에서는, 비이 온성 세제의 사용은 EGFP 태그가 외측 핵막의 세포질 측에 지역화 때문에 필요하며, 따라서 항체가 액세스되지 않는다. 후술 프로토콜은 순도와 절연 핵의 수율 정량화, 초파리 애벌레 조직의 특정 세포 유형에서 EGFP-표지 핵 농축 / 분리, 및 (정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 적합한 핵 RNA를 추출하기 위해 사용될 수있다 QRT -PCR) 유전자 발현 분석. 핵의 분리 및 친 화성 정제 (Tissu은 제외E 해부)는 한 시간 이내에 수행 될 수있다. 결과는 신경교 핵 성공적 유생 광섬유 엽과 눈 가상적인 디스크로부터 단리하고, 이후의 유전자 발현 분석을 위해 사용될 수 있음을 나타내는 표시된다. 이것은이 방법은 대상 세포가 전체 인구의 5 % 미만을 구성하는 배아와 유충 조직으로부터 레이블 핵의 분리 / 농축하는 데 유용 할 것으로 예상된다. 이 연구에서 생성 된 모든 초파리 주식과 플라스미드는 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>항-chaoptin 항체 (mouse, monoclonal)</td><td>Developmental studies Hybridoma Bank</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체 (mouse, monoclonal)</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>이 프로토콜에는 이 특이적 항체를 권장합니다. 그러나, 대체 항체도 사용될 수 있다.</td></tr><tr><td>ROX</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드 염)</td><td>비오튬</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 균질화기 (1 ml)</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋, 11 cm</td> 면역침전 <td></td><td></td> 을 위한 World Precision Instruments 14095 <td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>이 특정 브랜드의 마그네틱 비드는 이 프로토콜에 권장됩니다.</td></tr><tr><td>EpiScript 역전사효소</td><td>진원지</td><td>ERT12910K</td><td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td></tr><tr><td>Falcon 세포 여과기, 40 &mu; m 기공 크기</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>표적 세포핵의 크기에 따라 다른 기공 크기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마그네틱 스탠드 (8 x 1.5 ml 튜브)</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>미니 튜브 로테이터</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 스타터 키트</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>RNA 수율을 정량화하기 위한 유사한 형광 기반 방법을 사용할 수 있습니다. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td></tr><tr><td>RNAsecure (Ambion)</td><td>생명 과학</td> <td>기술AM7010</td><td>RNAs를 비활성화하기 위해 이 시약을 사용하는 것은 선택 사항입니다.</td></tr><tr><td>RT-PCR 기계 Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>실리콘화 9웰 유리판</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경 형광 어댑터(로얄 블루(440-460nm) 여기 + 노란색 장벽</td><td>Nightsea</td><td></td><td>이 어댑터를 사용하면 일반적인 해부 현미경(예: Nikon)을 사용하여 GFP 형광을 검사할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>StereoZoom 현미경 83604 10X 광시야 접안렌즈 및 범용 붐 스탠드 세트</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td>, <td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 시약</td><td>, Life Technologies</td><td>15596018</td><td>주의; 대안적인 RNA 추출 방법을 사용할 수 있습니다. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

초파리의 melanogaster 배아와 유충 조직은 종종 이들 조직에서의 유전자 발현 분석을 복잡하게 세포 유형의 고도로 이종 혼합물을 함유한다. 따라서, 초파리 조직으로부터 세포 특정 유전자 발현 프로파일을 분석하는, 높은 순도와 같은 전사 프로파일 링 및 염색질 면역 하류 어플리케이션에 충분한 수율에서 특정 세포 유형을 분리 할 필요가있다. 그러나 이러한 조직의 특정 세포 유형의 희귀 인구와 결합 등의 중추 신경계와 같은 조직의 불규칙한 세포의 형태는, 정렬, 레이저 미세 절제와 형광 활성화 된 세포로 세포 분리의 전통적인 방법에 대해 (FACS)에 도전을 제기 할 수 있습니다 . 여기서, 태그 핵의 궁합 기반 격리보다는 전체 세포를 사용하여 셀 고유의 유전자 발현 프로파일을 특징 화하는 대안 적 접근법이 설명된다. 특정 C의 핵관심 엘 유형은 유전 Gal4/UAS 진 발현 시스템을 이용하여 핵 봉투 지역화 EGFP 태그로 표시되어 있습니다. 이 EGFP-태그 된 핵은 자성 비드에 결합된다 GFP에 대한 항체를 사용하여 단리 할 수​​있다. 이 프로토콜에서 설명하는 방법은 이러한 세포 유형에서 전체 세포 집단의 2 % 미만을 포함하는 경우에도, 고순도 초파리 유충의 중추 신경계와 발현 분석을위한 충분한 수준에서 특정 세포 유형의 핵의 일관된 분리를 가능하게 조직. 이 접근법은 초파리 배아 특정 인 Gal4 드라이버를 사용 유생 세포 유형의 다양한 핵을 분리하기 위해 사용될 수 있으며, FACS 또는 레이저 미세 절제를 위해 적당하지 않은 종류의 세포에서 핵을 분리하는 데 유용 할 수있다.

