Name: 저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 학습하세요 저산소증 조건에서 단일 세포 수준의 신생 RNA 합성을 형광 표지하고 정량 분석하는 방법을. 클릭 화학 반응과 형광 현미경을 활용하여 세포 반응의 이질성을 시각화합니다.

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JB는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 박사 과정 학생, SR 연구소는 CRUK 수석 연구 활동 (C99667/A12918)에 의해 투자되는 바와 같이, CRUK 임상 동료입니다. 이 작품은 두 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 전략 포상 (097945/B/11/Z 및 095931/Z/11/Z)에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 및 치료 <ol><li> 문화 인간 골육종 (U2OS) 세포에 표 1에 열거 된 시약 및 장비를 수집합니다. 모든 시약을 제조하고 무균 수 있도록 층류 공기 유동 후드에서 모든 조직 배양 기술을 실시 </li><li> 다음과 같이 문화 매체를 준비 : 10 % (FCS)의 최종 농도를 달성하기 위해 DMEM에 50 ㎖의 FCS, 5 ㎖의 L-글루타민 및 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가, 2 개 mm (L-글루타민), 50 U / ㎖ ( 페니실린) 50 U / ㎖ (스트렙토 마이신). 물을 욕조에 37 ° C에서 배양 배지를 따뜻하게. </li><li> 치료를위한 세포를 준비 <ol><li> 70 % 에탄올에 몇 가지의 coverslips를 소독, 6 개의 3.5 cm 플레이트의 하단에 하나를 공기 건조하고 배치 할 수 있습니다. </li><li> 2 ㎖의 커버 슬립들이 우물의 바닥에 부착하게 유지하려면 커버 슬립 집게로 아래로 눌러, 전체 DMEM (37 ° C)를 따뜻하게 담가. </li><li> 자신의 조직 숭배에서 U2OS 세포를 분리4 ML을 적용, 3 ㎖의 PBS로 한번 세척하여 우레 판은 0.05 % 트립신-EDTA (1 %)을 따뜻하게하고 7 분 동안 37 ° C에서 배양. </li><li> 6 ㎖에 재현 탁 세포는 트립신-EDTA를 불 활성화 및 혈구를 사용하여 계산하는 완전한 DMEM을 따뜻하게. </li><li> 1.3.1 점에서 제조 된 3.5 cm 플레이트의 각 플레이트 2 × 10 5 세포. 부드럽게도 셀 분포를 확인하기 위해 판 바위. 세포가 치료 전에 하룻밤을 준수 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 저산소증의 워크 스테이션에 4 개의 3.5 cm 플레이트를 배치하여 세포를 치료하고 정상 산소 조건에서 37 ° C에서 인큐베이터에있는 다른 2 개의 3.5 cm 판을 둡니다. 저산소증의 치료가 끝나기 전에 (저산소증 처리 된 세포의 저산소 챔버에서) 처리 조건에서 RNA 라벨링 분석 1 시간을 개시 할 준비가. </li><li> 1 시간 15 분, 1 시간 30 분, 2 시간, 24 시간 동안 저산소 세포를 노출합니다. 이 시점은 유연하고 사용자가 결정됩니다. </li><li> normo를 사용양성 대조군과 음성 대조군으로 4 시간 동안 티노 마이신 D (10 ㎍ / ㎖의 최종 농도)로 처리 정상 산소 3.5 cm 플레이트로 XIC 3.5 cm 플레이트. 악 티노 마이신 D 글로벌 RNA 합성의 억제입니다. </li></ol> 주의 사항 : 훽스트 33342 알려진 돌연변이입니다. DMSO는 조직으로 유기 분자의 진입을 용이하게하는 것으로 알려져있다. 수산화 나트륨은 부식성이. 염산은 부식성이. 파라 포름 알데히드는 모든 동물에 매우 독성과 인간의 죽음의 원인이 될 수 있습니다. 트리톤 (Triton) X-100은 직접 접촉 다음의 경우 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 악 티노 마이신 D 때 피부 나 섭취와 접촉 독성이다. 모든 유해 화학 물질을 취급 할 때 적절한주의하십시오. 2. 클릭 - IT 분석보기 <ol><li> - 7.6, PBS 3.7 % 파라 포름 알데히드 (PFA), 1 % 트리톤 X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) pH를 7.2 : 클릭 - IT 분석 키트 외에 필요한 다음과 같은 시약을 수집PBS에서 -100, 탈 이온수 DH (2 O), 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 10 M 수산화 나트륨 (NaOH) 및 37 %의 염산 (HCL); 옵션 - 산도 표시기 스트립. </li><li> 다음과 같이 클릭-IT 반응을 수행하기 전에 신선한 PFA 주식 솔루션을 준비 : <ol><li> 1.85 g PFA, 50 ML 팔콘 튜브에 3.5 ㎖의 dH보다 2 O 및 M NaOH를 of10 10 μl를 넣어. 물 목욕을하고 흄 후드에서이 서 전자 레인지에 큰 비커에 H 2 O 400 ㎖ - 300 끓인다. </li><li> 물을 욕조에 50 ㎖의 송골매를 놓고 부드럽게 PFA가 용해 될 때까지 주기적으로 뚜껑을 발표, 10 분 동안 교반한다. </li><li> 37 % 용액의 결과로, 또 다른 50 ㎖의 팔콘 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 PFA 용액을 주사기. </li><li> PBS를 추가하여 10 배 희석하고 진한 염산 12 μL에 대한 추가하여 6.8으로 산도를 가져옵니다. 