저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

이 실험 절차의 전반적인 목표는 정량적 이미지 분석을 통해 처리 조건 하에서 생성된 nascent RNA를 형광 표지하고 그 양을 정량화하는 것입니다. 커버글라스에 도말된 배양 세포를 알킨 변형 염기인 5-ethynyl uridine(이하 5-EU)으로 처리한 후, 저산소 조건에서 배양합니다.

배양 과정 동안, 세포 전사 기전을 방해하지 않고 RNA 합성 과정에서 5-EU가 통합됩니다. 다음으로, 통합된 5-EU는 구리 촉매 아지드-알킨 고리 첨가 반응 또는 클릭 반응을 통해 형광 표지됩니다. 형광 표지된 신생 RNA를 형광 현미경으로 촬영하고, 생성된 이미지를 분석하여 처리군과 대조군 조건에서 생성된 RNA의 양을 비교합니다.

결과 데이터의 통계 분석을 통해 다섯 가지 EU 통합 및 형광 현미경 검출의 정량화를 거쳐, 저산소증에 반응한 신생 RNA 생성의 변화를 보여줍니다. 정량적 BCR과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단일 세포 수준에서 세포 내 RNA 생성을 직접 시각화할 수 있다는 점입니다. 여기서는 세포가 저산소 상태에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해 이 방법을 사용하지만, 화학요법 약물에 대한 반응을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.

추가적인 스트레스 반응에 대한 저희의 대응 절차는 제 연구실의 대학원생인 John Leston이 또 다른 대학원생인 ish Kova 및 박사후 연구원인 Humana Druker의 도움을 받아 시연할 것입니다. 마지막으로, Gus Ferguson이 이미지 시각화 소프트웨어의 사용법을 시연하겠습니다. 먼저 여러 개의 커버슬립을 70% ethanol에 담가 멸균하는 것으로 이 실험을 시작하십시오.

조직 배양 후드 내 플레이트 가장자리에 커버슬립을 놓고 층류 하에서 자연 건조시킵니다. 커버슬립이 건조되면 6개의 3.5 centimeter 디쉬에 각각 하나씩 넣습니다. 각 디쉬에 따뜻한 완전 DMEM 2 milliliters를 첨가합니다.

핀셋으로 눌러 각 커버슬립이 웰 바닥에 잘 밀착되도록 합니다. 다음으로 조직 배양 접시에서 U2 OS 세포를 분리하기 위해 3 mL의 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 따뜻한 0.05% trypsin, 1% EDTA 4 mL를 처리하고 37 °C에서 7분 동안 배양합니다.

Resus 처리 후 7분이 지나면, trypsin EDTA를 불활성화하기 위해 6 mL의 따뜻한 완전 DMEM에 세포를 현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정하고, 커버슬립이 포함된 3.5 cm 디쉬 각각에 2 × 10⁵개의 세포를 분주합니다. 세포가 고르게 분포되도록 디쉬를 살살 흔들어 준 뒤, 세포가 부착될 수 있도록 37 °C, 21% 산소, 5% 이산화탄소 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 인큐베이터에서 디쉬 5개를 꺼냅니다. 나머지 디쉬 하나는 건드리지 않고 그대로 둡니다. 이 디쉬는 정상 산소 조건의 양성 대조군으로 사용됩니다.

디쉬 4개를 저산소 작업 스테이션에 넣습니다. 세포를 75분, 90분, 2시간, 그리고 24시간 동안 저산소 조건에 노출시킵니다. 나머지 디쉬의 경우.

배지에 actinomycin D를 최종 농도 10 µg/mL가 되도록 첨가하고, 일반 산소 조건의 37 °C 인큐베이터에 4시간 동안 다시 넣어둡니다. 이 디시는 상산소성 음성 대조군으로 사용됩니다. 세포를 배양하는 동안, click-it 분석을 위해 다음의 시약들을 준비하고 수집하십시오.

Click-it 분석 키트, pH 7.2에서 7.6의 PBS, PBS 내 3.7% Paraformaldehyde, PBS 내 1% Triton X 100, 탈이온수, dimethyl sulfoxide, 10 M sodium hydroxide, 37% hydrochloric acid 및 pH 지시 strip이 필요합니다. 처리 조건 하에서 라벨링 분석을 시작할 수 있도록 계획하십시오. 저산소 처리 종료 1시간 전에, 미리 데운 완전 배지에 100 mM stock의 EU를 사용하여 2배 농도의 working solution을 준비하여 세포를 라벨링합니다.

다음으로, actinomycin D 처리된 세포가 담긴 디쉬의 배지에 2X EU와 동일한 부피를 추가하여 EU를 작동 농도로 희석합니다. 그런 다음 저산소 챔버 내의 저산소 처리 세포에 EU 스톡을 추가합니다. 저산소 처리 후에는 처리 세포 배양 조건에서 1시간 동안, 대조군의 경우에는 4시간 후에 배양합니다.

각 디쉬를 PBS로 한 번 세척하고 처리 조건 하에서 3.7% Paraform aldehyde 스톡 1 mL를 첨가한 후, 처리 조건 하에서 15분 동안 배양합니다. 고정 후, 저산소 챔버에서 세포를 꺼내 흄 후드로 옮깁니다. 파라포름알데히드 폐기물을 책임 있게 처리하며 고정액을 따라내어 제거합니다.

