Name: 단일 파장 그림자 영상 예쁜 꼬마 선충 로코 모션을 포함하여 강제 추정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 학습하세요 단일 파장 그림자 영상 기법을 활용하여 C. elegans의 수직 이동 속도와 힘을 측정하는 방법을. 이 저비용 기술은 자유 수영 선충의 생체 역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 바 사르 대학 학부 연구 여름 연구소 (URSI), 루시 메이 너드 연어 연구 기금, NASA 보너스 번호 NX09AU90A, 과학 기술 (NSF-CREST)​​의 우수 연구에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 센터 보너스 번호의 지원에 대한 감사 0,630,388 및 NSF 보너스 번호 1,058,385.

1. C. 엘레 준비 <ol><li> 젊은 성인 C.의 페트리 접시를 준비합니다 C. 정지를 포함하는 이전의 실험에서 설명한대로 엘레 유체 못 베트 11 엘레. </li><li> 영상 분석 당일, 직접 2 단계에서 설명 된 백금 피크 갖고 탈 증류수로 채워진 큐벳으로 라이브 젊은 성인 선충 픽. </li><li> 죽은 C.에게 준비 클로로포름 노출 엘레. 단계 2에 기재된 라이브 선충 따기에 대해 기재된 절차에 따라 계속. </li></ol> 비디오 분석을위한 2. 광 설치 <ol><li> 도 1에 나타내는 바와 같이 그림자 이미지를 생성하는 실험 장치를 조립한다. 카메라로는, 화면의 정면 뷰를 캡처 할 수있는 그대로 화면에서 어떤 거리에 배치 될 수있다. 좋은 장소가 화면에 직면 베트 옆에 있습니다. <ol><li> 적어도 두 개의 거울을 사용하는빔은 12mm의 직경으로 확장되도록 갈릴레오 빔 익스팬더로 동조 헬륨 - 네온 레이저 출력을 조종. </li><li> 빔이 차단되지 않고 핀홀을 통과하도록 빔 경로에있는 하나 또는 두 개의 핀홀을 배치. 정렬이 유지 보장하기 위해 작은 구멍을 사용합니다. </li><li> 10mm 깊이 4 ㎝ 높이 10 mm 폭입니다 장착 된 석영 큐벳에 확장 된 빔을 연출합니다. </li><li> 75mm의 포지티브 초점 길이와 평 볼록 렌즈를 사용하는 빔을 확대. </li><li> 약 120 센티미터 렌즈에서 투사 화면을 놓습니다. 이보다 더 큰 거리가 그림자 이미지의 더 큰 배율을 얻을 것입니다. 그러나, 화상의 품질이 낮은 광 강도 및 회절 간섭의 증가 noticeability 함께 감소 할 것이다. </li><li> 오른쪽 옆 화면 대향 큐벳에, 적어도 60 프레임의 가능한 고속 카메라를 배치. </li></ol></li><li> 광학 세트 근처 해부 현미경을 놓고베트로 선충의 빠른 전송을위한 최대. </li><li> 일시적으로 확장 된 빔에 수직 큐벳 홀더의 중심에 mm 부서와 투명 눈금자를 고정되도록 빔 프로젝트 스크린에 통치자의 확대 이미지입니다. 비디오 분석을위한 길이 스케일을 설정합니다. <ol><li> 프로젝션 스크린에 투사를 방해하지 않도록하기 위해 투사 된 이미지에서 센터를 투명 눈금자를 사용하여 스케일의 거리를 표시합니다. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">비디오 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 이 이미지를 기록하고 배율을 측정한다. 설정에서 통치자를 제거합니다. 때문에 색수차로 변화하는 렌즈를 통해 각 파장에 대한 빛의 굴절의 각도와 같은 다른 파장에 대해이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 큐벳을 교체하고 증류수로 테두리 1mm 범위를 채 웁니다. </li><li> 규모의 거리가 동일에 포함되도록 실내 조명이 켜져있는 상태에서 녹음을 시작합니다투사 된 이미지와 영상. 라이트를 끕니다. </li><li> 얇고 평평 백금 와이어 픽업을 사용하여 개별 젊은 성인 C. 이동 물 표면에 선택을 터치하여 큐벳에 한천 플레이트에서 한 번에 elegans의 하나. 이 때문에 산란광에 빔을 입력 할 때 선충은 물 란에 표시 될 것입니다. