Name: 유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 인간 뇌 혈관 주위 세포를 유도 신경 세포로 직접 전환하는 방법을. Sox2와 Ascl1 레트로바이러스 벡터를 사용하여 뇌 내재 세포를 재프로그래밍하고 신경 마커로 확인하는 이 기법은 뇌 손상 치료에 새로운 가능성을 제시합니다.

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우리는이 프로토콜을 개발하는 동안 그녀의 입력을위한 박사 막달레나 Götz가에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 관대 SOX2의 코딩 서열을 저희에게 제공하는 박사의 Marius Wernig (스탠포드 대학) 감사합니다. 우리는 또한 바이러스 생산을위한 박사 알렉산드라 Lepier에 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE)와 BMBF (01GN1009A) BB, 그리고 과학의 바이에른 주 정부, 연구 및 MK와 BBCS에 예술이 양국 SYSTHER-로부터받은 자금의 보조금에 의해 지원되었다 INREMOS 가상 연구소 (교육과 연구의 독일과 슬로베니아어 연방 부처) 및 DFG (SFB 824).

1. 분리 및 성인의 뇌 세포의 배양 인체 조직과 관련된 실험은 연구 목적으로 인간 재료의 사용에 관한 모든 관련 정부 기관 및 규정에 따라 수행되어야한다. 본 프로토콜은 LMU 뮌헨의 의료 학부의 윤리위원회와 모든 환자의 서면 동의서의 승인에 따라 개발되었다. 성인의 대뇌 피질의 준비 문화의이 프로토콜은 측두엽 간질 또는 기타 뿌리 깊은 비 외상성, 비 악성 병변으로 고통받는 남녀 환자의 검체를 사용하여 설립되었습니다. 따라서 뇌 병변 액세스 채널에서만 이루어지는 수술 방으로부터 얻은 조직은 건강한 여겨진다. 환자의 연령 범위는 19-70년했다. <ol><li> 열 - 불 활성화 소 태아 혈청을 첨가하여 성장 배지를 준비루타 가진 DMEM 고 글루코스 행 (FCS) 20 % FCS의 최종 농도를 얻었다. 500 ㎖의 성장 매체의 총 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다. 이것과 적절한 층류 후드에서 무균 배양 조건을 요구하는 모든 후속 단계를 수행한다. </li><li> 염화칼슘 처리 될 때까지 얼음에 HEPES (10 mM의 최종 농도) 등의 MgCl2를 (HBSS) 매체와 행크스 &#39;균형 염 용액의 수술 방에서 얻은 성인의 뇌 생검을 유지합니다. 가능한 한 빨리 처리를 시작합니다. </li><li> 65mm 페트리 접시에 조직을 전송하고 두 멸균 일회용 메스를 사용하여 작은 조각으로 말하다, 단일 세포로 분리를 시작합니다. 소화 효소를 들어 15 ML 원뿔 튜브에 3-6 ML TrypLE를 사용하고 물을 욕조에 37 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 해리를 촉진하는 예비 가온 성장 배지의 1 부피를 추가하고 온화 우선하여 상하 조직 조각을 함유하는 용액을 씹다세포 현탁액을 균질화 될 때까지 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 다음 5 ㎖ 일회용 피펫. 일반적으로, 대부분 흰색 물질로 구성된 일부 잔여 조직의 조각, 서스펜션에 남아 있습니다. </li><li> 5 분 157 XG에 스핀 다운 및 성장 매체의 적절한 양 (코팅 T75 문화 플라스크 당 10 ml)에 펠렛을 재현 탁. 크기 5 ~ 10 mm 직경의 조직 검사에 대해 하나의 T75 문화 플라스크를 사용하여 더 큰 표본의 경우이에서 추정. </li><li> 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C 배양기에 세포를 놓습니다. </li><li> 세포가 포화 상태에 도달 할 때까지 모든 3-4일 매체의 절반을 교체합니다. 이것은 일반적으로 (통로 0 [P0]라고 함) 최대 2 주가 소요됩니다. </li></ol> 성인의 뇌 세포의 2. 체외 확장 및 특성 <ol><li> 체외 확장의 : <ol><li> 문화 매체를 기음과 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세척, 방 t에서 유지온도계 수, 3 ㎖의 TrypLE를 추가하기 전에. </li><li> 세포의 대부분이 분리 될 때까지 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 부드럽게 세포의 리프팅을 용이하게하기 위해 플라스크를 살짝; 성장 배지 중에서 볼륨을 첨가 한 다음, 15 ㎖의 원뿔형 튜브에 세포를 전송하고 5 분 동안 157 XG에 스핀 다운 및 성장 배지의 적절한 양으로 세포를 재현 탁. </li><li> 통로 새로운 T75 세포 배양 플라스크에 최적 수율 1:3 세포. 