Name: 의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징 개자리 truncatula 루트 결절 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 MALDI 질량 분석 이미징을 사용하여 Medicago truncatula 뿌리 결절의 내인성 대사 산물을 검출하고 공간 분포를 매핑하는 방법을. 이 기술은 식물 조직의 생물학적 과정을 이해하는 데 귀중한 통찰을 제공합니다.

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저자는 개자리의 truncatula 샘플을 제공하는 UW-매디슨에서 농업 경제학학과 박사 장 미셸 ANE을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (NSF)의 자금에 의해 부분적으로 지원 된 보조금 CHE-0957784, 위스콘신 대학의 대학원 위스콘신 동문회 연구 재단 (WARF) 및 Romnes 교직원 연구 활동 프로그램 (LL까지). EG는 NSF 대학원 연구 활동 (DGE-1256259)를 인정한다.

1. 수단 <ol><li> MALDI-TOF/TOF MSI. 작은 분자의 분석을위한 MALDI 소스가 장착 된 질량 분석기를 (재료 / 장비의 표 참조)를 사용합니다. 그 분석에 따라 양 또는 음 이온 모드에서 획득을 수행합니다. 관심의 질량 범위를 지정하고 이온의 이미지를 생성하는 샘플의 표면을 가로 질러 x와 y 차원 모두에서 50 ㎛ 간격으로 500 레이저 샷 / 자리를 수집합니다. 레이저 샷의 래스터 폭과 번호는, 각각 더 높은 공간 분해능 및 최대 신호 강도를 얻기 위해 조정될 수있다. DHB 매트릭스 피크 또는 질량 스펙트럼을 보정 슬라이드에 직접 조직에 적용되는 내부 기준을 사용합니다. </li><li> 높은 해상도 LC-MS. (재료 / 장비의 표 참조) LC-MS는 HILIC 열이 관심의 분석에 따라와 C-18 열, 또는 정상적인 단계 (NP)과 역상 (RP) LC를 사용하여 실행 샘플을 추출. 이동상 및 사용특정 샘플 유형에 대한 적절한 그라디언트. 시료의 유형에 따라 양 또는 음 이온 모드에서 획득을 수행한다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 결절에 부착 된 루트 3 ~ 4 밀리미터를두고, 공장에서 루트 결절 트림. </li><li> 즉시 절개 한 후, 저온 유지 컵에 조직을두고 젤라틴 (탈 이온수에서 100 ㎎ / ㎖)를 충당하기 위해 집게를 사용합니다. 조직이 기포와 컵의 바닥에 붙어되는 것이 필수적이다. </li><li> 플래시 젤라틴 견고 불투명해질 때까지 드라이 아이스 / 에탄올 욕에 컵을 배치하여 조직을 동결. -80 ° C까지 사용에서 보관 샘플. </li><li> 에서 샘플을 제거 -80 C 냉장고 °, 플라스틱 저온 유지 컵을 버려야 과잉 젤라틴을 멀리 트림. OCT를 사용하여 조직을 터치 두지 않을 동안, 최적의 절삭 온도 (10 월) 미디어 한푼 크기의 양의 저온 유지 척에 포함 된 조직을 설치합니다. 저온 유지 장치에 배치OCT를 응고 될 때까지 상자. </li><li> 척 젤라틴은 약 15 분 동안 (-20 또는 -25 ° C에서 세트) 저온 유지 장치 상자에서 평형을 허용합니다. </li><li> 백 (비 ITO를 따뜻하게하여 ITO 코팅 유리에 각 슬라이스를 마운트 그라 이오 스탯 (재료 / 장비의 표 참조) 섹션 조직에 약 하나의 셀의 두께 (8-20 μm의는 조직의 유형에 따라)과 해동을 사용하여 손등에 ITO 코팅 유리 슬라이드의면) 코팅. 