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">비디오 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 그들은 확장 된 레이저 빔을 통과 벌레의 투사 이미지를 필름. 이것은 투사 된 이미지가 반전되고 웜의 실제 움직임과 반대 방향으로 이동하도록 표시 할 것을주의하는 것이 중요하다. 중력으로 하강하는 웜 (그림 2)이 화면에 위쪽으로 움직이는 것처럼 보일 것입니다. </li></ol> 3. 비디오 데이터 준비 <ol><li> 영상 분석 프로그램으로 비디오를 가져옵니다. </li><li> 미리 정해진 배율을 사용하여 스케일을 설정한다. </li><li> TRACK 전체 경로를 통해 적어도 10 데이터 포인트와 함께 숨겨진 선충의 머리의 선형 변위는 촬영. </li><li> 유도체 ( &quot;Y&quot;, &quot;시간&quot;)을 취함으로써, 수직 방향의 속도를 검색하고, 단계 2.2에서 결정된 배율에 의해이 값을 나눈다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> C.의 선형 하강을 분석 엘레 : <ol><li> 시간 그래프 바로 수직 위치에 데이터 포인트는 일반적으로 직선을 형성하는 것을 보장하기 위해 확인한다. 일부 편차 인해 선충의 머리의 움직임을 무시할 수 있습니다. 데이터 포인트는 일반적으로 직선을 형성 4.1.2 단계를 계속하는 경우, 그렇지 않으면 하강은 비선형 및 분석은이 프로토콜의 단계 5.1을 사용하여 계속되어야한다. </li><li> 분석 메뉴에서 데이터에 직선 (12)을 맞춤으로써 선형 회귀 라인을 만듭니다. 이 선의 기울기는 C의 수직 속도이다.엘레. 기울기는 특정 간격으로 시간의 변화에​​ 의해 분할 위치의 변화이다. 이러한 방식으로 라이브 죽은 벌레의 하강 속도 (그림 3)를 확인합니다. </li><li> 선충에서 수직 수영 속도를 평균. 약 50 웜의 샘플 크기는 충분하다. 죽은 벌레 드리프트 속도와 살아있는 벌레의 수영 속도를 비교한다. </li></ol></li></ol> 5. C.의 비선형 동작을 분석 엘레 <ol><li> 제 3 절에서 물기둥 내에서 비선형 하강 (그림 4)를 보여줍니다 분석 비디오 파일을 선택합니다. 비선형 하강이 프로토콜의 단계 4.1.1을 사용하여 식별 할 수 있습니다. </li><li> 비디오 분석 소프트웨어의 &#39;분석&#39;메뉴에서 &#39;커브 피팅&#39;을 선택합니다. 2 차 (차) 다항식을 선택합니다. 곡선을 맞 춥니 다. </li><li> 관심 영역의 경우, 각 측면 O에서 브래킷을 밀어 그래프에 맞게 조정F 그래프에 맞는 곡선까지 맞는 내 및 / 또는 잘 오차 막대 내의 데이터 포인트에 매우 가깝습니다. 피팅 프로그램은 시간에 대한 수직 위치입니다 장착 곡선의 수학적 표현을 제공합니다. 물성과 연관된 프로그램 관련 맞춤형 커브 에러를 고려한다. 아래 15 %의 상대 오차는 일반적으로 허용됩니다. </li><li> 추가 더 많은 곡선은 데이터의 추가 섹션을 충당하기 위해 적합하다. 최적 적용을위한 13의 기능을 스플라인 : 곡선이 중첩에 맞는지 확인하고 인접한 곡선을 정렬하려고 있도록 중첩 지역에서 슬로프 경기. </li><li> 단계 5.1.3에서 얻어진 수학 식을 사용하여 장착 곡선의 유도체를 복용하여 관심 영역에 대한 속도를 얻습니다. 속도는 시간에 따라 다를 수 있습니다. 미분 함수의 기울기합니다. 파생 수학적 또는 그래픽을 얻을 수있다. 이 경우 관련 수학적 EXPR을 사용하는 실용적인ession. </li><li> 가속도를 구하는 맞춤형 커브의 이차 미분을 가라. 가속 시간이 다를 수 있습니다. </li><li> 웜 발휘 추력을 계산하는 웜 질량 가속을 곱한다. 합리적인 추정 질량은 웜이 물을 주로 구성되어 있다고 가정 3 μg이다. </li></ol>

<ol><li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li>
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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