참고 :이 감소 프로그래밍 효율의 흔적없이 P5 때까지이 세포를 계대 배양했다. 문화가 내피 세포의 상당한 부분을 (CD34 발현에 의해 평가)가 포함 P0에있는 동안, 다음 구절에 자신의 번호가 무시됩니다. </li></ol></li><li> 성인의 뇌 문화의 특성 : <ol><li> 면역 세포 화학 : <ol><li> 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 유리 위에 세포, 씨 ~ 60,000 세포의 특성을 500 ㎕의 신선한 성장 mediu에 미끄러 져24 잘 조직 배양 접시에있는 m와 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 배양 된 인간의 뇌 세포의 면역 세포 화학 분석 배지를 제거하고 PBS 1 ㎖로 3 회 세척 하였다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 PBS 중 4 % 파라 포름 알데히드 500 ㎕를 첨가하여 세포를 고정한다. </li><li> 커버 유리가 적절한 가습 염색 챔버에 미끄러 져 이동하고 80 ㎕의 PBS 실온에서 1 시간 동안 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 블록. </li><li> 동일한 솔루션에 희석 차 항체 (희석 요인이 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오) 추가하고 실온에서 4 ° C에서 또는 1 시간에서 밤새 품어. 주 : 배양이 단계에서 세포의 상당하지만, 다른 부분은 (PDGFRβ) 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β에 대한 면역 반응하고, 차별화 146 (CD146), NG2 콘드로이틴 황산 proteo의 클러스터글리 칸, 평활근 액틴 (SMA), 미세 혈관 관련 혈관 주위 세포의 특성 즉, 마커. 단지 소수 (&lt;1 %)이 astroglial 마커 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP)과 S100β을 표현한다. 또한,이 단계에서의 문화는 신경 세포 마커 βIII-튜 불린을 표현하는 세포의 결여해야한다. 다른 마커의 공동 표시에 대해 여러 차 항체의 조합을 사용합니다. 아교 세포, 신경 세포, 내피 세포 및 혈관 주위 세포 마커의 발현의 추가의 확인은 역전사 (이 프로토콜에서 설명하지 않음) 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응에 의해 얻을 수있다. </li><li> 함께 배양 한 다음 차 항체는 1 ml의 PBS로 3 회 세척하고 염색 용액에 (적절한 희석에) 해당 보조 항체를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간을 품어. 세포를 PBS로 3 배 씻으십시오. 필요한 경우, 이전 설치에 방에서 5 분 DAPI로 염색을 포함온도. </li><li> 설치 매체를 antifading 사용하여 표면 형광 현미경이나 공 초점 현미경을 사용하여 커버 전표를 분석합니다. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법 : <ol><li> 유동 세포 계측법을 사용하여 표면 마커의 발현 분석을 위해, 코팅 T25이나 T75 세포 배양 플라스크에 포화 상태로 세포를 성장. </li><li> PBS + 0.5 % BSA로 구성된 염색 용액에 전후에 resuspend 바와 같이 TrypLE를 사용하여 세포를 분리. 염색 반응에 대해, 염색 용액 100 μL에 100,000-200,000 세포를 재현 탁. (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, 각각의 이소 제어 항체)를 사용 항체 당 하나의 염색 반응을 준비합니다. </li><li> 직접 세포 현탁액에 (희석 특정 시약 및 장비의 표를 참조하십시오) 각 염색 용액에 형광 색소 - 복합 항체를 추가하고 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. </li><li> 500 ㎕의 PBS로 세포를 세 번 세척하고 각각의 사이에 스핀 다운5 분 157 XG에 세척 단계. </li><li> FACS 튜브에 세포 고사 (70 μM)를 통해 0.5 ml의 염색 액에 전사 세포에서 세포 펠렛을 재현 탁. 빛에 노출 샘플을 보호합니다. </li><li> 이전 FACS 악기에 배치에 소용돌이 샘플. </li><li> 살아있는 세포를 분석하고 파편과 세포 집합체, FSC-A에 대한 게이트와 SSC-A를 제외합니다. 휴대 duplets은 특히 FSC-A와 FSC-W에 의해 문이 있습니다. 