냉동 조직 절편 근처 따뜻하게 슬라이드의 ITO 코팅면을 놓고 슬라이스가 슬라이드에 충실 할 수 있습니다. 슬라이드에 가깝게 섹션을 배치하는 MSI 동안 더 나은 정렬을 제공 할 것입니다. </li></ol> 3. 매트릭스 응용 프로그램 <ol><li> MALDI 매트릭스의 에어 브러시 적용 <ol><li> 모든 에어 브러쉬 절차는 흄 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 철저히 에어 브러쉬 솔루션 컨테이너와 노즐 (재료 / 장비의 표 참조) 메탄올을 청소하고DHB 매트릭스 용액으로 용액 용기를 채우기 (50 % methanol/0.1 %의 TFA의 V에서 150 ㎎ / ㎖ / v). </li><li> 약 35 센티미터 샘플에서 에어 브러쉬를 잡고 10 초 스프레이 기간 및 각 코트 사이에 30 초 건조 시간과 슬라이드의 표면에 매트릭스의 10-15 코트를 적용합니다. </li><li> 매트릭스 솔루션에서 막힘 방지하기 위해 완료되면 철저하게 메탄올로 다시 에어 브러시를 청소합니다. </li></ol></li><li> MALDI 매트릭스의 자동 스프레이 응용 프로그램 <ol><li> 자동 스프레이 시스템의 제조 업체에서 제공하는 스타트 업 지침을 따르십시오. </li><li> 40 ㎎ / ㎖를 사용하여 루트 결절의 대사 산물의 MSI (50 % methanol/0.1 %의 TFA의 V IN / V) DHB 매트릭스 ~ 80 ° C, 속도에 1천2백50mm / 분, 50 유량에 온도 설정을위한 μL / 분, 24에 패스의 수. 최고의 보험의 경우,이 노즐 90 ° 및 / 또는 각 패스의 노즐 1.5 mm 오프셋을 회전하는 것이 좋습니다. 스프레이 방법을 시작합니다. SI로데주의, 여기에 사용 된 특정 스프레이 시스템은 용매의 빠른 증발을 위해 노즐을 가열한다. 용매가 증발 할 때, 매트릭스의 농도는 빠르게 증가한다. 에어 브러시와 자동 분무기를 이용하여 시료에 적용되는 매트릭스는 비교 농도가있다. </li><li> 자동 스프레이 시스템의 제조 업체에서 제공하는 셧다운 지시 사항을 따르십시오. </li></ol></li><li> MALDI 매트릭스의 승화 신청 <ol><li> (재료 / 장비의 표 참조) 승화 실의 바닥에 300 밀리그램의 DHB를 달다. </li><li> 조직 섹션 양면, 전도성 테이프를 아래로 향하게하여 차가운 손가락 (승화 챔버의 상부)에 유리 슬라이드 스틱. 심지어 매트릭스 증착을 생산, 심지어 전도성 양면 테이프와 슬라이드의 뒷면 전체를 커버. </li><li> 함께 C-클램프로 승화 챔버의 상하 반쪽 클램프. 진공 및 광고를 연결상부 저수지에 D 얼음과 차가운 물. </li><li> 실내 온도에 가열 맨틀에서 승화 챔버를 놓습니다. </li><li> 진공 펌프의 전원을 켭니다. 15 분을 기다린 후 가열 맨틀의 전원을 켭니다. 가열 맨틀은 10 분에 걸쳐 120 ° C에 도달해야합니다. </li><li> 10 분 후, 열, 진공 개폐 밸브 (그래서 챔버의 내부는 진공 상태 유지)를 해제하고 진공 펌프를 끄십시오. </li><li> 진공 압력 방출 밸브를 열고 샘플을 제거, 챔버는 실내 온도에 올 수 있습니다. 