SWSI 기술은 자유 생활 선충과 같은 미세한 미생물의 locomotory 기능을 이해하기 위해 또 다른 방법을 제공합니다. 이 기술로 우리는 중력이 죽은 선충에 운영을 활성화 운동 (수영) 및 수동 드리프트 사이에 구별했다. 자유 수영 선충 물에 운동하는 동안 방향을 변경하는 경우 또한, 우리는 선충에 운영 및 선충에 의해 작용하는 항력과 각도의 힘을 측정 할 수 있습니다. 선충은 토양 내의 다른 환경 조건을 발생합니다. 물 토양 내 주머니뿐만 아니라, 고체 입자와 다른 모양과 질감의 생물학적 물질이있다. 또, 선충들은 14에 응답 중력 환경에서 존재한다. 더욱이, 토양의 표면 근방 선충은 상이한 광 파장, 온도 및 습도의 변화뿐만 아니라 노출되는 생물학적박테리아, 약탈 버섯 및 기타 토양 생물과 같은 변수. 선충은, 모든 다른 변수에 수영과 다른 매체에 크롤링, 회전 및 탐색 전략을 변경을 응답해야합니다. 이러한 복잡한 계산 모두는 단지 302 뉴런, 운동에 관련되어있는 서브 세트 및 95 보디 벽 근육 세포에 의해 수행된다. SWSI 기술에 의해 기술 된 종류의 측정은 선충이 탐색 복잡성을 수행하는 방법에 중요한 통찰력을 제공합니다. 첫 번째 부분을 위해, 우리는 야생형 C.의 전체적인 하강 속도를 측정했다 633 nm의 빛 엘레. 이러한 측정을 사용하여, 우리는 항력에게 웜 만남을 추정 할 수있다. 가속 선충의 사례 연구, 힘 속도로 항력 변화하기 때문에 지속적으로 변화를하고있었습니다. 우리가 웜에 작용하는 힘에 대해 할 수있는 몇 가지 문이있다. 웜은 속도가 느려집니다 및 기타 sw하려고으로이 선충의 궤도의 낮은 지점에서 0에 도달 할 때까지 메신저 위쪽으로 드래그 힘의 수직 성분이 감소한다. 이 시점에서, 웜은 최대 수영을 상향 력이 있어야합니다. 이 방법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 투명한 액체에 탐색 모든 미세한 종 SWSI를 사용하여 추적 할 수 있습니다. 연구는 디지털 카메라에 액세스 할 수있는 모든 파장을 실시 할 수있다. 디지털 카메라는 일반적으로 자외선에서 근적외선에 이르는 파장을 데리러 것입니다. 또, 수평 연구는 수직 상방으로 레이저를 연출하여 수행 될 수있다. 종은 현미경 슬라이드와 마찬가지로 수평 투명한 표면 상에 배치 될 수있다. 빔 확장기 후 빔 확장기 또는 확대 렌즈를 조정하면 흐릿한 이미지를 선명하게 할 수 있습니다. 사용자가 일관성 있고 쉽게 빔 정렬을 보장하기 위해 테이블​​에 모든 구성 요소를 고정해야한다. 이 방법은 사용 가능한 레이저 wavelengt에 의해 제한된다HS 해상도. 설치가 간단하기 때문에 본질적으로 방향 및 파장의 유연성이다 기존의 현미경을 통해이 방법의 장점은 또한 단점입니다. 레이저의 단순한 광학 및 얼룩 해상도를 제한 할 수 있습니다. 이러한 단점의 일부가 확실하게 공간 필터를 포함하고 CCD 카메라에 직접 화상을 투영함으로써 미래에 개선 될 수있다. 실험이 처음으로 수행되는 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 쉽게 알게 할 수있다. 난류를 생성하지 않고 베트의 선충을 배치하는 것은 매우 중요합니다. 또한, 진동은 설치를 방해하고 웜의 동작을 변경할 수 있습니다. 이미지를 숨기는 데 사용되는 전원을 제한해야합니다. 직경 1mm 인 레이저 광에 대한 2 mW의 가열 효과를 피하기 위해 최대이어야한다. 설치는 증류수가 아닌 다른 액체를 사용하는 경우 산란 효과에 대한 검사를해야한다. 현재 대부분의 Microscopes은 파장 범위에 여전히 매우 광범위 흰색 조명이나 컬러 필터를 사용하여 수평면에서 작동합니다. 진정으로 하나의 파장을 사용하여 볼 시나리오의 유연성, 즉 수평 위치가 현미경은 일반적으로 하나의 장점 또는 다른 제한됩니다. 또한, 현미경의 이러한 유형은 일반적으로 매우 비싼 여전히 우리의 방법과는 달리 초점 비행기로 제한됩니다. 우리의 설치가 용이 매우 낮은 예산으로 구축 할 수 있습니다. 이 방법은 약간의 자금 운항 학교, 기업 환경뿐만 아니라, 다른 엔티티에 의해 사용될 준비이다. 장래에,이 방법은 운동력 현미경 종 mechanosensation 실시간으로 영향을 연구하기 위하여 매우 복잡한 설정에 사용될 수있다. 이 방법은 각도와 쉽게 사용할보기 깊이의 넓은 범위에서 단일 파장의 연구를합니다.