옵션 : 흄 후드의 표시 스트립 정확한 산도를 확인합니다. </li><li> 즉시 사용 또는 o 저장vernight에서 4 ° C. </li></ol></li><li> 다음과 같이 RNA 이미징 키트의 주식 솔루션을 준비 : <ol><li> 유럽 ​​연합 (EU)의 100 mm의 원액의 결과 구성 요소에 373 ㎕의 Dh를 2 O를 추가합니다. 최대 1 개월 -20 ° C에서 보관. </li><li> 구성 요소 B (알렉사 플 루어 594)에 DMSO의 85 μl를 추가하고 피펫 또는 소용돌이로 교반하여 혼합한다. 최대 1 년 -20 ° C에 모두 저장합니다. </li><li> RNA 이미징 키트 반응 버퍼 첨가제의 10X 솔루션을 만들 구성 요소 E에 2 ㎖ dH보다 2 O를 추가합니다. 솔루션은 브라운 색상을 개발하는 경우 최대 1 년 -20 ° C에서 보관은 버린다. </li></ol></li><li> 유럽 ​​연합 (EU)과 세포의 레이블 : 데워진 완전 배지 (37 ° C)에서 2.3 단계에서 제조 된 100 밀리미터 재고 EU의 2 배 작업 솔루션을 준비합니다이 단계의 나머지 부분을 수행하고 저산소증으로 처리 된 세포의 저산소 챔버에서 2.5 단계. . 미디어 CONT이 2X 작업 용액의 동량을 첨가하여 1X로 희석세포를 aining. 치료 세포 배양 조건에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 셀 고정 : 잘 PBS로 한번 각을 씻고 처리 조건에 따라 위의 단계 2.2에서 제조 된 3.7 % PFA 주식의 1 ML을 추가합니다. 처리 조건에서 15 분 동안 배양한다. 저산소증 처리 샘플은이 지점에서 저산소증 챔버로부터 제거 될 수있다. 정착액을 제거하고 PBS 잘 한 번씩 세척 (책임 낭비 PFA 처분주의). 실온에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> Permeabilization : 세척 용액을 제거하고 각 웰에 PBS에 1 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 PBS 잘 한 번씩 씻는다. </li><li> 레이블 RNA 검출 : <ol><li> dH보다 2 O.에서 10X 솔루션 (단계 2.3에서 준비) 1:10 희석하여 RNA 이미징 키트 반응 버퍼 첨가제의 신선한 1X 작업 솔루션을 준비합니다 </li><li> RNA 이미징 키트를 준비바로 준비 후 사용 표 2에 따라 반응 칵테일. </li><li> 세척 용액을 제거하고 각 샘플에 RNA 이미징 키트 반응 칵테일 500 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 배양한다 빛으로부터 보호한다. </li><li> RNA 이미징 키트 반응 칵테일을 제거하고 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼 (구성 요소 F) 1 ㎖로 한 번 세척 한 후 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼를 제거합니다. </li></ol></li><li> 선택 다중 반응 : 제조업체의 권장 사항에 따라이 시점에서 샘플을 추가로 항체 라벨을 수행합니다. </li><li> DNA 염색 : PBS로 세척 샘플 후 세척 용액을 제거. PBS의 훽스트 33342 (구성 요소 G) 1:1,000 희석. 각 웰에 희석 훽스트 33342의 1 mL를 넣고 실온에서 15 분 동안 품어, 빛으로부터 보호합니다. 훽스트 33342 솔루션을 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세척 solutio를 제거n 및 광학 현미경으로 진행합니다. </li></ol> 3. 광학 현미경 <ol><li> 마운트 Coverslips는 : <ol><li> 표준 현미경 슬라이드의 중앙에 장착 매체의 10 μl를 놓습니다. </li><li> 설치 매체의 분취 량을 충당하기 위해 아래 현미경 슬라이드의 중심에 셀 측에 커버 슬립을 놓습니다. 이것은 이후의 화상 획득을 모호하게되므로 장착 매체에 거품의 발생을 피하기 위해 조심. </li><li> 그 주변에 분명 손톱 광택을 적용하여 현미경 슬라이드에 coverslip에 스틱. 실온에서 5 분 동안 건조 할 수 있습니다. 빛으로부터 보호합니다. 샘플은 다음과 같은 설치 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 이미지 수집 : 형광 검출 가능한 광 시야 현미경을 사용하여 이미지를 획득. DNA에 결합 알렉사 형석 염료 및 훽스트 33342에 대한 대략적인 형광 / 여진 발광 최대를 표 3에 나타낸다. </li><li> Perfor냉각 CCD 카메라로 40X/1.30 NA 기름 침지 렌즈와 이미지를 캡처를 사용하여 M 이미징. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 화상 처리 소프트웨어 (재질 표 참조) 전에 OMERO 클라이언트에 오기까지를 사용 Deconvolve 이미지. 모든 다른 조건으로 제어 정상 산소 세포로부터 렌더링 설정을 적용하여 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어에서 동일한 실험에서 모든 이미지의 설정을 렌더링 정상화. </li><li> 각 이미지에서 핵을 선택 현미경 이미지의 시각화 및 분석 소프트웨어의 관심 영역 (ROI) 도구 (재료 표 참조)를 사용합니다. 각 ROI에 대한 평균 농도를 구하여 30-50 세포 사이 번호 등, 강도 분석 옵션을 선택하여 각 조건에 대해 평균 및 표준 편차를 산출한다. </li><li> 4.2 단계 t에서 얻은 모든 개인의 평균 강도 값을 플로팅하여 데이터 그래프 소프트웨어 (재료 표 참조)을 사용하여 분산 형 플롯을 구축O 각 조건에서 세포 사이의 다양성을 반영합니다. 또는 평균 평균 강도 플러스 초기 RNA의 표준 편차를 나타내는 막대 그래프를 구성합니다. </li></ol>