각각의 형광 색소에 접합 이소 일치 항체 제어 게이트를 설정 세포 표면 마커에 대한 올바른 게이트 조건을 결정합니다. 그런 항체 바인딩 세포의 비율을 결정합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 정렬 형광 활성화 된 세포에 의한 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포 3. 심화 <ol><li> FACS는 70 μm의 노즐을 사용하여 선별을 통해 이전에 형질 도입 (성장 배지에 재현 탁) 주연 세포 세포 집단을 정제. C와 함께 CD34-APC를 사용D140b-PE와 CD146-FITC는 혈관 주위 세포에 선택합니다. CD34 음성, CD140b-, 및 CD146-양성 세포에 대한 정렬. </li><li> 24 잘 조직 배양 플레이트에서 미끄러 져 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 덮개에 성장 매체와 플레이트에 정렬 된 세포를 수집하고 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 정렬 후 48 시간 신선한 성장 매체와 매체를 교체하고 프로토콜 4에 설명 된대로 전달을 수행합니다. </li></ol> 4. 레트로 바이러스 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 형질 도입 및 유도 신경 세포로 재 프로그램 참고 : 레트로 바이러스 입자를 처리하는 지역 바이오 안전성 지침을 참조하십시오. 독일에서는 여기에 사용되는 레트로 바이러스의 사용은 바이오 안전성 레벨 2가 필요합니다. 레트로 바이러스 입자의 생산이 프로토콜 6을 참조하십시오. 프로그래밍에 사용되는 레트로 바이러스 구조의 경우, Karow 등을 참조하십시오. (2012). 레트로 바이러스는 VSV-G (수 포성 구내염 바이러스-글리코와 pseudotyped했다단백질) 5. 생산 Gavrilescu 외 여러분 6을 참조하십시오. <ol><li> 이전의 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 유리 위에 레트로 바이러스 전달 씨 ~ 60,000 세포에 24 시간은 24 잘 조직 배양 플레이트에 500 ㎕의 신선한 성장 매체에 미끄러 져와 5 % CO 2 5 % O 2와 37 ° C에서 알을 품다 . </li><li> 다음날, 500 ㎕의 신선한, 데워진 성장 매체로 성장 매체를 교체하고 레트로 바이러스 입자 (제어 pCAG-IRES-DsRed를, 특히 실험실에서 프로토콜을 설정하는 동안), pCAG-ascl1을 포함하는 각각의 집중 상층 액 1 μl를 추가 pCAG-SOX2-IRES-GFP-IRES-DsRed를. </li><li> 어느 날 후, 세포에서 바이러스 입자를 포함하는 매체를 제거하고 신선한 1 ㎖를 추가, 루타 49 ML DMEM 높은 포도당과 1 ㎖의 B27의 혈청 보충으로 구성, B27-분화 매체를 데워진. 5에서 37 ° C에서 문화의 세포를 유지% CO 2와 기능이 성숙 반복 매체의 변화는 유해 해짐에 따라 매체를 변경하지 않고 4-8주 5 %의 O 2. </li></ol> 면역 세포에 의해 유도 된 신경 세포의 5. 특성 <ol><li> 형질 세포의 세포 신원을 확인하기 위해 신경 세포의 표현형의 인수를 입증 할 특히, 특정 시약의 표를 참조 항체와 각각의 희석을 위해 (예 : 빌 - 튜 불린, MAP2 및 노이 앤 등의 신경 항원에 대한 면역 세포 화학을 수행하고 장비, 2.2.1에 표시된대로) 절차를 따릅니다. </li><li> E14 마우스 대뇌 피질에서 파생 된 신경 세포와 PdiNs, 공동 문화 이들 세포의 성숙을 개선하십시오. 이를 위해, 대뇌 피질을 해부 화재 광택 유리 파스퇴르 피펫으로 기계적으로 조직을 떼어 놓다. SOX2 및 ascl1 인코딩 다시 함께 전달 다음 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포 2~3주의 문화에 10,000-50,000 쥐의 뉴런을 추가troviruses 및 배양을 계속합니다. 형질 세포는 살아있는 표면 형광 또는 GFP와 DsRed를 위해 면역 세포를 다음 중 하나를 자신의 기자 (GFP와 DsRed를) 식으로 쥐의 뉴런과 구별 할 수 있습니다. </li><li> , 쥐의 뉴런에 의해 PdiNs에 시냅스의 형성을 평가하는 등의 기공을 갖는 글루타민산 염 트랜스 포터 1 (vGluT1) 등의 기공을 갖는 신경 전달 물질 수용체에 대한 면역 형광 염색법을 수행 할 수 있습니다. </li><li> 자신의 전기적 특성 (활동 전위를 생성 즉, 능력) 및 패치 - 클램프 전기 생리학 기능적인 시냅스의 설립을위한 형질 세포를 조사. 절차에 대한 자세한 내용은을 참조하십시오 하인리히 등. (2011).에게 </li></ol>