예쁜 꼬마 선충은 감각 생물학 및 행동을 이해하기위한 최근 유전자 조절, 개발 등의 메커니즘을 연구하기위한 강력한 모델 생물 인 독립 생활 유익한 토양 선충이다. 만 302 뉴런, C.에도 불구 엘레 복잡한 locomotory 패턴, 생식 행동, 탐색, 화성 및 다른 많은 행동 할 수있다. C. 엘레 기계적 수용기, chemoreceptors 심지어 빛의 파란색 파장 (구 등., 2008) 1 검출을 가지고있다. 대부분은 감각 기능의 신경 회로와 C. 일반 locomotory 패턴에 대한 알려져 있지만 엘레은 적은 여러 동시 자극이나 현미경으로 모델링 할 수있는 것보다 더 복잡한 환경 조건에 대한 응답에 대해 잘 알려져 있습니다. 몇 가지 연구는 매우 플라스틱 2,3,4 있습니다 더 복잡한 locomotory 패턴을 제시했습니다. 우리의 방법 론적 접근 방식은 NEM의 연구를 가능하게 할 것이다우리가 쉽게 동시에 여러 환경 조건을 제공 할 수있는 실시간 솔루션 atodes. 이 문제는, 종래의 현미경 이미징 기반 기법을 이용하여 해결하는 것이 어렵다. 우리는 우리가 locomotory 동작 검사뿐만 아니라, 다양한 환​​경 조건에 응답하여 운동을 변경하는 선충의 기능을 결정하기 위하여 수층 내의 선충을 배치 할 수 있도록 화상 기술을 개발했다. 단일 파장 그림자 영상 (SWSI)은 기존 현미경의 단점을 해결하기 위해 처음으로이 논문에서 제시된다. 기존의 현미경은 깊이 5,6에서 수평 초점면 몇 미크론에 종을 관찰 할 수 제한됩니다. 단파장 연구에 대하여, 가장 전통적인 현미경은 매우 광범위 전형적 50-100 nm의 백색광을 필터링하는 컬러 필터를 사용한다. 기호를 유지하면서 SWSI 위해 레이저를 사용하여 1 미만 nm의 파장 선택 좁아ificant 빛의 강도 7. 마찬가지로, 단일 파장의 C. 수영 주파수를 측정하기 위하여 사용되어왔다 실시간으로 8 엘레. 우리의 방법의 제 시연을 위해, 우리는 C. 자유롭게 수영의 수평 위치 x, 수직 위치 y를 모니터링 에 대한 센티미터의 거리에 물 열의 엘레. 중력은 또한 수직으로 작용 이후 특히, 수직 이동에 관심. 이 수층에 하강으로 수직으로 선형 피팅의 기울기는 선충류의 수직 속도 V의 Y를 준다 : <img alt="공식" fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" /> (1) 루트 의미 오류 (RMSE) 9의 광장은 적합의 품질을 표시하고 하강 속도는 일반적으로 일정한인지 여부를 나타냅니다. 수직 속도는 다음 EAC에 대한 평균을H 종과 죽은 벌레. 이러한 결과를 이용하여, 웜 경험이 추정 될 수 드래그. 우리의 방법의 두 번째 데모를 위해, 우리는 C를 선택 관찰 된 벌레의 대다수와는 달리 일정한 속도로 하강하지 않았다 엘레. 선택한 벌레는 돌아 서서 위쪽으로 수영이나 하강을 계속하기 전에 잠시 동안 공중 선회 하나. 물리적으로,이 사례 연구는 수영 미생물의 추력 계산 될 수 있음을 보여주고있다. 뉴턴의 법칙은 방향을 변경하는 몸이 순 힘을 의미하는 가속 것을 지시, <img alt="포뮬러 1" fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" /> 그 본체 (10)에 작용하는 것입니다 : <img alt="화학식 2" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" /> (2) 어디에 <img alt="피" fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" /> 입니다선형 모멘텀 t는 시간이다. 웜의 질량은 일정하게 유지 이후 웜의 가속도가 웜에 작용하는 힘에 직접 비례한다. 결과적으로, 수직 총 힘이다 : <img alt="화학식 3" fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" /> (3) M은 웜의 질량이며, y는 수직 가속도를 나타냅니다. 수직 방향의 총 힘은 동일한 방향으로 웜 추력을 나타낸다. 전체 추력 고려 수평 성분을 취함으로써 계산 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>조정 가능한 헬륨-네온 레이저&nbsp;</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>543 nm와 633 nm 사이에서 4개의 파장을 선택할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2 전면 알루미늄 미러</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>고속 Exilim 카메라</td><td>Casio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>쿼츠 큐벳</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (소프트웨어)</td><td>버니어</td><td></td><td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td></tr> <tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>http://www.wolfram.com/</td></tr><tr><td>5x-10x 가변 줌 갈릴레이 빔 익스팬더</td><td>Thorlabs</td><td>BE05-10-A</td><td></td></tr><tr><td>포지티브 초점 거리가 75mm인 플라노 볼록 렌즈</td><td>Thorlabs</td><td>LA1257</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 파장 그림자 영상<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 로코 모션을 포함하여 강제 추정

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

이 연구는 위치, 속도, 가속도와 빛의 단일 파장에 대한 응답으로 물기둥에 현탁 선충의 locomotory 행동에 관여 힘과 같은 물리적 특성의 측정을 수있는 저렴하고 간단한 기술을 보여줍니다. 우리는 두 가지 예를 이용하여 단일 파장 그림자 영상 (SWSI)를 사용하여 미세 유기체의 운동력을 평가하는 방법을 설명한다. 첫 번째 예는 C.의 평균 하강의 체계적이고 통계적으로 가능한 연구 결과입니다 물기둥의 엘레. 이 연구를 위해, 우리는 삶과 죽음 야생형 C를 사용 우리가 중력장 내에서 죽은 벌레의 수동 하강과 선충 활성 움직임의 속도와 방향을 비교했을 때 엘레.,이 연구는 하강 배의 차이를 보여 주었다. 평균 하강 일관된 파장 633 nm를 사용하여 두 라이브 죽은 벌레 0.1 mm / 초 ± 1.5 mm / 초였다빛. 두 번째 예는 일부 개별 C의 사례 연구입니다 엘레 수직 물기둥의 하강시 방향을 변경. 가속도와 힘이 예에서 분석된다. 이 사례 연구는 전통적인 현미경으로 액세스 할 수없는 환경에서 단일 파장을 사용하여 동작을 평가하는 동안 SWSI을 사용하여 평가 될 수있는 다른 물리적 특성의 범위를 보여준다. 우리가 각각의 선충을 잡은이 분석을 사용하여 28 윈 초과하는 힘으로 밀어 붙일 수있다. 우리의 연구 결과는 켜거나 중력장에 이동할 때 사는 선충 (28) 윈을 발휘 나타냅니다. 연구 결과는 또한 선충 수동적 물기둥에 내려하는 것이 좋습니다,하지만 적극적으로 주로 회전 방향으로 중력의 힘을 저항 할 수있다.