승화 챔버의 크기가 유리 슬라이드에 승화 행렬의 양을 결정할 것이다. 작은 챔버 (150 ㎖의 비이커의 사이즈) DHB 약 100 밀리그램을 사용하고 유리 슬라이드를 절단 필요하면서 큰 승화 챔버 (400 ㎖의 비이커의 사이즈) DHB 약 300 mg의 사용되도록 그것을 챔버에 맞는. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 획득 <ol> &lt;리&gt; 마크 &quot;가르쳐 포인트」로서 사용되는 WiteOut 수정액 펜으로 샘플의 각 모서리에 + 패턴. MALDI 슬라이드 어댑터 플레이트에 유리 슬라이드를 삽입하고 스캐너를 사용하여 샘​​플의 광학 이미지를 촬영. </li><li> 50 ㎛의 래스터 스텝 사이즈와 같거나 래스터 스텝 사이즈보다 작은 레이저 직경 인스트루먼트 사에 의해 제공된 소프트웨어를 사용하여 화상 취득 파일을 설정. 이 특정 기기에서 최소 레이저 설정은 40 ~ 50 μm의 직경이 약 10 μm의 작은 레이저 설정의 레이저 직경을 제공합니다. </li><li> 소프트웨어에 광학 이미지를로드하고 광학 이미지로 판을 맞 춥니 다. </li><li> 일반적인 매트릭스 클러스터 이온, 내부 표준 또는 교정 믹스를 사용하여 인수를 시작하기 전에 악기를 보정합니다. </li><li> &quot;빈&quot;으로 사용될 슬라이드 순수 행렬의 스폿 등으로 MSI 분석 할 조직의 영역을 지정한다. </li><li> 교류 시작quisition. </li></ol> 5. 이미지 생성 <ol><li> 공급 업체에서 제공하는 상용 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 이온 이미지를 추출합니다. 다른 오픈 소스 소프트웨어는 MSI 데이터 처리 19 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대사 산물 식별 <ol><li> 공급 업체에 특정 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼에서 관심의 특정 M / Z를 (재료 / 장비의 표를 참조). 분석 물 피크가 질량 스펙트럼으로부터 선택되는 이온 이미지가 구체적으로 조직 절편에 국부적으로 생성 될 때 분석 물은 매트릭스 이온 구별 될 수있다. </li><li> 그 분석의 목록을 생성 및 MS / MS 실험을 수행합니다. 분석의 샘플 목록의 대표 결과 표 1과 표 2를 참조하십시오. </li><li> 정확한을 얻기 위해 (또는 가능하면 높은 해상도 MALDI-MS) 고해상도 질량 분석기에 표적으로 한 LC-MS 분석을 수행대중의 관심의 분석의 측정과도 특성 조각 패턴을 얻기 위해 분석 대상 물질의 LC-MS/MS를 수행합니다. </li><li> 대상 분석을위한 추정 식별을 결정하는 검색 데이터베이스를 수행합니다. 대사 데이터베이스의 예는 다음과 같습니다 METLIN, ChemSpider, PubChem, KEGG 및 HMDB을. </li><li> 정확한 질량 데이터베이스 검색에서 추정 식별을 확인하기 위해, 표준, 문학, 및 / 또는 분열 예측 소프트웨어의 MS / MS 스펙트럼을 분석 대상에서 MS / MS를 일치합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