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</ol>

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본 프로토콜은 체외 확장과 농축 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 성인 인간의 대뇌 피질에서 분리 다음과 신경성 전사의 레트로 바이러스 매개로 표현하여 기능에 후속 변환 SOX2 및 Ascl1 요인에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜은 궁극적으로 성인 뇌의 생체 설정으로이 직접 변환 방식을 번역하는 마음에서 목표로, 잠재적으로 glia의 신경에 두뇌 상주 세포의 혈통 변환 등을 연구하기 위해 체외 시스템에서 실험을 제공합니다. 기술적 고려 사항 우리의 연구에서 우리는 남녀 모두에서, 19 ~ 70 세 사이의 환자에서 인간의 뇌 조직을 이용했다. 우리는 성별이나 연령 7에 따라 프로그램을 다시 만들 효율의 명백한 차이를 통지하지 않았다. 그럼에도 불구하고 그것은 미묘한 차이가있을 수 있습니다 그럼에도 불구하고이 정보를 문서화하는 것이 좋습니다우리의 관심을 탈출 한...

다시 분화 가능성의 과다 부여하는 유도 만능 줄기 세포로 체세포 (유도 만능), 프로그래밍과 달리, 직접 프로그래밍은 다른에 하나의 특정 세포 유형의 연속 변환을 위해 목표로하고있다. 질병 모델링 및 잠재적 인 세포 기반 치료의 맥락에서 자신의 응용 프로그램에 대해, 모두 프로그래밍 방식은 특정 장점과 단점이 있습니다. 유도 만능 (I)에 프로그램을 다시 만들 것은 세포의 거의 무한한 소스를 제공한다; (II) 유전 공학을 허용한다; (III) 거의 무제한의 분화 가능성에 부여한다. 이러한 세포는 세포 기반 치료에 사용되어야하는 경우에는 유도 만능의 주요 단점은 미분화 세포 (생체 내에서 기형 종 형성)의 발암 및 생체 외 배양과 후속 이식을위한 필요성의 위험을 수반한다. 반대로, 직접 혈통 프로그래밍은 원하는 세포의 낮은 수율에 의해 제한됩니다출발 인구의 표적 세포의 수와 직접 관련이 있지만, 계통 - 리 프로그래밍 세포 이식 1,2에 제공된 발암 위험을 나타내지하지 나타나는 장점을 보유하는; 또한, 직접 프로그래밍도, 즉 이들 세포는 따라서 이식 필요성을 피하고, 필요한 것 장기 내에, 동일계에서 달성 될 수있다. 이 염두에두고, 우리의 실험실은 신경 퇴행성 질환의 세포 기반 치료법​​을 향한 새로운 접근 방식으로 기능에 혈통 재 프로그래밍 뇌 상주 세포의 가능성을 추구하고있다. 잠재적 혈통 프로그래밍 셀룰러 대상으로 고려 될 수있다 뇌 상주 세포는 다른 macroglia의 유형 (성상 세포, NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포), 미세 아교 세포 및 미세 혈관 관련 세포 (내피 세포와 혈관 주위 세포)를 포함한다. 우리는 광범위하게 대뇌 고전의 아스트로의 체외 프로그램을 다시 만들 가능성을 연구 한출생 초기 마우스 3-5 텍스. 성인의 뇌에 직접 혈통 프로그래밍에 대한 유사 적합한 세포 소스의 검색, 우리는 성공적으로 기능과 혈관 주위 세포의 전시 품질 증명으로 다시 프로그램 할 수있는 세포 인구가 발생했습니다. 여기에서 우리는 확장하고 체외에서이 세포를 풍부하게, 그리고 마지막으로 성공적으로 (25 ~ 30 % 범위)이 체외 확장 된 세포의 상당 부분을 재 프로그램하는, 성인의 뇌 조직 검사에서 이러한 세포를 수확하는 방법에 대한 프로토콜을 설명 기능. 리 프로그래밍은 두 개의 전사 인자, SOX2 및 ascl1 동시에 레트로 바이러스 - 매개의 공동 발현에 의해 달성 될 수있다. 이러한 PdiNs는 반복적 활동 전위 소성 능력을 취득하고 신경망으로 통합 그들의 능력을 나타내는 다른 뉴런뿐만 시냅스 대상 서브 밝혀졌다. 우리의 프로토콜은 기능에 성인의 뇌 혈관 주위 세포의 분리 및 혈통 전환을위한 간단한 절차를 제공합니다. </P&gt;