꾸준한 하강 첫 번째 조사는 C.의 하강 속도에 구별 할 수있는 차이를 보여줍니다 SWSI 633 nm ()을 사용하는 동안 엘레. 하강 속도는 살아있는 자와 죽은 C. 모두 0.1 mm / 초 ± 1.5 mm / s의 속도로 일정하게 발견되었다 엘레. 50 벌레의 표본 크기는 생활과 죽은 벌레 모두 7 %의 합리적인 분산을 생성합니다. 드래그 력이 중력 마이너스 부력 같도록 하강 속도가 일정하기 때문에 웜에 작용 제공된 가속은 없다. 이것은 웜의 밀도가 물보다 약간 더 큰 것을 의미한다; 그러나, 아래의 추정에 대한 선충의 밀도가 대략 그 물이라고 가정 여전히 실용적입니다. 변화 방향 두 번째 조사, 사례 연구, 선충 방향을 변경 할 수 있으며에 대해 위쪽으로 수영을 할 수 있음을 보여줍니다중력. 그 곡선의 두 번째 유도체는 시간에 대한 가속도 (그림 5)를 그래프로 스플라인 될 수 있도록 두 개의 곡선은 선충의 수직 변위에 장착되었다. &#160; 그것은 좋은 착용감을 유지하면서 가능한 한 낮은 다항식의 순서를 유지하는 것이 좋습니다. 낮은 다항식 차수는 시간이 지남에 따라 가속 적은 변화를 나타냅니다. 다항식의 순서가 너무 높은 경우에 더 높은 차수의 다항식 문구는 무시할, 따라서 불필요 할 것이다. 이 웜은 2 ± 0.002 mm / 초 2, 돌아 서서 곧 끝날 때까지 같은 속도 0.110 mm / 초 2 ± 0.002 mm / 초 2에 가속 0.110 mm / sec의 일정한 속도로 감속 돌아 오는 지점. C. 가속도가 제로로 떨어질 때까지 mm / 초 2 0.00708 t - 엘레는 1.252의 감소 가속 위쪽으로 이동하고 있습니다. 마음의 식에 유지. 3, 3 &amp; 위 잡은 웜 질량956, G, 웜은 곧 돌아 오는 지점이 끝날 때까지 0.33 PN의 수직 순 힘, F 뉴욕을 겪는다. 하강 : 중력, 드래그, 부력과 추력 (그림 6a) : 웜이 돌아 오는 지점에 도달 할 때까지 웜에 작용하는 힘의 세 가지 종류가 있습니다. 순 힘은 세 가지 힘의 벡터 합 같습니다. 여기에서 우리는 수직 구성 요소 만 고려 F 뉴욕 = F 다이 + F TY-F의 G + F B (4) F B는 부력이다. F G 크기가 동등하지만, 웜의 밀도가 물이 있다고 가정 부력에 대한 방향과 반대이다. 식. 도 4는 다음 방식으로 쓰여질 수있다 : F 뉴욕 = F 다이 + F 타이 (5) F 뉴욕 하강하는 동안 일정하게 유지된다. 이말의 의미는선충이 돌아 오는 지점에 도달 할 때까지 F 다이 + F 타이는 일정하게 유지된다. F 다이는 경로의 시작이다 상단에서 규모이고, 속도가 턴어라운드 점에서 제로가 될 때까지 점차적으로 제로로 감소하면서 F 타이 F 뉴욕 일정하게 유지하기 위해 증가해야합니다. 턴어라운드 : 수직 속도는 그 시점에서 0 인 이후 턴어라운드 점에서 연직 방향에 드래그 력은 없다. 도 6b에 도시 된 바와 같이, F의 g, 부력, F 및 B 수직 웜 추력 F 타이 - 수직 방향으로 작용하는 유일한 힘은 중력이다. 이때, C.의 추력 엘레가 결정될 수있다 : F = F 타이 뉴욕 (6) 궤도의 아래쪽에 추력은 웜의 무게의 약 0.001 %로 0.33 PN, 대략 동일하다. 고려해당 계정 예상 무게, C.의 F를 들어 엘레는 28 윈입니다 상승 : 마찬가지로, 상승, 드래그 증가하지만, 아래로 지적된다 (그림 6C) 중 : F 뉴욕 =-F 다이 + F 타이 (7) 웜에 의해 구현되는 추력은 이제 더 큰 수와 항력의 합 무게와 동일해야합니다. 이 웜은 최대 수영을 시작 후 감속된다. 웜이 내려와 같은 속도로 최대 수영을하기 위해, 웜은 두 배 이상 무게의 상향 추진력을 발휘해야 할 것입니다. 유혹 약 3 초간의 하강 속도가 느려 웜의 예는 그림 7에 제시되어있다. &#160; 3 차 다항식은 전체 경로에 대한 합리적인 적합합니다. 이 적합에서 가속 및 속도의 오차는 15 % 미만이다. 이 웜은 중요한 upwa 시작RD의 추력, 속도가 느려 68 초에 흑자 전환을 시작합니다; 그러나, 상승 가속이 계속 감소한다 (도 8) &#160; 그물 가속 제로 68.5 초 정도에 달할 때까지. 이것은 결국 속도의 또 다른 영점 다음에 아래 방향으로 그물 가속도로 연결합니다 (그림 9) &#160; 그리고 선충은 69 초에 다시 하강하기 시작한다. 또한이 경우의 최대 관찰 수직 가속도가 2.7 mm / 초 2 것이 흥미 롭다. 터닝 포인트의 가속 / 초 2 0.455 mm와 있습니다 - 각각 0.455 mm / 초 2; 돌아 서서까지 수영 선충의 경우보다 약 4 배 더. 