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</ol>

JRS는 글렌 코 소프트웨어, 주식, OMERO에 기여하는 오픈 소스 미국에 기반을 둔 광고 회사의 설립자입니다.

우리는 골육종 (U2OS) 세포의 RNA 합성에 저산소증의 영향을 검토하는 RNA 이미징 장비의 우리의 사용을 설명했다. 이 기술은 비교적 간단하고 단일 세포 수준에서 해외 전사에 대한 데이터를 제공한다. 우리는 저산소 챔버에서 라벨을 통합하는이 키트에 대한 기존의 프로토콜을 수정했습니다. 우리의 지식이 저산소증의 RNA 합성의 변화를 측정 할 수있는이 기술의 사용의 첫 번째 보고서입니다. 이 방사성 동위 원소를 필요로하지 않고 통제 된 분위기의 워크 스테이션에서 작업의 한계를 기술적으로 호환이기 때문에 우리가 사용하는 RNA 이미징 키트는 저산소증의 실험에 적합하다. 이 기술에 관심 효율적으로 고정하고 샘플의 라벨 일반적인 문제. 그것은 PFA는 샘플이 신선하고 샘플의 낮은 배경 염색을 보장하기 위해 설명 된대로 &#39;클릭&#39;반응에 따라 세척 단계를 수행하는 고정하는 것이 매우 중요합니다. B의 경우ackground 형광이 단계 2.7.4 후 1 ㎖의 RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼로 한번 더 세척하는 것이 좋습니다 문제가된다. 여기에 언급 된 RNA 이미징 키트는 사용과 반응의 특이성과 속도의 용이성 측면에서 RNA 이미징 기술에 상당한 진보를 나타냅니다. 이 기술은 주로이 샘플 레이블을하는 데 걸리는 시간에 의해 제한됩니다. RNA 이미징 키트는 일반적으로이 기간 내에 발생할 수있는 글로벌 RNA의 급격한 변화의 시험을 방지하는 1 시간의 표시 기간이 필요합니다. 이러한 이유로 우리의 처음 지점을 1 시간 15 분으로 제한됩니다 때문이다. 이 기술은 주로 예를 들어,이 RNA 이미징 키트 phalloidin도 염색와 호환되지 않습니다, 다른 형광 마커와의 호환성을 시약에 관해서 몇 가지 다른 제한과 관련이 있습니다. 세포의 RNA 합성을 공부하는 모든 기존의 접근 방법으로 변형 된 뉴 클레오 시드의 결합을 기반으로초기 RNA와 다른 방법으로 통합 라벨의 검출. 선구적인 접근 방식은 오토 라디오와 검색 다음에 방사성 표지 된 RNA 전구체를 사용하여 기반으로했다. 이 방법은 세포주기의 단계 및 다른 중요한 발견 발견되었다; 그러나, 이러한 방사능 작업, 긴 노출 시간과 오토 라디오 6의 낮은 해상도의 이미지의 성가신 성격 등 많은 단점이있다. 필드 다음 사전 방사능의 필요성을 제거하기 위해 면역 화학 수단 악용. RNA는 면역 화학 감지 다음 BRU의 결합에 의해 표시되었다. 그러나, 효율적인 항체는 DNA 또는 세포 형태의 손실을 야기하고 형광 표지 된 항체 (13)와 자신의 추가 검출을 방지, 많은 단백질의 에피토프를 손상 RNA에 접근을 개선하기 위해 핵산 변성 요구 바인딩. &#39;클릭 화학의 기술의 도입은 검출 단계와 t을 단순화그 절차 오토 라디오 및 면역 화학에 비해. 이 기술은 5 ethyniluridine 단자 알킨은 구리 (I)의 존재 형광가 결합 아 지드와 결합 지드 - 알킨 Huisgen의 고리 화 반응을 기반으로합니다. 반응은 신속하고 특정 추가 단계를 필요로하지 않으며, 다른 세포 성분의 면역 검출와 쉽게 호환됩니다. 이 RNA 이미징 기술을 사용하여, 우리는 세포가 동일한 단층 인구에서 저산소증에 반응하여 상이한 RNA 합성 수준을 가지고 있음을 보여 주었다. 우리는 RNA 생산 만의 효과를 조사하기 위해 실험을 제한; 그러나, RNA 생산의 더 복잡한 분석을 허용 변경됨 추가적인 다중 반응을 수행하기 위해이 RNA 촬상 키트 전적으로 가능하다. 예를 들어, 인산화 된 RNA 중합 효소 II 또는 그 번역의도 구성 요소 수준의 활성 전사의 마커에 대한 특정 항체를 사용하여 보조 염색단백질로 변환되고, 새로 생성 된 RNA의 양의 표시를 제공하기 위해 기 기계들이 가능하다. 같은 굴지, 저산소증으로 크게 변경하지 않아야 단백질 등의 추가 단백질은 추가 컨트롤로 테스트 할 수 있습니다. 그것은 서로 다른 세포가 다른 RNA 합성 속도와 저산소증도 다른 반응이있을 것이다 가능성이 매우 높다 더욱이, 다른 세포 유형, 테스트 할 수 있습니다. 이 RNA 촬상 키트의 사용은 설명 된 단계들이 수행된다 제공 상당히 간단하다. 프로토콜의 중요한 단계는 세포 도금, 세포 고정과 염색 및 이미지 수집을 포함한다. 그것은 현저 결과에 영향을 미칠 것이다 실험에서 위로 또는 아래 합류 방지하는 바와 밀도로 세포를 플레이트에 중요하다. 그것은 촬영 셀의 가장 &#39;스냅 샷&#39;을 보장, 신선한 정착액을 사용하고 혈중 알코올 농도를 줄이기 위해 염색 한 후 세포를 세척 할 때 조심하는 것이 중요하다효율적인 분석을 위해 허용되는 수준으로 kground. 마지막으로, 이미지 수집의 방법은 이후의 분석을 위해 충분히 좋은 품질의 이미지를 달성하기 위해 매우 중요합니다. 우리는 광학 등 전 세계적으로 가장 연구 집약적 센터에서 사용할 수 있습니다이 프로토콜에 사용되는 현미경으로 샘플을 검사하는 데 사용할 수있는 최고의 광학 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.