그런 다음 세포를 PBS로 한 번 세척합니다. 모든 용액은 2~6°C의 얼음 위에 보관하며, 다음 단계들은 실온에서 수행합니다. 다음으로 세포를 투과성으로 만들기 위해 세척액을 제거하고, 각 웰에 1% Triton X 100/PBS 1mL를 가한 후 실온에서 15분 동안 배양합니다.

투과 버퍼를 제거하고 각 웰을 PBS로 한 번 세척합니다. 세포에서 세척액을 제거하고 각 샘플에 갓 준비한 RNA 이미징 키트 반응 칵테일 500 µL를 첨가합니다. 세포를 빛으로부터 차단하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후, RNA 이미징 키트 반응액, 칵테일 및 세척액을 제거합니다. RNA 이미징 키트 반응 린스 버퍼 1 mL로 헹굽니다. 추가적인 항체 표지는 이 단계에서 수행해야 합니다. DNA를 염색하려면 샘플을 PBS로 세척한 다음, herst 3, 3, 3, 4, 2를 1:1000으로 희석합니다.

PBS 내의 각 웰에 희석된 HERC 용액 1 mL를 첨가합니다. 빛이 완전히 차단된 상태에서 실온으로 15분 동안 배양합니다. 배양 후 HERC 용액을 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척하여 커버슬립을 마운팅합니다.

표준 현미경 슬라이드 중앙에 마운팅 매질 10 µL를 떨어뜨립니다. 커버슬립의 세포가 있는 면이 마운팅 매질 방울에 닿도록 덮어줍니다. 기포가 생기면 이후의 이미지 획득에 방해가 되므로 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.

커버 슬립의 가장자리에 투명 매니큐어를 도포하여 현미경 슬라이드에 고정합니다. 실온에서 5분 동안 매니큐어를 건조시킵니다. 빛이 차단된 상태의 시료는 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

마운팅 후, 형광 검출이 가능한 광시야 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 40배 1.30 NA 오일 침수 렌즈를 사용하여 이미징을 수행하고, 냉각 CCD 카메라로 이미지를 캡처합니다. 이미지 획득 후 최소 30개의 세포를 분석합니다.

이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지의 디컨볼루션(deconvolution)을 수행합니다. 이는 캡처된 이미지에 소프트웨어 기반의 수학적 공식을 적용하여 광학적 왜곡을 보정하는 과정입니다. 이를 통해 더 선명한 이미지를 얻을 수 있으며, 이후의 분석이 촬영된 세포에만 한정되도록 보장합니다.

다음으로, 이미지를 Omer O 클라이언트로 가져옵니다. 동일한 실험 내의 모든 이미지에 대해 렌더링 설정을 정규화하기 위해 획득한 모든 이미지의 썸네일이 표시됩니다. 분석 소프트웨어의 관심 영역 ROI 도구를 사용하여 대조군 정상 산소 세포의 렌더링 설정을 다른 모든 조건에 적용하십시오.

소프트웨어를 사용하여 각 이미지에서 핵을 선택합니다. 강도 분석(intensity analysis) 옵션을 선택하고 30~50개 세포의 각 ROI에 대한 평균 강도를 구합니다. 데이터를 저장한 후 각 조건에 대한 평균과 표준 편차를 계산합니다.

마지막으로, 데이터 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 모든 개별 평균 강도 값의 산점도를 작성함으로써 각 조건하에서 세포 간의 가변성을 반영합니다. 강도 데이터를 이러한 방식으로 도식화하면 처리 결과의 신속한 비교가 가능하며, 표준 데이터 표현 방식으로는 가려지기 쉬운 처리된 세포 집단 내의 유의미한 이질성을 명확하게 보여줄 수 있어 유용합니다. 또는, 저산소증 처리 후 5-al uridine 또는 EU 존재 하에 배양된 U2 OS 세포를 처리 및 분석하여, 전체 RNA 합성을 정량적으로 결정하기 위해 신생 RNA의 평균 강도 값과 표준 편차를 나타내는 막대 그래프를 작성합니다.

이 영상에서 보여준 바와 같이, 각 처리군 내 모든 세포의 형광 강도를 평균하여 그래프로 나타냈습니다. 이 막대그래프에서는 학생 T-검정(student's T-test)을 사용하여 각 처리군이 대조군과 통계적으로 유의미하게 차이가 나는지 확률을 계산했습니다. 흥미롭게도, 이 데이터는 시간이 경과함에 따라 전체 RNA 합성이 통계적으로 유의미하게 증가함을 보여줍니다.

예상대로 U2 OS 세포를 1시간 30분 이상 저산소 처리했을 때, Actinomycin D 처리는 형광 강도를 완전히 소멸시킵니다. 이러한 데이터는 장기간의 저산소 처리 후, 세포가 이러한 가혹한 저산소 환경에서도 RNA 생산에 노력을 집중한다는 것을 시사합니다. 이 영상을 시청하고 나면 저산소 및 정상산소 상태에서 단일 세포 수준의 신생 RNA를 표지하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 이 기술을 숙달하면 본 절차에 따라 2시간 이내에 수행할 수 있습니다.

RNA polymerase 수준이 변했는지와 HIF가 활성화되었는지를 결정하기 위해 RNA polymerase 및 HIF에 대한 항체로 공동 염색하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 포름알데히드를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 마십시오. 항상 장갑을 착용하고 흄 후드 내에서 작업하십시오.