식을 사용. 6, 그것은 상향 추력 제 전환점에서 약 1.32 PN임을 추정 할 수있다. 위쪽으로 추력이 1.32 PN되도록 제 전환점에서, 넷 가속도는 음이다. O : 유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" /> 그림 1. 실험 설정. 레이저 빔 확장기, 렌즈와 화면이 실험 장치에 필수적이다. 조향 거울 및 핀홀은 생략 될 수도 있지만, 광 배향 덜 안정 할 것이다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" /> 그림 2. 단일 파장 그림자 이미지 (SWSI). 543 nm의 레이저 빛의 2 mW의 웜의 그림자를 사용하여이 화면에 투사됩니다. 선충은 위쪽으로 떨어 나타나도록 이미지가 반전됩니다. 424/51424fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg &quot;/&gt; 하나의 야생형 C. 그림 3. 수직 하강 물 열에서 엘레는.이 선충은 633 nm의 일관된 빛에 의해 그림자가되었다. 선형 피팅의 기울기는 0.01 mm / 초 ± 1.09 mm / sec의 하향 속도를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" /> 그림 4. 하나의 상향 수영 야생형 C.의 변위 그래프 엘레. 두 스플라인 적합은 선충의 전체 경로를 추적. 적합의 두 번째 유도체 가속을 보여준다. 0.110 mm : 최대 가속은 쉽게 첫 번째 맞는 결정된다<html> / 초 2 ± 0.002 mm / 초 2. 데이터 포인트와 맞게 계속 볼 수 있도록 단지 몇 오차 막대가 표시됩니다. 이 선충이 633 nm의 일관된 빛에 의해 그림자가되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" /> 하나의 야생형 C.의 그림 5. 가속 그래프 엘레.이 선충은 천천히하고 위쪽으로 이동하는 원인이 0.110 mm / 초 2 ± 0.002 mm / 초 2의 지속적인 상승 가속을 유지합니다. 곧 턴어라운드 시점 이후의 가속은 꾸준히 감소하고 순 가속도 0으로 감소한다.<html> G &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" /> 이러한 힘의 효과가 서로 상쇄되도록 포인트 상승. 부력과 중력을 선회 하강 그림 6. 강제 다이어그램, 방향 크기와 반대에서 동일하다. 그들은 따라서이 다이어그램에 표시되지 않습니다. () 웜은 드래그 앤 트러스트 가리키는으로 하강한다. (B) 웜은 드래그하지 않고 궤도의 낮은 지점에있다. 추력 가리키는입니다. (C) 웜은 추력 가리키는 동안 드래그 방향이 아래 오름차순입니다. &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg &quot;/&gt; 그림 7. 하나의 유혹 선충의 변위 그래프. 웜 속도가 느려 약 68 초에서 턴어라운드가 시작하지만 주변에 69 초를 내림차순으로 시작합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" /> .. 그림 8 단일 유혹 선충의 가속 그래프이 웜은, 2.7 mm / 초 2의 상승 가속 시작 제로로 감소하고 궁극적으로의 가속도는가 -. 2.6 mm / 초 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">큰 적이있는를 보려면 여기를 클릭하세요</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" /> 그림 9. 하나의 유혹 선충의 속도 그래프.이 웜은 68 초에서 멈출 때 위쪽으로 머리를 시작하고, 속도가 느려집니다 및 하강에 따라 69 초에서 수직 방향으로 0의 속도에 도달합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">를 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="표 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" /> N2 C. 표 1. 평균 하강 속도 엘레. 라이브 50 50 죽은 선충은 부엌이있다자신의 하강시 acked. 하강의 평균 속도는 살아있는 자와 죽은 벌레를 동일합니다 : 0.1 mm / 초 ± 1.5 mm / 초.