전술 한 바와 같이, 샘플 준비는 MSI 흐름에서 가장 중요한 단계이다. 고르지 조직을 포함하면 경우에 가능 어렵거나없는 것으로 절편의 원인이됩니다. 단면의 크기 및 적절한 평형 시간은 조직의 무결성을 유지하고 접는 눈물 회피에 결정적이다. 행렬 및 응용 기술의 선택은 검출 될 분석 물의 유형을 결정하는 역할, 공간 해상도, 및 결과의 재현성을 할 것이다. 행렬 또는 적용 기술의 조합을 사용하여 상보적인 결과를 제공 할 수 있었다. 이 방법은 M. 내인성 대사의 타겟이 불분명 한 MSI를 위해 특별히 설계되었습니다 truncatula 뿌리 결절 조직 만 쉽게 다른 조직 유형 및 생물학적 질문에 적응 될 수있다. 작은 분자 MSI의 권장 매트릭스 신청 방법은 승화 자동 분무기입니다. Tissu은 상에 증착 용매의 양을 증가E, 자동 스프레이 방식을 조정함으로써, 분석 물질의 추출을 증가하고 하나 등 지질, 펩타이드, MSI 건을 ...

대사의 성장 분야는 바이오 마커 발견, 식물과 다른 생물 학적 시스템에 대사 경로를 해독하고, 독성 프로파일 4,6-10 등 많은 중요한 생물 학적 응용 프로그램을하고 있습니다. 시스템 생물학을 공부하고 주요 기술 과제는 그들에게 11을 방해하지 않고 메타 볼로 경로를 연구하는 것입니다. MALDI-MSI는 단일 기관 12, 13, 심지어 하나의 세포 (14, 15)에 분석의 민감한 탐지를 가능하게 손상 조직을 직접 분석 할 수 있습니다. 샘플 준비를 재현하고 신뢰할 수있는 질량 스펙트럼 이미지를 생산하는 중요한 단계입니다. 이미지의 품질이 크게 티슈 매립 매체, 슬라이스 두께, MALDI 매트릭스 및 매트릭스 응용 기술과 같은 요인에 의존한다. 이미징 애플리케이션에 이상적인 단면 두께는 하나의 셀 (시료 유형에 따라 8-20 μM)의 폭이다. MALDI 유기, crystallin의 증착을 필요로E 매트릭스 화합물, 분석 절제 및 이온화를 돕기 위해 샘플에 전형적 약산. 16 다른 행렬들은 상이한 신호 강도, 간섭 이온 및 화합물의 다른 클래스의 이온화 효율을 제공한다. 매트릭스 응용 기술은 또한 질량 스펙트럼 이미지 및 다른 기술의 품질 역할 분석의 다른 클래스에 적합한한다. 세 매트릭스 응용 프로그램의 방법은이 프로토콜에 제시되어있다 : 에어 브러쉬, 자동 분무기, 승화. 에어 브러시 매트릭스 애플리케이션은 광범위 MALDI 이미징에 사용되어왔다. 에어 브러쉬 매트릭스 애플리케이션의 장점은 상대적으로 신속하고 용이하다는 것이다. 그러나, 에어 브러쉬 매트릭스 애플리케이션의 품질은 크게 사용자의 숙련도에 따라 덜 재현 할과 분석 물질의 확산, 특히 작은 분자 (17)을 야기하는 경향이있다. 자동 스프레이 시스템은 매트릭스 애플리케이션 에어 브러시 유사한 기계가 있지만, 근래전자 스프레이 더 재현하고, 수동 에어 브러쉬 응용 프로그램을 볼 수있는 변동성을 제거하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 때로는 더 많은 시간이 소요되는 기존의 에어 브러쉬 매트릭스 응용 프로그램을보다가 될 수 있습니다. 수동 에어 브러쉬 자동 스프레이 시스템은 모두 솔벤트 기반의 매트릭스 응용 프로그램의 방법이다. 그러나, 추출 및 높은 질량 화합물 (18)을 관찰하기 위해 용매 필요한 부족, 승화는 분석 확산을 줄일 수 있기 때문에 대사와 작은 분자의 질량 스펙트럼 이미징 점점 더 인기를 끌고있다 건조 매트릭스 응용 기술이다. 대사의 신분은 일반적으로 탠덤 질량 MS / MS 스펙트럼이 표준, 문학, 또는 이론적 스펙트럼에 비교되는 유효성 검사에 대한 (MS / MS) 실험, 다음 추정 동정을 얻기 위해 정확한 질량 측정이 필요합니다. 이 프로토콜 고해상도 (질량 m / z 400에서 60,000의 분해능), 액체 크로마토 그래피 (LC)-MS는 개자리는 생물학적 시스템으로 뿌리와 뿌리혹을 truncatula 사용하여, 공간 정보 및 내인성 대사의 자신감을 식별 모두를 얻기 위해 MALDI-MSI에 연결된다. MS / MS 실험은 MALDI-MSI 또는 LC-MS와 조직 추출물의 조직에서 직접 수행 및 대사 산물 식별의 유효성 검사에 사용 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 M. 내인성 대사를 매핑 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다 적응 및 다양한 조직 유형 및 생물학적 시스템에서 작은 분자 MSI에 적용될 수 truncatula.