<table><tbody><tr><td>anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>558821 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>사용 MCA2141FT 1</td><td>:100</td></tr><tr><td>anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td><td>1:100</td></tr><tr><td>anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>사용 1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR&beta;</td><td>세포 신호</td><td>3169S</td><td>는 1:200</td></tr><tr><td>안티-CD146</td><td>사용, Abcam</td><td>Ab75769</td><td>사용, 1:400</td></tr><tr><td>안티-NG2</td><td>사용, Millipore</td><td>AB5320</td><td>사용, 1:400</td></tr><tr><td>안티-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>사용, 1:400</td></tr><tr><td>안티-&베타 사용; III-튜불린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>사용 1:400</td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>사용 1:200</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>사용 1:600</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>사용 1:1,000</td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>사용 1:500</td></tr><tr><td>anti-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td>는 <td>1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>사용 1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>사용 1:500</td></tr><tr><td>anti-Calretinin</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>사용 1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYnaptic SYstems</td><td></td><td>사용 135511 1:1,000</td></tr><tr><td>Rat IgG1 isotype control FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>사용 1:100</td></tr><tr><td>Rat IgG1 isotype control PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>사용 1:100</td></tr><tr><td>Rat IgG1 isotype control APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>사용 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td>는 <td>56°C에서 배양에 의한 열 비활성화를 수행합니다. C 30분 동안</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td><td></td><td>CaCl</td><td></td></tr><tr><td>2 및 MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine 하이드로 브로마이드 (PDL)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (파라 포름 알데히드)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 알드리치</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 &prime; , 6-Diamidin -2- 페닐 린돌) 딜락 테이</td><td>트 시그마 - 알드리치</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>아쿠아 폴리 / Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 라운드-바텀 튜브&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드-바텀 튜브와 셀-스트레이너 캡&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 배양 플라스크</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 배양 플라스크</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>일회용 피펫 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>유리 파스퇴르 피펫 (150 mm)</td> <td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립 12 mm 직경</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>수술용 일회용 메스&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 및 스윙아웃 로터와 15 ml 및 50 ml 튜브용 어댑터</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 세포 분류기: FACSDiva 소프트웨어가 있는 FACSAria l&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humified cell culture incubator</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wather bath at 37 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS플로 시스 플루이드&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

유도 된 신경 세포 (INS)에 비 신경 세포의 직접 혈통 프로그래밍은 신경의 근간이되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 체외 모델링하거나 병에 걸린 뇌를 복구하기위한 새로운 전략을 가능하게 할 수있다. INS로 직접 변환 의무 식별 뇌 상주 비 신경 세포 유형은 손상된 뇌 조직 내에서, 즉, 현장에서 이러한 접근 방식을 실행을 허용 할 수 있습니다. 여기에서 우리는이 전제를 충족 성인의 뇌에서 파생 된 세포를 식별하는 시도에서 개발 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 수반 : 성인 인간의 뇌 생검 의한 대뇌 피질에서 인간 세포의 (1)를 배양; (2) 시험 관내 (약 2-4주 필요) 확장 및 면역 세포에 의해 문화의 특성 및 유동 세포 계측법; (3) 항 PDGF 수용체 β 및 안티 CD146 항체를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 농축;(4) 신경성 전사와 레트로 바이러스 매개 전달은 SOX2 및 ascl1 요인; (5) 마지막으로 면역 세포에 의해 생성 된 혈관 주위 세포 유래 유도 된 신경 세포 (PdiNs)의 특성 (8 주 14 일 레트로 바이러스 형질 도입에 따라). 이 단계에서, 인은 패치 클램프 녹음하여 전기적 특성에 대해 탐색 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기능적인 인간의 기능에 뇌 상주 혈관 주위 세포의 체외 혈통 전환에 대한 높은 재현성 절차를 제공합니다.

