단일 파장 그림자 영상

이 절차의 전반적인 목표는 가간섭성 단색 방사선을 사용하여 자유롭게 수영하는 선충의 수직 경로 속도와 가해지는 힘을 측정하고 평가하는 것입니다. 이는 먼저 자유롭게 수영하는 C. elegans를 위한 가간섭성 단색 그림자 실험 장치를 설정함으로써 수행됩니다. 그 후, 개별 성체 C. elegans를 그림자 실험 관찰 챔버인 vet에 넣습니다.

레이저 빔을 통과하며 하강하는 벌레의 그림자를 영상으로 기록하고, 이 영상을 통해 동물의 움직임을 분석합니다. 이를 통해 자유롭게 헤엄치는 선충의 경로와 그에 따라 발생하는 힘을 결정합니다. 수평면에서의 전통적인 현미경 관찰과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 저렴한 비용으로 광범위한 단색광을 사용하여 자유롭게 헤엄치는 미생물의 운동을 조사할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 액체 환경에서 선충에 의해 생성되거나 선충이 반응하는 힘에 관한 핵심 질문들에 답할 수 있습니다. 저희는 미세 생물 종의 수직 이동에 관한 아이디어를 처음 탐구하기 시작했을 때 이 방법의 개념을 처음 구상했습니다. 레이저 정렬을 정확하게 맞추는 데 어느 정도 연습이 필요하며, 그로 인해 절차적 단계를 습득하기 어렵기 때문에 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

또한, 생물학 실험실에서 벌레를 준비하는 방법과 섀도우 이미지를 생성하기 위한 실험 장치를 구성하는 방법을 익힐 시간이 필요합니다. 두 개 이상의 거울을 사용하여 헬륨 네온 레이저를 갈릴레이 빔 확장기로 유도하여 빔 크기를 12 millimeters로 확대하십시오. 확장기 이후의 빔 경로에 하나 또는 두 개의 핀 홀을 배치하여 정렬 상태를 확인하십시오.

빔을 장착된 석영 Q vet으로 유도합니다. 빔이 통과한 후, 초점 거리가 +75 millimeters인 플라노 볼록 렌즈를 사용하여 Q vet이 이를 확대합니다. 그런 다음 최적의 해상도 거리인 렌즈로부터 약 120 centimeters 떨어진 곳에 스크린을 배치합니다.

Q vet 옆과 같이 스크린을 촬영할 수 있는 위치에 고속 카메라를 배치하십시오. 벌레를 선택하기 위한 실체 현미경 또한 qve 근처에 두어야 합니다. 카메라 시야의 가장자리 근처, 스크린의 QVAD 홀더 중앙에 밀리미터 단위가 표시된 투명 자를 임시로 고정하십시오.

자(ruler)의 눈금을 사용하여 1mm에 해당하는 스케일 거리를 표시하십시오. QV의 색수차로 인한 굴절 차이와 앞서 설명한 배율 변화가 발생하므로, 사용된 각 파장마다 이 작업을 수행하십시오. JoVE 영상에서는 성체 초기 단계의 선충이 qve를 위해 준비되어 있습니다.

또한 클로로포름 노출로 사멸시킨 선충을 준비합니다. 먼저 Q Vet의 가장자리에서 1 mm 높이까지 증류수를 채웁니다. 실내 조명을 켠 상태에서 녹화를 시작하여 화면의 선이 처음에 보이게 한 다음, 실내 조명을 끕니다.

그런 다음 백금선 픽으로 선충을 채집합니다. 배지를 흔들지 않고 픽을 수면에 살짝 접촉시켜 선충을 vet에 넣는 것이 중요합니다. 선충과 수층의 투영 이미지는 반전되어 나타납니다.

중력 방향으로 내려가는 벌레들은 화면상에서 위로 이동하는 것처럼 보일 것입니다. 각 벌레당 약 20초 동안 기록하며, 조건당 약 50마리의 벌레를 기록하십시오. 먼저, 비디오 분석 프로그램으로 영상을 불러옵니다.

비디오의 길이 표시를 사용하여 배율을 설정하십시오. 그런 다음 그림자가 진 선충 머리의 선형 변위를 추적하기 시작하십시오. 이동 경로를 따라 약 0.3초 간격으로 최소 10개의 데이터 포인트를 선택하십시오.