저산소증 (낮은 산소 긴장은) 조직에 정상적인 산소 공급이 방해 될 때 발생합니다. 환경 산소는 많은 세포 유형에 대한 중요한 단서를 제공하고, 영양 및 신호 분자 모두입니다. 환경 산소의 변화는 저산소증 유도 성 요인 (HIFs)로 알려진 필수적인 전사 인자 가족의 활동을 제어 dioxygenases의 그룹에 의해 감지된다. HIFs는 두 개의 서브 유닛, α와 β로 구성된다. 세 알려진 HIF-α의 이소 형 (1, 2, 3)과 HIF-1β의 여러 스플 라이스 변종이 있습니다. HIF-1β는 구성 적 표현과 환경 산소 수준 1에 의해 규제되지 않습니다. HIF-α의 가족 구성원은 동적 프 롤릴-hydroxylases (박사 학위)의 클래스에 의해 규제 요인은 HIF (FIH)를 억제하는; HIF-α 2,3의 수산화을 촉진하기 위해 공동 요인으로 산소를 필요로 둘. 정상 산소 상태에서 HIF-α 가족은 수산화하고 proteosom에 대한 태그E3-리가, 폰 Hippel 린다 우 (VHL) 앨라배마 저하. 저산소증에서 박사 학위 및 FIH는 비활성 또는 감소 활동을해야합니다. HIF-α 아형 안정화 될 HIF-1β와 헤테로 다이머를 형성하고, 저산소 환경 (도 1a)에 대한 세포 반응을 제공하는 유전자의 전사에 영향 4. RNA 분석을위한 현재 기술은 특정 세포 집단에서 평균 값의 정량화에 초점을 맞 춥니 다. 세포는 그들의 적대적 환경 5에 적응할 수 있도록 유전자의 무수한의 전사를 개시함으로써 저산소 자극에 반응한다. 그러나, 저산소증 자주 그라데이션으로 존재하고, 저산소 환경에서 세포가 균일 한 저산소 자극을받지 않는다. 우리는 저산소증에있는 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 합성을 검토하는 산소 제어 워크 스테이션에서 Click-IT RNA 이미징 키트의 구현을 설명합니다. RNA 이미징 키트를 사용하여lkyne 수정 된 뉴 클레오 시드, 5 -에 티닐 우리 딘 (EU)과 세포와 조직 6 시간적 공간적으로 글로벌 RNA 합성의 검출을 가능하게 chemoselective 내고. 간략하게, 세포는 저산소증 및 EU의 존재 하에서 배양으로 처리된다. 그런 다음 고정 per​​meabilized 및 초기 RNA에 유럽 연합 (EU)의 결합은 아 지드 포함하는 염료와 EU의 chemoselective 결찰에 의해 감지된다. 이 반응의 일반적인 워크 플로는 그림 1B에 표시됩니다. 우리는 저산소증 치료의 결과 단일 세포 수준에서 RNA 합성을 검사하는 RNA 이미징 키트를 사용했습니다. 알킨 태그의 작은 크기는 특히 RNA로 수정 된 뉴 클레오 시드의 효율적인 결합을 가능하게합니다. chemoselective 결찰 또는 &#39;클릭&#39;반응은 매우 효율적이고 빠르고 7-10 다릅니다. 반응의 모든 구성 요소는 생체 불활성이고, 반응은 더 극단적 인 온도 나 용매를 필요로하지 않는다. 클릭 반응은 부정기존의 radiolabelling에 대한 요구 사항과 출력 이후의 결과를 직접 시각화 할 수는 빛이다. 또, 검출 분자는 쉽게 RNA-단백질 상호 작용을 검출하기위한 항체를 포함한 멀티 플렉스 분석을 허용 복잡한 샘플을 관통 할 수있다. 이 RNA 영상 분석 알렉사 플 루어 및 형광 (FITC) 등의 유기 염료와 호환됩니다. 우리는 원격 객체에 대한 오픈 현미경 환경 (OMERO)의 구현을 사용하여 우리의 세포 치료 다음 RNA 합성의 변화를 측정 하였다. OMERO은에서 사용할 수있는 오픈 소스 소프트웨어입니다 <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어에 대한 액세스, 및 다차원, 이종 데이터 세트의 관리를 포함하는 생체 데이터의 광범위한 사용을 가능하게한다. 클라이언트 애플리케이션은 원격 시각화 복잡한 생물학적 화상 데이터 (11)의 분석을 허용한다;우리는 글로벌 및 단일 세포 RN​​A의 합성에 시각적 인 변화를 계량화하는 데 사용됩니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 이러한 데이터하고 RNA 이미징 실험을 분석하기 위해 필요한 단계를 이하에 나타낸다. 우리는 최대 24 시간 동안 저산소증 인간 골육종의 치료 (U2OS) 세포 다음 글로벌 RNA 합성의 변화를 바라 보았다. 모든 상황에서, 우리는 RNA 생산의 수준에있는 세포에 세포 변화를 감지했습니다. 저산소증 노출의 짧은 시간에 초기 세포 RN​​A의 수준에 큰 변화가 발생하지 않았다. 그러나, 저산소증에 24 시간 노출은 세포에서 생성 된 RNA의 양을 크게 증가 결과. 저산소증에 대한 세포 반응의 대부분은 같은 4-24 시간으로 노출의 장기간, 다음 측정된다. 그러나 일부 메커니즘은, 예를 들어, 훨씬 이전에 장소에 배치됩니다; NF-κB의 활성화는 저산소증 노출 12 ~ 15 분 이내에 발생합니다. 짧은 저자 조사쌰 노출 시간 따라서 보증하고, 이러한 세포주기 및 세포 사멸과 같은 더 복잡한 반응을 손상 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>U2OS 일차 세포</td> 유럽 <td>세포 배양 컬렉션</td><td>92022711</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco 14190094</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Lonza</td><td>DE17-603E</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA (1%)</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>저산소증 챔버</td><td>Ruskinn</td><td>InVivo2 300</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C-10329/C10330</td><td></td></tr><tr><td>pFA</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>VWR</td><td>20252.335</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield 마운팅 Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision Core Microscope</td><td>Applied Precision</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx</td><td>Applied Precision</td><td>N/A</td><td>텍스트에서 이미지 처리 소프트웨어라고 합니다.</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2 CCD 카메라</td><td>광도측정</td><td>해당 없음 NO/A</td><td></td></tr><tr><td>원격 물체를 위한 개방형 현미경 환경 (OMERO)</td><td>OME</td><td>해당 없음</td><td>텍스트로 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어라고 합니다.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v12.0</td><td>시스템 소프트웨어 Inc.</td><td>N/A</td><td>텍스트에서 데이터 그래프 소프트웨어라고 합니다.</td></tr></tbody></table>