이 프로토콜은 후 성공적으로 성인의 대뇌 피질의 표본에서 문화를 확립의 첫 번째 결과는 문화의 세포 성분의 식별로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 특정 단백질에 대한 면역 세포 화학은 다른 환자 (그림 1A)의 표본에서 파생 된 문화 간의 이질성의 상당한 정도를 알 수있다. 흐름에 의해 정량화으로 세포 계측법 (평균 ~ 75 % 할인, 30에서 최대 99 %까지) PDGFRβ을 발현하는 세포의 상당한 부분이 항상있다; 이러한 CD146, NG2 및 CD13과 같은 혈관 주위 세포의 다른 마커는 일반적으로 낮은 범위 (그림 1B)로 표현된다. 면역 세포 (그림 1A)에 의해 결정 마찬가지로 SMA는 배양 된 세포의 작은 부분 모집단으로 표현된다. 통로 0 (P0)에서, &lt;보통 CD34 양성 내피 세포의 10 %가, 그 수는 더 계대로 검출 아래 감소. 마찬가지로, astrocytES는 이전 구절에서만 무시할 오염을 포함한다. 또한, ...

직접 혈통 프로그래밍에 대한 뇌 상주 세포를 표적으로하는 것은 뇌 수리에 대한 새로운 관점을 제공합니다. 여기서 우리는 성인의 대뇌 피질에서 뇌에 상주하는 혈관 주위 세포에 풍부한 문화를 준비하고 SOX2 및 Ascl1 요인 전사의 레트로 바이러스 매개 식에 의해 유도 된 신경 세포로 이러한 변환하는 방법의 프로토콜을 설명합니다.