<table><tbody><tr><td>젤라틴</td><td>Difco</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=214340">214340</a></td><td>가열하여 용해시키다</td></tr><tr><td>. Cryostat- HM 550</td><td>Thermo Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>인듐 주석 산화물 (ITO) 코팅 유리 슬라이드&nbsp;</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (너비 x 길이 x 두께)</td></tr><tr><td>2,5-디하이드록시벤조산 (DHB) 매트릭스&nbsp;</td><td>ICN 바이오메디컬<</td><td>a href="http://www.labsource.com/Catalog/Item.aspx? ItemID=1787195">PI90033</a></td><td></td></tr><tr><td>에어브러시</td><td>Paasche 에어브러시 회사</td><td>TG-100D</td><td>75ml 스틸 용기와 결합</td></tr><tr><td>자동 매트릭스 분무기 시스템- TM-Sprayer</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td>HTX. TMSP. H021-U</td><td>기기가 설치될 때 특정 시작 및 종료 지시사항이 제공됩니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Chemglass 생명 과학</td><td><a href="http://www.chemglass.com/product_view.asp?pnr=CG-3038">CG-3038-01</a></td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프- Alcatel 2008 A</td><td>이상적인 진공 제품</td><td>P10976</td><td>극한 압력 = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td>276601</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td>269841</td><td>"벤더 특정 소프트웨어"의 한 예</td></tr><tr><td>: MALDI LTQ Orbitrap</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMASZ</td><td>정확한 질량 측정을 위한 고분해능 MALDI 기기</td></tr><tr><td>Q Exactive</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>정확한 질량 측정을 위한 고분해능 LC-MS 기기</td></tr></tbody></table>

의 대사 산물의 조사를위한 maldi-질량 분석 이미징<em&gt; 개자리 truncatula</em&gt; 루트 결절

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

이러한 의약품 또는 내인성 대사와 같은 작은 분자를 연구 잠재적으로 1 연구되고 대사 경로에 변화를 일으킬 수있는 그 조직의 균질화를 필요로 조직 추출물을 사용하는 데 사용되는 대부분의 기술. 질량 분석 영상 (MSI)은 생체 조직 샘플 1-5의 손상 조각 내 분석의 공간 정보를 제공 할 수있는 강력한 분석 도구입니다. 이 기술은 단백질, 펩티드, 지질과 같은 내인성 대사와 같은 작은 분자를 포함하여 각종 화합물을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MSI와, 다 대사 산물의 공간적 분포를 동시에 검출 할 수있다. 여기서, 콩과의 식물 뿌리와 뿌리혹에 타겟이 불분명 한 대사 MSI의 실험을 위해 특별히 개발 된 방법이 일어나는 생물학적 과정에 대한 통찰력을 표시 할 수있는 표시됩니다.여기에 제시된 방법은 시료 준비에서 이미지 수집으로, 일반적인 MSI의 흐름을 보여주고, 작은 분자를 검출하는 데 도움이되는 여러 매트릭스 응용 프로그램 기술을 시연, 매트릭스 응용 프로그램 단계에 초점을 맞추고 있습니다. MS의 이미지가 생성되면, 그 대사 산물의 분석 및 식별을 논의 보여줍니다. 여기에 제시된 표준 워크 플로우를 쉽게 다른 조직 유형, 분자 종, 및 계측에 대해 수정할 수 있습니다.

MSI의 실험 개요는도 1에 도시된다. 실험의 시작에서, 샘플 준비는 중요한 단계입니다. 결절은 식물 뿌리에서 트리밍 된 젤라틴에 포함됩니다. 이 동결되는 동안 조직은, 아니 거품, 저온 유지 컵에 평평하게 눌러야합니다, 그것은 단면되는 동안이 조직의 쉽고 적절한 정렬을 보장합니다. 조직과 분리 될 때, 적절한 두께로 조직을 절단하기 위해 중요하다; 섹션 너무 두껍게 추출 및 조직으로부터 검출 된 분석 물질의 수를 줄이는 반면 섹션 너무 얇은는 티슈 무결성을 망치고, 찢어 것이다. 행렬 및 응용 기술의 선택은 검출 된 분석 물질의 종류를 결정할 것이다. 행렬의 조합을 사용하여 상보적인 결과를 제공 할 수 있었다. 세 매트릭스 응용 기술은이 작품에 제시되어있다. 에어 브러쉬 기법은 빠르지 만 작은 분자의 MSI 수를 위해 일반적으로 적합하지 않습니다분석 확산의 원인이됩니다. 자동 스프레이 시스템 및 승화 작은 행렬 결정 나은 재현성, 이하 피 분석 물 확산을 제공한다. 2</stron...