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 rna의 합성 분석

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

산소 가용성의 저산소증 또는 저하는 많은 생리적, 병리 적 과정에 참여하고있다. 분자 수준에서, 세포는 적절한 조율 세포 반응을 마운트하기 위해 특정 전사 프로그램을 개시. 셀은 그들의 활동을위한 보조 인자로서 분자 산소를 요구하는 여러 산소 센서 효소를 소유한다. 이들은 프 롤릴-hydroxylases에서 히스톤 demethylases에 이르기까지 다양합니다. 저산소증에 세포 반응 분석 연구의 대부분은 세포 집단과 보통의 연구에 기초하고 있으며, 저산소 세포의 이러한 단일 세포 분석으로 거의 수행되지 않는다. 여기에서 우리는 현미경 분석 및 정량화 다음에 산소 제어 워크 스테이션에서 클릭 - IT RNA 이미징 키트를 사용하여 저산소증에있는 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 합성을 분석하는 방법을 설명합니다. 시간의 길이가 다른 대 저산소증에 노출 된 암 세포를 이용하여, RNA는 각 셀에 표시되고 측정된다. 이 분석은 허용저산소 스트레스 다음 글로벌 RNA의 합성에 시간과 세포에 세포 변화의 시각화.

RNA 이미징 키트 반응의 회로도는 그림 1B에 표시됩니다. 우리는 정량적으로 개인 (단일 셀) 및 글로벌 수준 (세포의 인구) 모두에서 저산소증 치료 다음 U2OS 세포에서 총 RNA의 합성을 결정하는 반응을 이용했다. 세포는 저산소증 및 EU의 존재 하에서 배양을 시행 하였다. 그런 다음 고정 per​​meabilized과 유럽 연합 (EU)의 결합은 아 지드 포함하는 염료와 EU의 chemoselective 결찰에 의해 발견되었습니다했다. 이것은 검출 된 형광 광 현미경을 사용하여 정량화 될 수있는 형광 방출의 반응 결과를 &#39;클릭&#39;.도 2a는 본 실험에서의 전형적인 결과를 나타낸다. 형광 표지 된 세포는 빨간 모조 착색하고 이미지가 원격 객체에 대한 오픈 현미경 환경 (OMERO)에 개설되었습니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어가 내장되어 개별 하위 세포 구 조를 선택하는데 사용될 수있다 ROI 도구정량적 뚜 및 선택 영역 내에서 이미지의 강도를 분석 할 수 있습니다. 클라이언트 프로그램이 도구의 사용에 다음 데이터 출력의 전형적인 예는도 2b에서 볼 수있다; 개별 셀의 강도는 데이터의 유효 기간을 확인하기 위해 육안 검사 역할을하는 실험의 대표 이미지와 함께 표시됩니다. 개별 셀 형광 농도는 처리 된 세포 집단 내의 개별 셀룰러 농도의 분포를 보여주는 캐터 차트로 나타내 어질 수있다. 그래프의 종류의 예는도 2c에서 볼 수있다. 이 처리 결과의 신속한 비교를 허용하고 명백하게 다르게 기본 데이터 표현을 사용 가려 처리 세포 집단 내의 상당한 이질성을 설명하기 때문에이 방법으로 강도 데이터를 플로팅하는 것이 유용하다. 응답 이질성이 실험에 흥미 균일 한 저산소 자극이 있었지만 때문에셀 pplied, 동일 단층 모집단에서 모든 세포가 자극에 다르게 반응하는 것이 분명하다. 그림 2D는 우리의 실험에서 전체 결과를 보여줍니다. 처리 인구 내의 모든 세포에서 형광 강도는 평균 다음이 막대 차트에 그려진했다. 학생의 t-시험은 제어 크게 상이한 각 처리 군의 통계적 확률을 계산하는 데 사용되었다. 흥미롭게도, 이러한 데이터는 항상 1보다 큰 시간 30 분 (U2OS 세포를 저산소 상태로 처리되어 시간에 따른 해외 RNA 합성에 통계적으로 유의 한 증가가 있음을 보여준다 * p &lt;0.01]. ** p &lt;0.05 *** P &lt;0.001 N&gt; 30). 이러한 데이터는 저산소증 치료의 긴 기간 다음, 세포도이 적대하는 저산소 환경에서 RNA의 생산에 노력을 집중한다 것을 보여줍니다. 악 티노 마이신 D의 처리는 완전히 예상대로 형광 강도를 절제한다.<img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> 그림 1. A. HIF 시스템은 세포의 산소의 변화에 응답합니다. 이 개략적 저산소증에 프 롤릴 수산화 효소 (박사 학위)과 폰 Hippel-Lindau에서 단백질 (VHL)에 의해 그 이후 polyubquitination에 의해 HIF-α 수산화 (-OH)를 방지하여 HIF의 이종는 안정. . B.의 RNA 합성은 클릭 - IT 분석을 이용하여 검출 할 수있다 세포 저산소증에 대한 세포 반응을하는 데 도움이 수많은 유전자의 활성화에 HIF 안정화 결과; 세포가 클릭 반응이 형광 강도와 광학 현미경에 의해 정량화 될 수있다 RNA 합성을 감지 치료 후 EU로 표시되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">큰 적이있는를 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> 그림 2. OMERO에서 A. 스크린 샷 RNA 라벨링 다음과 같은 일반적인 미세한 출력을 표시합니다. 이 현미경 이미지 시각화 및 분석 소프트웨어는 신속 내장형 ROI 매크로를 사용하여 개별 셀 레벨에서 강도 데이터를 추출 할 수있다. 이 명령의 출력의 스크린 샷이 B. 글로벌 RNA의 합성에 도시하는 것은 개별 셀의 강도에서 유추 할 수있다,의 범위는 * P C.이 집계 데이터의 형식적인 표현이 D. 볼 수 있습니다 산점도에서 볼 수 있습니다 &lt;0.01; * P &lt;0.05 *** p &lt;0.001 N&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <tabl전자 국경 = &quot;0&quot;cellpadding이 = &quot;0&quot;cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> 세포 배양 시약 </td></tr><tr><td> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 pH 7.2-7.6 </td></tr><tr><td> 둘 베코의 수정 이글스 중간 (DMEM) </td></tr><tr><td> 태아 혈청 (FCS) 필터 소독 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신-EDTA (1 %) </td></tr><tr><td> 70 % 에탄올 </td></tr><tr><td> 악 티노 마이신 D (1 ㎍ / ㎕의 주식) </td></tr><tr><td> 세포 배양 장비 </td></tr><tr><td> 멸균 파스퇴르 피펫 </td></tr><tr><td> 문화에 세포의 유지 관리 및 치료에 적합한 세포 배양 처리 된 플라스틱 제품의 범위 </td></tr><tr><td> 물 목욕은 37 ° C로 설정 </td></tr><tr><td> 층류 공기 유동 후드 </td></tr><tr><td> 창업 보육 센터는 37 ° C에서 5 % CO 2를 설정 </td></tr><tr><td> 저산소증 워크 스테이션은 37 ° C에서 5 % CO 2, 1 % O 2를 설정 </td></tr><tr><td> 유리 커버 슬립 </td></tr><tr><td> 정밀 핀셋 </td></tr><tr><td> 혈구 </td></tr></tbody></table> 표 1. U2OS 세포의 배양에 필요한 시약 및 기기. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> 반응의 구성 요소 </td><td colspan="6"> Coverslips는 수 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 클릭-IT RNA 반응 버퍼 (구성 요소 C) </td><td> 428 μL </td><td> 856 μL </td><td> 1.7 ML </td><td> 2.1 ML </td><td> 2.58 ML </td><td> 4.3 ML </td></tr><tr><td> CuSO 4 (구성 요소 D) </td><td> 20 μL </td><td> 40 μL </td><td> 80 μL </td><td> 100 μL </td><td> 120 μL </td><td> 200 μL </td></tr><tr><td> 알렉사 형석 아 지드 (단계 2.3에서 준비) </td><td> 1.8 ㎕의 </td><td> 3.7 ㎕의 </td><td> 7.4 ㎕의 </td><td> 9.3 ㎕의 </td><td> 11.28 μL </td><td> 18.8 μL </td></tr><tr><td> 클릭-IT 반응 버퍼 첨가제 (단계 2.3에서 준비) </td><td> 50 μL </td><td> 100 μL </td><td> 200 μL </td><td> 250 μL </td><td> 300 μL </td><td> 500 μL </td></tr><tr><td> 대략적인 총 양 </td><td> 500 μL </td><td> 1 ㎖ </td><td> 2 ㎖ </td><td> 2.5 ML </td><td> 1.5 ML </td><td> 5 ㎖ </td></tr></tbody></table> . 표 2 RNA 촬상 키트 반응 칵테일 : 염색되는 커버 슬립의 개수에 따라 RNA 촬상 키트 반응을위한 마스터 믹스 성분의 비율을 자세히 참조 테이블. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 형광 </td><td> 여기 (NM) </td><td> 방출 (NM) </td></tr><tr><td> 알렉사 플 루어 488 </td><td> 495 </td><td> (519) </td></tr><tr><td> DNA에 결합 훽스트 33342, </td><td> (350) </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . 표 3 형광 / 여기 발광 최대 : DNA에 결합 알렉사 플 루어 염료 및 훽스트 33342에 대한 대략적인 형광 / 여기 방출 최대.