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 뇌 기생충 유래 세포를 유도 뉴런으로 전환하는 것입니다. 이는 수술로 얻은 뇌 표본에서 기생충 유래 세포를 분리 및 배양함으로써 달성됩니다. 그 다음, 증식 과정을 거친 in vitro 세포에 기생충 마커를 면역 표지하여 세포의 특성을 규명하고 최종적으로 세포를 추가 농축합니다.그 후, 기생세포 유래 세포들을 뉴런 운명 결정 인자를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터로 형질전환하여 유도 뉴런으로 직접 전환시킵니다. 뉴런 마커인 beta three tubulin에 대한 면역 염색을 통해, 계통 재프로그래밍된 기생세포 유래 세포로부터 유도 뉴런이 얻어졌음을 보여주는 결과가 도출됩니다. 섬유아세포의 재프로그래밍이나 배아줄기세포의 뉴런 분화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 접근법의 주요 장점은 뇌 내생 세포를 표적으로 한다는 것이며, 이는 궁극적으로 세포 이식 없이도 뇌 내에서 직접적인 계통 전환이 가능하게 하는 길을 열어줄 수 있습니다.다음 프로토콜은 LMU Munich 의과대학 윤리 위원회의 승인 및 신선한 인간 뇌 생검을 시작으로 모든 환자로부터 받은 서면 동의서에 따라 개발되었습니다. HBSS 내에서 얼음 위에 보관하고, 조직을 65 mm 페트리 접시에 옮긴 후 멸균된 일회용 메스 2개를 사용하여 작은 조각으로 다져 조직을 단일 세포로 해리합니다. 조직을 15 mL 원심 분리 튜브로 옮기고 3~6 mL의 TrypLE을 추가한 후, 37 °C 항온수조에서 15~30분 동안 배양합니다.소화 반응 후, 결합을 촉진하기 위해 미리 데워둔 성장 배지를 동일한 부피로 첨가하고, 5 mL 일회용 피펫과 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 부드럽게 트라이툴레이션(titrate)합니다. 용액을 157 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다. 펠렛을 성장 배지로 재현탁하고 배양물을 T 75 플라스크로 옮깁니다.세포를 37 °C, 5% carbon dioxide 및 5% oxygen 조건에서 배양합니다. 세포가 합류(confluency) 상태에 도달할 때까지 3~4일마다 배지의 절반을 교체합니다. 세포가 합류 상태에 도달하면, 배양액을 흡입하여 제거하고 실온의 PBS로 세척한 후 3 mL의 trypsin-EDTA를 첨가합니다.37°C에서 5~10분 동안 배양한 후, 플라스크를 가볍게 두드려 세포가 떨어지도록 합니다. 그다음 현탁액을 원심 분리하고 세포를 성장 배지로 재현탁한 뒤, 성장 배지를 3배 부피로 첨가합니다. 최적의 수율을 얻기 위해 새로운 T 75 배양 플라스크에 1:3 비율로 계대 배양합니다.세포는 리프로그래밍 능력이 저하되는 징후 없이 최대 5대까지 계대 배양되었으며, 계대 배양이 반복됨에 따라 내피세포의 수는 무시할 수 있을 정도로 감소합니다. 면역세포화학 분석을 수행하려면 약 60,000개의 세포를 poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버슬립 위에 500 µL의 신선한 성장 배지와 함께 24-well 조직 배양 플레이트에 분주하여 배양합니다.세포를 37°C, 5% carbon dioxide 및 5% oxygen 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 배양된 인간 뇌 세포의 면역화학 분석을 위해, 배지를 제거하고 1 mL의 PBS로 3회 세척합니다. PBS에 희석한 4% paraldehyde 500 µL를 첨가하고 15분 동안 배양합니다.실온에서 수행합니다. 유리 커버슬립을 적절한 습윤 염색 챔버로 옮기고, P-B-S-B-S-A Triton X 100 블록 용액 80 µL를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그 후 동일한 용액으로 희석한 1차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS로 세포를 3회 세척한 다음, 2차 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.세 번 세척한 후, 항퇴색제(anti fading medium)를 처리하고 커버 슬립을 덮습니다. 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 시료를 분석하십시오. 레트로바이러스 입자를 취급할 때는 해당 지역의 생물안전 지침을 준수하십시오. 레트로바이러스 형질도입 24시간 전에 상단에 약 60,000개의 세포를 파종합니다.24웰 조직 배양 플레이트에 500 µL의 신선한 성장 배지를 넣고 Poly-L-lysine이 코팅된 유리 커버슬립을 넣은 후 37 °C에서 배양합니다. 다음 날까지 기다립니다.성장 배지를 500 µL의 신선하게 예열된 성장 배지로 교체하고, 레트로바이러스 입자가 포함된 각각의 농축 상층액 1 µL를 첨가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 웰 전체에 바이러스 입자가 고르게 분포되도록 합니다. 하루 후, 바이러스 입자가 포함된 배지를 세포에서 제거하고 신선하게 예열된 배지 1 mL를 첨가합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 B 27 분화 배지를 사용하며, 배지를 교체하지 않은 상태로 4~8주 동안 세포를 배양합니다. 배지 교체는 성숙 과정에 있는 유도 뉴런에 손상을 줄 수 있으며, 이는 뉴런 표현형의 획득을 입증하는 데 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. beta three tubulin, map two 및 nen과 같은 뉴런 항원에 대해 면역세포화학 염색을 수행합니다. 본 영상의 앞부분에서 보여주었듯이, 성인 인간 대뇌 피질에서 성공적으로 구축된 배양물에 대해 면역세포화학 염색을 수행한 결과, 유세포 분석으로 정량화했을 때 서로 다른 환자의 검체에서 유래한 배양물 간에 상당한 수준의 이질성이 나타남을 알 수 있습니다.P DG FR beta를 발현하는 세포의 비율이 상당하며, CD 1 46, NG two 및 CD 13과 같은 다른 기생충 마커들은 더 낮은 수준으로 발현됩니다. 마찬가지로, 계대 배양 0단계의 배양 세포 중 소수 집단에서 SMA가 발현되며, CD 34 양성 혈관 내피 세포는 보통 10% 미만으로 존재하다가 추가 계대 배양 시 검출 한계 미만으로 감소합니다. 또한, 초기 계대에서는 성상교세포의 오염 정도가 무시할 수 있는 수준입니다.면역 식물화학 및 유세포 분석 데이터는 정량적 R-T-P-C-R-A에 의해 충분히 입증되었습니다. 이 단계에서 분별법을 통해 기생충 유래 세포를 더욱 농축할 수 있습니다. 이는 P-D-G-F-R beta 발현 수준에서 나타나듯 배양물의 순도가 낮은 경우에 특히 유용합니다.따라서, 우리는 CD 34 양성 오염 물질을 완전히 배제하면서 P-D-G-F-R beta CD one 40 B 항체 단독 또는 anti CD 1 46 항체와의 조합을 이용하였습니다. 구체적으로, 대조군 바이러스로 이러한 배양물을 형질전환시킨 기생충은 발현 프로필을 변화시키지 않았으며, 이는 이들이 기생충 계통으로 남아 있음을 나타냅니다. 마찬가지로, 레트로바이러스 매개 SOX two 단독 발현은 형태학적 변화를 일으키지 않았으며 beta three tubulin 발현을 유도하지도 않았습니다.대조적으로, A SCL 1을 인코딩하는 레트로바이러스만으로 형질도입된 세포의 약 10%는 beta three tubulin 발현을 보였으나, 신경세포 형태는 획득하지 않았습니다. 반면, SCL 1과 소2를 공동 형질도입한 모든 세포의 거의 50%가 beta three tubulin 발현을 보였으며, 그중 1/3은 신경 돌기 또한 나타내어 PNS로의 운명 전환이 일어났음을 보여주었습니다.유도 뉴런의 성숙도 및 기능성에 관한 추가적인 질문을 해결하기 위해 패치 클램프 전기생리학과 같은 다른 기술을 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해...