REPO-GAL4 드라이버 (블루밍턴 재고 번호 7415)가 특별히 개발 (18)의 여러 단계에서 초파리 신경계에있는 신경 교세포로 표현된다. 파리 안정적으로 표준 유전자 기술을 사용하여 REPO-GAL4 드라이버의 제어하에 UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 표현이 생성되었다. EGFP의 발현 패턴 :: KASH의 형질 전환이 파리에서의 특성을, 제 령 유충의 해부 눈 엽과 눈, 상상 디스크에서 GFP 발현의 패턴은 공 초점 현미경을 사용하여 조사 하였다. 해부 조직은 광 수용체의 축색 돌기 (mAb24B10 레이블을 DNA와 α-chaoptin (19)를 표시하는 DAPI와 대조했다 ) 자료 PDF를 참조하십시오. 그림 1A는 REPO-GAL4 기반 EGFP가 :: KASH의 유전자가 예상되는 표현 패턴의 광 엽 ...

초파리의 조직은 종종 세포 유형의 이종 혼합물을 포함한다. 특정 조직으로부터 특정 세포 유형에서의 유전자 발현을 조사하기 위해, 핵 유전자 태그이어서 궁합 기반 접근 방식을 사용하여 단리 할 수​​있다. 격리 핵은 유전자 발현 분석 및 면역 침전과 같은 염색질 하류 애플리케이션에 사용될 수있다.

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila melanogaster의 testes 신속하게하고 효율적으로 해부 바늘을 사용하여 성인 남성에서 격리 수 있습니다. 연습, 하나는 쉽게 하나 또는 두 일 이내에 항체 또는 효소 기반 assays 높은 처리량 시퀀싱 이상의 전통적인 분자 생물학의 방법으로 DNA 또는 RNA의 분석 또는 단백질의 충분한 testes의 양을 분리 수 있습니다.

의 분리 Drosophila melanogaster Testes

여기 우리는 전체 마운트 형광을...

전체 마운트 RNA 형광<em&gt; 현장에서</em의&gt; 하이브리드<em&gt; Drosophila</em&gt; 태아

이 책의 목적은 시각화 및 초파리에서 추출한 RNA에 향상된 북부 얼룩 프로토콜의 동작 단계를 논의 배아, 세포 및 조직을 melanogaster하는 것입니다. 이 프로토콜은 작은 RNA 종의 효율적인 검출에 특히 유용하다.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된 초파리 Melanogaster

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

이 프로토콜은 드로소필라 폴리텐 세포에서 이종로크로마틴 골재를 시각화하는 것을 목표로 한다.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)은 확장 현미경 검사와 FISH(Fluorescence in situ hybridization)를 결합하여 두꺼운 조직에서 여러 유전자의 발현을 검출하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 이 방법의 최근 발전과 온전한 초파리 중추 신경계를 라벨링하기 위한 적응을 간략하게 설명합니다.

Expansion-Assisted Iterescence In Situ Hybridization을 사용한 온전한 초파리 뇌의 유전자 발현의 다중 검출

이 프로토콜은 Drosophila melanogaster의 X 또는 Y 염색체 리보솜 DNA 자리에서 유래한 리보솜 RNA 전사체를 구별하기 위해 단일 뉴클레오티드 다형성에 민감한 제자리 형광 혼성화(SNP-FISH) 방법을 설명합니다.

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH: Drosophila melanogaster에서 유전자좌 특이적 리보솜 RNA 전사 검출

이 프로토콜은 초파리 흑개척 유충 시립엽에서 하이브리드화 연쇄 반응 형광 제자리 하이브리다이제이션(HCR-FISH)을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 탐침 설계, 하이브리다이제이션, 증폭, 조직 장착 절차가 상세히 설명되어 발달 중인 시엽의 시각화를 용이하게 합니다.

발달 중인 초파리 시엽에서의 잡종화 연쇄 반응 FISH

배우세요 Drosophila 조직에서 유전자 태그 핵의 친화성 기반 격리 방법을 통해 특정 세포 유형의 유전자 발현을 정밀 분석하고 후속 분자생물학 연구에 활용하는 기술을 익히세요.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리

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