이소성 마우스 심장 장기 이식에 대한 수정 방법

이 실험 절차의 전체적인 목표는 공여 마우스의 심장을 수혜 마우스에게 이식하는 것입니다. 먼저 공여 마우스의 흉부에서 심장을 적출하여 차가운 식염수에 보관함으로써 이를 수행합니다. 다음 단계는 수혜 마우스의 복강 내에 심장을 이식하고, 이식된 심장의 박동을 모니터링하는 것입니다.

마지막으로, 육안 검사와 병리 분석을 통해 이식 거부 반응을 확인합니다. 최종적으로, 서로 다른 계통의 생쥐 사이에 이식된 심장은 거부되는 반면, 동일 계통 간에 이식된 심장은 수용되는 결과가 나타납니다. 공여자와 수혜 동물의 크기가 매우 작기 때문에 미세수술 단계에서 이 측정법을 익히는 것이 어려우며, 이에 대한 장기 비디오 시연이 매우 중요합니다.

복잡한 수술 절차와 수혜측 수술 시 정확도 및 속도를 높여야 할 필요성이 있습니다. 모든 기구가 80% ethanol 용액에서 완전히 세척 및 멸균되었는지 항상 확인하십시오. 일회용 멸균 장비의 사용을 강력히 권장합니다. 공여측 마우스가 isof fluorine 챔버 내에서 마취되면, 수술대 위에 등을 대고 눕힙니다.

그 후 빠르게 노즈 콘(nose cone)을 연결하여 마취제를 투여합니다. 뒷발 꼬집기 테스트를 통해 마취 상태를 반드시 확인하십시오. 움찔거리는 반응이 없으면 수술용 칼날을 사용하여 피부 제모를 시작합니다.

그다음 수술 과정 전반에 걸쳐 70% isopropyl alcohol에 희석된 2% Chlorhexidine으로 피부를 세 번 번갈아 닦아 멸균합니다. 동물의 호흡과 심박수를 육안으로 모니터링하십시오. 이에 따라 isoflurane 투여량을 조절합니다.

흉곽 양측의 갈비뼈 부분을 통해 가슴을 열어 심장과 혈관을 노출시키기 위한 흉강 절개술을 수행하는 것으로 시작합니다. 갈비뼈 가장자리부터 액와 방향으로, 그리고 흉골 높이에서 가로 방향으로 절개합니다. 이렇게 하면 흉벽 플랩이 만들어집니다.

플랩을 머리 쪽 수술판에 고정하여 엽니다. 그다음 심장 주변의 심낭을 제거합니다. 포셉으로 하대정맥을 들어 올리고, 심장 근위측의 하대정맥에 차가운 헤파린 식염수 1 mL를 주입합니다.

그런 다음 거즈와 면봉을 사용하여 용액이 바늘 구멍을 통해 역류하는 것을 방지하기 위해 IVC에 작은 동맥 클램프를 부착합니다. 심장을 아래로 이동시켜 대동맥과 폐동맥을 노출시킵니다. 횡횡동굴(transverse sinus)은 대동맥과 폐동맥 다발의 후면에 위치한 채널입니다.

다음으로, 문합을 위해 혈관의 길이를 최대한 확보할 수 있도록 대동맥과 폐동맥을 최대한 원위부에서 절단합니다. 이제 하대정맥(IVC), 우상대정맥(SVC), 좌상대정맥(SVC) 및 폐정맥을 각각 분리합니다. 각 혈관은 6.0 실크사(silk thread)를 사용하여 결찰해야 합니다.

먼저 하대정맥(IVC)과 우상대정맥(SVC)을 결찰합니다. 그런 다음 좌상대정맥(SVC)과 폐정맥을 결찰합니다. 이제 결찰 부위의 원위측에 있는 모든 혈관을 절단하여 심장을 적출합니다.

이식 전까지 심장을 4 °C의 차갑고 멸균된 식염수에 보관하십시오. 공여자와 동일한 방식으로 수술을 위해 동물을 준비한 후, 개복술을 수행하며 시작합니다. 치골부터 흉골 끝까지 정중선을 따라 절개하십시오.

종이클립을 구부려 견인기로 사용합니다. 복부를 절개하고, 장을 따뜻한 생리식염수에 적신 거즈로 감싼 뒤 복부 오른쪽 상단으로 견인합니다. 다음으로, 장골 분지(iliac bifurcation)와 왼쪽 신동맥 및 신정맥 사이의 신하대동맥(infrarenal aorta)과 하대정맥(IVC)을 노출시킵니다.

묶인 대동맥과 하대정맥(IVC) 분절을 분리합니다. 그다음 교정된 전기 소작기로 요혈관으로부터 대동맥과 하대정맥을 분리합니다. 분리된 대동맥 및 하대정맥 분절의 근위단과 원위단에 작은 비외상성 클램프를 장착합니다.

30 gauge 바늘을 사용하여, 수직으로 절개한 구멍을 통해 대동맥 전벽에 공여자의 대동맥 크기만한 구멍을 뚫습니다. 이때 헤파린 생리식염수로 헹구어 대동맥 내강의 혈전들을 제거합니다. 이제 차가운 생리식염수 속에 있는 공여자 심장을 삽입합니다.