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

이 비디오는 유전적으로 변형된 조혈전구세포를 신경세포 줄기세포로 직접 재프로그래밍하는 방법을 보여줍니다. 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell)에 의해 발현되는 전사 인자(transcription factor)는 연쇄 반응(cascade of molecular events)을 유발하여 변형을 촉진합니다. 추가 특이적 배지는 유도된 신경 줄기 세포를 선택하고 성장시키는 데 사용됩니다.

조혈전구세포(Hematopoietic Progenitor Cells)를 신경 줄기세포(Neural Stem Cells)로 직접 재프로그래밍(Direct Reprogramming of Hematopoietic Progenitor Cells into Neural Stem Cells)

이 동영상은 특수 배지를 사용하여 유도 신경전구세포(iNPC)를 뉴런과 성상세포로 분화하는 과정을 보여줍니다.

유도 신경전구세포(Induced Neural Progenitor Cells)를 성상세포(astrocyte)로 분화(Differentiating Induced Neural Progenitor Cells into Astrocyte)

이 비디오는 성인 인간 진피 섬유아세포(aHDF)의 뉴런 생성을 보여줍니다. aHDF는 뉴런 전사 인자(neuronal transcription factor)와 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)에 대한 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 재프로그래밍됩니다. shRNA는 뉴런 전사 억제인자(neuronal transcriptional repressor)의 발현을 억제하고, 뉴런 전사 인자(neuronal transcription factor)는 aHDF를 뉴런으로 분화하기 위해 유전자를 활성화합니다. 이러한 재프로그래밍된 aHDF는 성숙한 뉴런을 생성하기 위해 초기 및 후기 뉴런 변환 배지에서 배양됩니다.

인간 피부 섬유아세포 리프로그래밍을 통한 뉴런 생성

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

라이브 영상 실시간에 세포 행동을 공부 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 시간 경과 비디오-현미경 기본 대뇌 피 질 세포의 차별화 된 뉴런을 명과 기본 신경 줄기 세포에서 혈통 진행 동안 제정 단계의 상세한 검사를 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다.

2D 문화 시스템을 사용 하 여 기본 대뇌 피 질 세포의 영상 라이브

뒤에 소프트웨어 기반 후 처리 시간 경과 비디오 현미경에 의해 신경 인구를 모니터링 하는 강력한 프로토콜 설명 되어 있습니다. 이 메서드는 선택 된 인구 라이브 이미징 실험 동안에 생물 학적 이벤트를 식별 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

우리는 유도 된 신경 전구 세포 (iNPC)로 인간의 피부 유래 섬유 아세포와 유도 된 천체 세포 (iA)로 후속 분화를 재프로그래밍하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 대량으로 iNPC 및 iA의 빠르고 재현 가능한 생성으로 이어집니다.

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

배우세요 인간 뇌 혈관 주위 세포를 유도 신경 세포로 직접 전환하는 방법을. Sox2와 Ascl1 레트로바이러스 벡터를 사용하여 뇌 내재 세포를 재프로그래밍하고 신경 마커로 확인하는 이 기법은 뇌 손상 치료에 새로운 가능성을 제시합니다.

유도 된 신경 세포로 성숙한 인간 두뇌의 혈관 주위 세포에서 파생 된 세포의 리니지 - 프로그래밍

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