우리는 촬상을 사용 저산소증 글로벌 RNA 합성의 분석을위한 기술을 설명한다. RNA의 클​​릭 - 화학 라벨은 이전에 저산소증에서 수행하고 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 변화의 시각화를 허용하지 않았습니다. 이 접근법은 해외 RNA 합성 세포 간 변화의 직접적인 시각화를 허용하며, 기존의 평균화 RNA 기술을 보완한다.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정량적 이미지 분석을 통해 처리 조건 하에서 생성된 nascent RNA를 형광 표지하고 그 양을 정량화하는 것입니다. 커버글라스에 도말된 배양 세포를 알킨 변형 염기인 5-ethynyl uridine(이하 5-EU)으로 처리한 후, 저산소 조건에서 배양합니다.배양 과정 동안, 세포 전사 기전을 방해하지 않고 RNA 합성 과정에서 5-EU가 통합됩니다. 다음으로, 통합된 5-EU는 구리 촉매 아지드-알킨 고리 첨가 반응 또는 클릭 반응을 통해 형광 표지됩니다. 형광 표지된 신생 RNA를 형광 현미경으로 촬영하고, 생성된 이미지를 분석하여 처리군과 대조군 조건에서 생성된 RNA의 양을 비교합니다.결과 데이터의 통계 분석을 통해 다섯 가지 EU 통합 및 형광 현미경 검출의 정량화를 거쳐, 저산소증에 반응한 신생 RNA 생성의 변화를 보여줍니다. 정량적 BCR과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 세포 내 RNA 생성을 직접 시각화할 수 있다는 점입니다. 여기서는 세포가 저산소 상태에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해 이 방법을 사용하지만, 화학요법 약물에 대한 반응을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.추가적인 스트레스 반응에 대한 저희의 대응 절차는 제 연구실의 대학원생인 John Leston이 또 다른 대학원생인 ish Kova 및 박사후 연구원인 Humana Druker의 도움을 받아 시연할 것입니다. 마지막으로, Gus Ferguson이 이미지 시각화 소프트웨어의 사용법을 시연하겠습니다. 먼저 여러 개의 커버슬립을 70% ethanol에 담가 멸균하는 것으로 이 실험을 시작하십시오.조직 배양 후드 내 플레이트 가장자리에 커버슬립을 놓고 층류 하에서 자연 건조시킵니다. 커버슬립이 건조되면 6개의 3.5 centimeter 디쉬에 각각 하나씩 넣습니다. 각 디쉬에 따뜻한 완전 DMEM 2 milliliters를 첨가합니다.핀셋으로 눌러 각 커버슬립이 웰 바닥에 잘 밀착되도록 합니다. 다음으로 조직 배양 접시에서 U2 OS 세포를 분리하기 위해 3 mL의 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 따뜻한 0.05% trypsin, 1% EDTA 4 mL를 처리하고 37 °C에서 7분 동안 배양합니다.Resus 처리 후 7분이 지나면, trypsin EDTA를 불활성화하기 위해 6 mL의 따뜻한 완전 DMEM에 세포를 현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 커버슬립이 포함된 3.5 cm 디쉬 각각에 2 × 10⁵개의 세포를 분주합니다. 세포가 고르게 분포되도록 디쉬를 살살 흔들어 준 뒤, 세포가 부착될 수 있도록 37 °C, 21% 산소, 5% 이산화탄소 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 인큐베이터에서 디쉬 5개를 꺼냅니다. 나머지 디쉬 하나는 건드리지 않고 그대로 둡니다. 이 디쉬는 정상 산소 조건의 양성 대조군으로 사용됩니다.디쉬 4개를 저산소 작업 스테이션에 넣습니다. 세포를 75분, 90분, 2시간, 그리고 24시간 동안 저산소 조건에 노출시킵니다. 나머지 디쉬의 경우.배지에 actinomycin D를 최종 농도 10 µg/mL가 되도록 첨가하고, 일반 산소 조건의 37 °C 인큐베이터에 4시간 동안 다시 넣어둡니다. 이 디시는 상산소성 음성 대조군으로 사용됩니다. 세포를 배양하는 동안, click-it 분석을 위해 다음의 시약들을 준비하고 수집하십시오.Click-it 분석 키트, pH 7.2에서 7.6의 PBS, PBS 내 3.7% Paraformaldehyde, PBS 내 1% Triton X 100, 탈이온수, dimethyl sulfoxide, 10 M sodium hydroxide, 37% hydrochloric acid 및 pH 지시 strip이 필요합니다. 처리 조건 하에서 라벨링 분석을 시작할 수 있도록 계획하십시오. 저산소 처리 종료 1시간 전에, 미리 데운 완전 배지에 100 mM stock의 EU를 사용하여 2배 농도의 working solution을 준비하여 세포를 라벨링합니다.다음으로, actinomycin D 처리된 세포가 담긴 디쉬의 배지에 2X EU와 동일한 부피를 추가하여 EU를 작동 농도로 희석합니다. 그런 다음 저산소 챔버 내의 저산소 처리 세포에 EU 스톡을 추가합니다. 저산소 처리 후에는 처리 세포 배양 조건에서 1시간 동안, 대조군의 경우에는 4시간 후에 배양합니다.각 디쉬를 PBS로 한 번 세척하고 처리 조건 하에서 3.7% Paraform aldehyde 스톡 1 mL를 첨가한 후, 처리 조건 하에서 15분 동안 배양합니다. 고정 후, 저산소 챔버에서 세포를 꺼내 흄 후드로 옮깁니다. 파라포름알데히드 폐기물을 책임 있게 처리하며 고정액을 따라내어 제거합니다.