여기에 제시된 기술은 자유롭게 단일 파장의 노출을 사용하여 미세한 종 수영의 경로를 측정한다. C. 엘레은 비용이 많이 드는 현미경에 저렴한 대안으로 그림자 영상을 보여주기 위해 사용된다. 이 기술은 방향, 속도, 가속도 및 힘을 측정하기 위하여 다양한 방향, 환경 및 종을 수용하도록 구성 될 수있다.

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

이 절차의 전반적인 목표는 가간섭성 단색 방사선을 사용하여 자유롭게 수영하는 선충의 수직 경로 속도와 가해지는 힘을 측정하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 자유롭게 수영하는 C. elegans를 위한 가간섭성 단색 그림자 실험 장치를 설정함으로써 수행됩니다. 그 후, 개별 성체 C. elegans를 그림자 실험 관찰 챔버인 vet에 넣습니다.레이저 빔을 통과하며 하강하는 벌레의 그림자를 영상으로 기록하고, 이 영상을 통해 동물의 움직임을 분석합니다. 이를 통해 자유롭게 헤엄치는 선충의 경로와 그에 따라 발생하는 힘을 결정합니다. 수평면에서의 전통적인 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 저렴한 비용으로 광범위한 단색광을 사용하여 자유롭게 헤엄치는 미생물의 운동을 조사할 수 있다는 점입니다.이 방법은 액체 환경에서 선충에 의해 생성되거나 선충이 반응하는 힘에 관한 핵심 질문들에 답할 수 있습니다. 저희는 미세 생물 종의 수직 이동에 관한 아이디어를 처음 탐구하기 시작했을 때 이 방법의 개념을 처음 구상했습니다. 레이저 정렬을 정확하게 맞추는 데 어느 정도 연습이 필요하며, 그로 인해 절차적 단계를 습득하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.또한, 생물학 실험실에서 벌레를 준비하는 방법과 섀도우 이미지를 생성하기 위한 실험 장치를 구성하는 방법을 익힐 시간이 필요합니다. 두 개 이상의 거울을 사용하여 헬륨 네온 레이저를 갈릴레이 빔 확장기로 유도하여 빔 크기를 12 millimeters로 확대하십시오. 확장기 이후의 빔 경로에 하나 또는 두 개의 핀 홀을 배치하여 정렬 상태를 확인하십시오.빔을 장착된 석영 Q vet으로 유도합니다. 빔이 통과한 후, 초점 거리가 +75 millimeters인 플라노 볼록 렌즈를 사용하여 Q vet이 이를 확대합니다. 그런 다음 최적의 해상도 거리인 렌즈로부터 약 120 centimeters 떨어진 곳에 스크린을 배치합니다.Q vet 옆과 같이 스크린을 촬영할 수 있는 위치에 고속 카메라를 배치하십시오. 벌레를 선택하기 위한 실체 현미경 또한 qve 근처에 두어야 합니다. 카메라 시야의 가장자리 근처, 스크린의 QVAD 홀더 중앙에 밀리미터 단위가 표시된 투명 자를 임시로 고정하십시오.자(ruler)의 눈금을 사용하여 1mm에 해당하는 스케일 거리를 표시하십시오. QV의 색수차로 인한 굴절 차이와 앞서 설명한 배율 변화가 발생하므로, 사용된 각 파장마다 이 작업을 수행하십시오. JoVE 영상에서는 성체 초기 단계의 선충이 qve를 위해 준비되어 있습니다.또한 클로로포름 노출로 사멸시킨 선충을 준비합니다. 먼저 Q Vet의 가장자리에서 1 mm 높이까지 증류수를 채웁니다. 실내 조명을 켠 상태에서 녹화를 시작하여 화면의 선이 처음에 보이게 한 다음, 실내 조명을 끕니다.그런 다음 백금선 픽으로 선충을 채집합니다. 배지를 흔들지 않고 픽을 수면에 살짝 접촉시켜 선충을 vet에 넣는 것이 중요합니다. 선충과 수층의 투영 이미지는 반전되어 나타납니다.중력 방향으로 내려가는 벌레들은 화면상에서 위로 이동하는 것처럼 보일 것입니다. 각 벌레당 약 20초 동안 기록하며, 조건당 약 50마리의 벌레를 기록하십시오. 먼저, 비디오 분석 프로그램으로 영상을 불러옵니다.비디오의 길이 표시를 사용하여 배율을 설정하십시오. 그런 다음 그림자가 진 선충 머리의 선형 변위를 추적하기 시작하십시오. 