공여자의 심장을 수혜자의 대동맥 절개 부위 옆에 배치합니다. 10-0 러닝 나일론 봉합사를 사용하여 공여자의 폐동맥을 수혜자의 하대정맥(IVC) 옆에 배치합니다. 대동맥을 단단-측면(end-to-side) 방식으로 문합합니다.

근위측 모서리에서 시작하여 좌측면을 따라 원위측 모서리까지 봉합합니다. 그다음 동물을 180도 회전시킵니다. 이어서 심장을 옆으로 옮기고 대동맥 벽의 우측면을 따라 원위측에서 근위측 방향으로 봉합을 계속합니다.

문합부를 닫기 전에, 혈전과 공기를 제거하기 위해 헤파린 식염수로 루멘을 부드럽게 세척합니다. 그 다음 봉합을 마무리합니다. 다음으로, 폐동맥을 문합할 하대정맥(IVC) 전벽에 수직 절개를 가합니다.

둘째로, 10-0 running suture를 사용하여 문합합니다. IVC 근위단 루멘 내의 좌측 벽 원위단에서 혈관을 시작합니다. 전측 우측 벽을 따라 계속하여 원위단까지 봉합합니다. 이 과정을 다시 반복합니다.

문합을 완료하기 전에 내강을 충분히 세척하십시오. 다음으로 문합 부위 주변에 젤 폼 조각들을 배치합니다. 면봉으로 가볍게 압박하여 지혈을 수행합니다.

수혜자의 혈관을 재건합니다. 먼저 원위부 클램프를 제거한 다음, 근위부 클램프를 제거하십시오. 수혜자 수술 중에는 수술의 정확도와 속도를 최적화하는 것이 매우 중요합니다.

따라서 교차 클램프 시간은 이상적으로 30분 미만이어야 합니다. 회복을 돕기 위해 이식 부위에 37°C의 따뜻한 생리식염수를 도포하십시오. 심실세동이 즉각적으로 나타나야 하며, 몇 분 내에 자연적으로 동성 리듬으로 돌아와야 합니다.

수술 부위를 봉합하기 전, 부프레노르핀을 근육 내로 투여해야 합니다. 모든 조직층에 대해 5-0 흡수성 봉합사를 이용한 연속 봉합으로 상처를 닫아 수술을 마칩니다. 수술 부위를 봉합한 후, 수여 동물에게 암피실린을 투여하고 생리식염수 0.6 milliliters를 피하 주사합니다.

수분 공급을 돕기 위해 동물을 37 °C로 설정된 가열 패드 A 위에 올려두어 의식을 회복할 때까지 유지합니다. 대부분의 동물은 수술 후 3시간 이내에 물을 마시고 음식을 섭취하기 시작합니다. 8시간 후에도 마우스가 여전히 고통스러운 징후를 보인다면, 증상이 완화될 때까지 12시간마다 buprenorphine을 주사하십시오.

수술 후 첫 10일 동안 마우스의 고통 상태가 48시간 이상 지속되면 수의사에게 문의하십시오. 복부 촉진을 통해 이식된 심장의 박동을 직접 모니터링하십시오. 매일 박동의 강도를 기록하며, 건강한 이식편의 경우 4+, 거부 반응의 진행으로 인해 박동이 약한 경우 1+로 기록합니다.

10일 후 이식편이 완전히 거부되어 심장이 뛰지 않는 경우를 음성으로 기록하십시오. 227건의 이질성 심장 이식 후, 24시간 동안 90.3%, 48시간 동안 86.8%가 성공했으므로 이식된 심장의 박동을 주 3회 계속 모니터링하십시오. 실패 사례에는 후지 마비, 이식편으로 인한 심장 박동 정지, 허혈성 손상 및/또는 혈전증이 포함되었으며, 이식편 생존자의 사망 사례를 분류하였습니다.

심장 이식 실패의 원인은 병리학적으로 확인되었습니다. 화살표로 표시된 이식 심장의 분석 결과, 심장 조직의 혈전증 및 경색이 이 Graft 심장의 실패 원인이었습니다. C 57 Black six 공여자와 수혜자의 계통 조합에서는 심장 거부 반응이 나타나지 않았으며, 이식된 심장은 100일 이상 생존했습니다. 본 사례의 경우, 심장이 생명 유지 상태가 아니었기 때문에 이에 따른 이차적인 근위축으로 인해 크기가 약간 감소했습니다.

반면, 공여체인 DBA 2와 수혜체인 C 57 Black 6의 거부 반응 유도 계통 조합에서는, 이식된 심장이 7일째에 박동을 멈췄으며 100일째에 거부 반응의 증거를 보였습니다. 해당 심장은 적출 후 확인했을 때 완전히 섬유화되어 수축된 상태였습니다. 이 기술은 적절하게 수행될 경우 90 million 이하에서도 가능하며, SF₆ 가스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오.

마취 가스 제거 장치를 사용하는 것이 매우 권장됩니다.