그런 다음 세포를 PBS로 한 번 세척합니다. 모든 용액은 2~6°C의 얼음 위에 보관하며, 다음 단계들은 실온에서 수행합니다. 다음으로 세포를 투과성으로 만들기 위해 세척액을 제거하고, 각 웰에 1% Triton X 100/PBS 1mL를 가한 후 실온에서 15분 동안 배양합니다.투과 버퍼를 제거하고 각 웰을 PBS로 한 번 세척합니다. 세포에서 세척액을 제거하고 각 샘플에 갓 준비한 RNA 이미징 키트 반응 칵테일 500 µL를 첨가합니다. 세포를 빛으로부터 차단하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.배양 후, RNA 이미징 키트 반응액, 칵테일 및 세척액을 제거합니다. RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼 1 mL로 헹굽니다. 추가적인 항체 표지는 이 단계에서 수행해야 합니다. DNA를 염색하려면 샘플을 PBS로 세척한 다음, herst 3, 3, 3, 4, 2를 1:1000으로 희석합니다.PBS 내의 각 웰에 희석된 HERC 용액 1 mL를 첨가합니다. 빛이 완전히 차단된 상태에서 실온으로 15분 동안 배양합니다. 배양 후 HERC 용액을 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척하여 커버슬립을 마운팅합니다.표준 현미경 슬라이드 중앙에 마운팅 매질 10 µL를 떨어뜨립니다. 커버슬립의 세포가 있는 면이 마운팅 매질 방울에 닿도록 덮어줍니다. 기포가 생기면 이후의 이미지 획득에 방해가 되므로 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 도포하여 현미경 슬라이드에 고정합니다. 실온에서 5분 동안 매니큐어를 건조시킵니다. 빛이 차단된 상태의 시료는 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.마운팅 후, 형광 검출이 가능한 광시야 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 40배 1.30 NA 오일 침수 렌즈를 사용하여 이미징을 수행하고, 냉각 CCD 카메라로 이미지를 캡처합니다. 이미지 획득 후 최소 30개의 세포를 분석합니다.이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지의 디컨볼루션(deconvolution)을 수행합니다. 이는 캡처된 이미지에 소프트웨어 기반의 수학적 공식을 적용하여 광학적 왜곡을 보정하는 과정입니다. 이를 통해 더 선명한 이미지를 얻을 수 있으며, 이후의 분석이 촬영된 세포에만 한정되도록 보장합니다.다음으로, 이미지를 Omer O 클라이언트로 가져옵니다. 동일한 실험 내의 모든 이미지에 대해 렌더링 설정을 정규화하기 위해 획득한 모든 이미지의 썸네일이 표시됩니다. 분석 소프트웨어의 관심 영역 ROI 도구를 사용하여 대조군 정상 산소 세포의 렌더링 설정을 다른 모든 조건에 적용하십시오.소프트웨어를 사용하여 각 이미지에서 핵을 선택합니다. 강도 분석(intensity analysis) 옵션을 선택하고 30~50개 세포의 각 ROI에 대한 평균 강도를 구합니다. 데이터를 저장한 후 각 조건에 대한 평균과 표준 편차를 계산합니다.마지막으로, 데이터 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 모든 개별 평균 강도 값의 산점도를 작성함으로써 각 조건하에서 세포 간의 가변성을 반영합니다. 강도 데이터를 이러한 방식으로 도식화하면 처리 결과의 신속한 비교가 가능하며, 표준 데이터 표현 방식으로는 가려지기 쉬운 처리된 세포 집단 내의 유의미한 이질성을 명확하게 보여줄 수 있어 유용합니다. 또는, 저산소증 처리 후 5-al uridine 또는 EU 존재 하에 배양된 U2 OS 세포를 처리 및 분석하여, 전체 RNA 합성을 정량적으로 결정하기 위해 신생 RNA의 평균 강도 값과 표준 편차를 나타내는 막대 그래프를 작성합니다.이 영상에서 보여준 바와 같이, 각 처리군 내 모든 세포의 형광 강도를 평균하여 그래프로 나타냈습니다. 이 막대그래프에서는 학생 T-검정(student's T-test)을 사용하여 각 처리군이 대조군과 통계적으로 유의미하게 차이가 나는지 확률을 계산했습니다. 흥미롭게도, 이 데이터는 시간이 경과함에 따라 전체 RNA 합성이 통계적으로 유의미하게 증가함을 보여줍니다.예상대로 U2 OS 세포를 1시간 30분 이상 저산소 처리했을 때, Actinomycin D 처리는 형광 강도를 완전히 소멸시킵니다. 이러한 데이터는 장기간의 저산소 처리 후, 세포가 이러한 가혹한 저산소 환경에서도 RNA 생산에 노력을 집중한다는 것을 시사합니다. 이 영상을 시청하고 나면 저산소 및 정상산소 상태에서 단일 세포 수준의 신생 RNA를 표지하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 2시간 이내에 수행할 수 있습니다.RNA polymerase 수준이 변했는지와 HIF가 활성화되었는지를 결정하기 위해 RNA polymerase 및 HIF에 대한 항체로 공동 염색하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 포름알데히드를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 항상 장갑을 착용하고 흄 후드 내에서 작업하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