이동 경로를 따라 약 0.3초 간격으로 최소 10개의 데이터 포인트를 선택하십시오.수직 속도는 미분값을 배율 인자로 나누어 계산합니다. 중력은 수직 방향으로만 작용하므로, 수평 변위와 수직 변위에 대해 각각 별도의 곡선을 생성하는 것이 매우 중요합니다.데이터 포인트들이 대체로 직선을 형성하면 경로가 선형인 것입니다. 약간의 머리 움직임 편차는 무시할 수 있습니다. 다음으로, 분석 메뉴에서 데이터에 직선을 맞추어 선형 회귀선을 생성합니다.직선의 기울기는 벌레의 수직 이동 속도를 나타냅니다. 벌레가 비선형으로 이동하는 경우, 분석 메뉴에서 곡선 피팅(curve fit)을 선택하십시오. 그 다음, 곡선을 2차 또는 3차 식으로 피팅하십시오.경로 내 각 곡선에 대한 다항식을 사용하여 데이터에 곡선을 피팅합니다. 그래프 양측의 브래킷을 슬라이드하면 곡선의 수학적 표현식이 표시됩니다. 여기서는 최대 15%의 상대 오차까지 허용됩니다.데이터 지점을 모두 포함할 수 있도록 필요한 만큼 곡선을 추가하고, 함수를 스플라인(spline) 처리하십시오. 곡선 피팅은 서로 겹치는 지점에서 동일한 기울기를 가져야 합니다. 곡선의 1차 및 2차 도함수를 통해 속도와 가속도를 구할 수 있습니다.추력은 벌레의 표류 시 질량을 3 µg으로 설정하여 계산하였습니다. 살아있는 C. elegans와 죽은 C. elegans의 하강 속도 사이에는 뚜렷한 차이가 없었으며, 두 경우 모두 하강 표류 속도는 1.5 mm/s였습니다. 그러나 살아있는 선충은 방향을 바꾸고 중력에 대항하여 수영할 수 있으므로, 선충의 수직 변위에 곡선을 맞춘 후 그 이계도함수로부터 가속도를 계산하였습니다.벌레가 회전 지점에 도달할 때까지 벌레에 작용하는 힘은 중력, 항력, 부력 및 추진력입니다. 알짜힘은 이들의 벡터 합과 같습니다. 수직 힘 성분을 고려하십시오.벌레의 밀도가 물과 거의 비슷하다고 가정하면 중력의 크기는 부력과 같으므로, 회전 지점까지 방정식은 단순화될 수 있습니다. 항력과 추진력의 합은 일정합니다. 초기에는 항력이 더 크지만 점차 0으로 감소하며, 회전 지점에서는 추진력이 증가합니다. 벌레가 이동하는 동안 수직 항력은 없으며 추진력은 위쪽을 향합니다.수직 상승 항력은 아래 방향으로 증가하므로, 추력은 항력과 무게의 합보다 커야 합니다. 이 벌레의 비선형 경로를 분석한 결과, 방향이 변경되었습니다.변위를 살펴보면, 68초에 속도가 감소하며 회전하기 시작했습니다. 하지만 상향 가속도는 68.5초에 순 가속도가 0이 될 때까지 계속해서 감소했습니다. 그 후, 다시 하강하기 위해 음의 방향으로 가속하기 시작했습니다.따라서 속도가 0일 때, 벌레는 1.32 Pico newton으로 계산된 상당한 상향 추진력을 가졌습니다. 이 기술을 숙달하면 벌레를 오거(auger)에서 집어낼 준비가 된 경우 10분 이내에 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 비디오 분석 프로그램에서 프레임 속도를 조정해야 하므로 수집하는 모든 데이터에 대해 카메라 녹화 속도를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 수직 및 수평 등 다양한 방향으로 어떤 힘이 가해지는지와 같은 질문에 답하기 위해 단일 파장 연구와 같은 다른 연구들을 수행할 수 있습니다.예를 들어, 이 광학 기술은 원생동물(Protists)이나 다른 수생 동물과 같은 소형 생물의 이동 특성에 관심이 있는 다른 생물학자들도 활용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 섀도우 이미지(shadow images)의 확대와 비디오 분석 프로그램을 사용하여 자유롭게 수영하는 미생물의 운동을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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공학

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