수직 속도는 미분값을 배율 인자로 나누어 계산합니다. 중력은 수직 방향으로만 작용하므로, 수평 변위와 수직 변위에 대해 각각 별도의 곡선을 생성하는 것이 매우 중요합니다.

데이터 포인트들이 대체로 직선을 형성하면 경로가 선형인 것입니다. 약간의 머리 움직임 편차는 무시할 수 있습니다. 다음으로, 분석 메뉴에서 데이터에 직선을 맞추어 선형 회귀선을 생성합니다.

직선의 기울기는 벌레의 수직 이동 속도를 나타냅니다. 벌레가 비선형으로 이동하는 경우, 분석 메뉴에서 곡선 피팅(curve fit)을 선택하십시오. 그 다음, 곡선을 2차 또는 3차 식으로 피팅하십시오.

경로 내 각 곡선에 대한 다항식을 사용하여 데이터에 곡선을 피팅합니다. 그래프 양측의 브래킷을 슬라이드하면 곡선의 수학적 표현식이 표시됩니다. 여기서는 최대 15%의 상대 오차까지 허용됩니다.

데이터 지점을 모두 포함할 수 있도록 필요한 만큼 곡선을 추가하고, 함수를 스플라인(spline) 처리하십시오. 곡선 피팅은 서로 겹치는 지점에서 동일한 기울기를 가져야 합니다. 곡선의 1차 및 2차 도함수를 통해 속도와 가속도를 구할 수 있습니다.

추력은 벌레의 표류 시 질량을 3 µg으로 설정하여 계산하였습니다. 살아있는 C. elegans와 죽은 C. elegans의 하강 속도 사이에는 뚜렷한 차이가 없었으며, 두 경우 모두 하강 표류 속도는 1.5 mm/s였습니다. 그러나 살아있는 선충은 방향을 바꾸고 중력에 대항하여 수영할 수 있으므로, 선충의 수직 변위에 곡선을 맞춘 후 그 이계도함수로부터 가속도를 계산하였습니다.

벌레가 회전 지점에 도달할 때까지 벌레에 작용하는 힘은 중력, 항력, 부력 및 추진력입니다. 알짜힘은 이들의 벡터 합과 같습니다. 수직 힘 성분을 고려하십시오.

벌레의 밀도가 물과 거의 비슷하다고 가정하면 중력의 크기는 부력과 같으므로, 회전 지점까지 방정식은 단순화될 수 있습니다. 항력과 추진력의 합은 일정합니다. 초기에는 항력이 더 크지만 점차 0으로 감소하며, 회전 지점에서는 추진력이 증가합니다. 벌레가 이동하는 동안 수직 항력은 없으며 추진력은 위쪽을 향합니다.

수직 상승 항력은 아래 방향으로 증가하므로, 추력은 항력과 무게의 합보다 커야 합니다. 이 벌레의 비선형 경로를 분석한 결과, 방향이 변경되었습니다.

변위를 살펴보면, 68초에 속도가 감소하며 회전하기 시작했습니다. 하지만 상향 가속도는 68.5초에 순 가속도가 0이 될 때까지 계속해서 감소했습니다. 그 후, 다시 하강하기 위해 음의 방향으로 가속하기 시작했습니다.

따라서 속도가 0일 때, 벌레는 1.32 Pico newton으로 계산된 상당한 상향 추진력을 가졌습니다. 이 기술을 숙달하면 벌레를 오거(auger)에서 집어낼 준비가 된 경우 10분 이내에 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 비디오 분석 프로그램에서 프레임 속도를 조정해야 하므로 수집하는 모든 데이터에 대해 카메라 녹화 속도를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차를 통해 수직 및 수평 등 다양한 방향으로 어떤 힘이 가해지는지와 같은 질문에 답하기 위해 단일 파장 연구와 같은 다른 연구들을 수행할 수 있습니다.

예를 들어, 이 광학 기술은 원생동물(Protists)이나 다른 수생 동물과 같은 소형 생물의 이동 특성에 관심이 있는 다른 생물학자들도 활용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 섀도우 이미지(shadow images)의 확대와 비디오 분석 프로그램을 사용하여 자유롭게 수영하는 미생물의 운동을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.