Translating Ribosome Affinity Purification(TRAP)은 mRNA의 세포 유형별 번역을 캡처할 수 있습니다. 여기에서 우리는 초파리 배아의 희귀 세포 집단에서 mRNA를 분리하는 데 전념하는 최초의 TRAP 프로토콜을 보고합니다.

희귀 세포 집단에서 TRAP-RC, 번역 리보솜 선호도 정화<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

여기, 우리를 mRNA 수준 S. cerevisiae 세포의 hypoxic 응답 시간 모니터링 RNA-seq를 사용 하 여 프로토콜을 제시. 이 메서드는 어떤 세포 응답 중 유전자 발현 분석을 적용할 수 있습니다.

효 모 S. cerevisiae Hypoxic 응답 하는 동안 시간이 지남에 mRNA 수준 측정

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

RNA 합성을 측정 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. 5-Bromouridine 셀에 추가 하 고 합성된 RNA에 통합 됩니다. RNA 합성은 반전 녹음 방송 및 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 이라는 분석과 RNA의 5-Bromouridine-타겟 immunoprecipitation 다음 라벨, 직후 RNA 추출에 의해 측정 됩니다.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

여기에 설명 된 프로토콜 4-thiouracil으로 표시 하는 효 모 세포에서 정화 하는 새로 합성된 mRNA의 게놈 넓은 정량화를 기반으로 합니다. 이 방법은 mRNA 합성 mRNA 감퇴에서 연결을 측정할 수 있게 그리고, 따라서, RNA 중 합 효소 II 전사의 정확한 측정을 제공 합니다.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

여기에서 우리는 RNA의 DNAzyme 의존적인 절단을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 RNA 2'-O-메틸화의 신속하고 현장 의존적인 분석을 가능하게 합니다. 이러한 접근법은 스노RNA 활성의 예비 또는 주요 평가를 위해 사용될 수 있다.

RRNA 2'-O-메틸화의 DNAzyme 의존분석

cDNA의 키네틱 가교 및 분석은 높은 시간 분해능에서 살아있는 세포에서 단백질-RNA 상호작용의 역학을 조사할 수 있는 방법입니다. 여기에서 프로토콜은 효모 세포의 성장, UV 가교, 수확, 단백질 정제 및 차세대 시퀀싱 라이브러리 준비 단계를 포함하여 자세히 설명됩니다.

χCRAC를 사용하여 높은 시간 분해능에서 생체 내 단백질-RNA 상호 작용 역학 모니터링

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

RNA 2차 구조는 주로 구조 탐사 방법을 통해 성숙한 RNA에서 관찰되었습니다. 공동전사구조추적시퀀싱(CoSTseq)은 핵 런온을 구조 탐지와 결합하여 신생 RNA의 중합효소 위치를 연구하는 데 사용되었습니다. CoSTseq는 활성 전사 상태에서 RNA 내 RNA 2차 구조를 관찰할 수 있게 합니다.

Saccharomyces cerevisiae에서 신생 및 성숙 전사체의 RNA 구조 비교 분석

학습하세요 저산소증 조건에서 단일 세포 수준의 신생 RNA 합성을 형광 표지하고 정량 분석하는 방법을. 클릭 화학 반응과 형광 현미경을 활용하여 세포 반응의 이질성을 시각화합니다.

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