질량 분석 영상 (MSI)은 생물 학적 과정에 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 자신의 네이티브 환경에서 화합물을 보존, 그대로 조직에서 다양한 화학 종을 발견하고 식별하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기서 작은 분자의 분석을 위해 개발 MSI 방법이 설명된다.

의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징<em&gt; 개자리 truncatula</em&gt; 루트 결절

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

이 절차의 전반적인 목표는 식물 뿌리 조직 내 저분자 물질에 대해 신뢰할 수 있는 다중 질량 분석 이미징을 수행하는 것입니다. 이는 먼저 조직 샘플을 적절한 크기로 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 MALDI 매트릭스를 최적화하여 조직 샘플에 적용하는 것입니다.다음으로, 샘플을 MALDI MSI 분석에 회부하여 조직 전체에서 스펙트럼을 수집합니다. 마지막 단계는 데이터 처리 과정이며, 여기서 생물학적으로 중요한 분석물을 식별할 수 있습니다. 최종적으로, MALDI MSI는 콩과 식물의 뿌리 결절에 존재하는 내인성 대사물을 검출하는 데 사용됩니다.이 방법은 식물 뿌리 조직에 존재하는 대사산물에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 포유류, 갑각류, 곤충을 포함한 다른 모델 시스템의 소분자와 조직 연구에도 적용 가능합니다. 먼저, -80 °C 냉동고에서 미리 준비된 식물 조직 샘플을 꺼냅니다. 그다음 플라스틱 크라이오스탯 컵을 잘라내고 과도한 젤라틴을 다듬은 후, OCT(optimal cutting temperature) 배지를 동전 크기만큼 사용하여 매립된 조직을 크라이오스탯 척에 고정하되, OCT가 조직에 닿지 않도록 합니다.OCT가 응고될 때까지 크라이오스탯 척을 -20 °C로 설정된 크라이오스탯 박스에 둡니다. 척과 젤라틴을 크라이오스탯 박스에서 약 15분 동안 평형화한 후, 크라이오스탯을 사용하여 조직을 대략 세포 한 개 두께로 절편합니다. 그다음 슬라이드의 코팅되지 않은 면을 손등에 대어 가온하면서 각 절편을 미리 냉각된 유리 슬라이드 위에 썸 마운트(thumb mount)합니다.다음으로 가열된 슬라이드의 ITO 코팅면을 냉동된 조직 절편 근처에 배치하여, MALDI 매트릭스 에어브러시 도포를 위해 절편이 슬라이드에 부착되도록 합니다. 에어브러시 용액 용기와 노즐을 메탄올로 철저히 세척한 후, 용액 용기에 DHB 매트릭스 용액을 채웁니다. 에어브러시를 샘플에서 약 35 centimeters 거리로 유지하고, 10초 동안 분사하고 각 도포 사이에 30초 동안 건조시키는 과정을 통해 슬라이드 표면에 매트릭스를 10에서 15회 도포합니다.작업이 끝나면 매트릭스 용액으로 인한 막힘을 방지하기 위해 메탄올로 에어브러시를 철저히 세척하십시오. 에어브러시를 더 쉽게 사용할 수 있지만, MALDI 매트릭스의 승화 도포를 위해서는 자동 매트릭스 스프레이어 시스템이 대개 더 균일하고 재현 가능한 매트릭스 도포 범위를 생성한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 승화 챔버 바닥에 300 mg의 DHB를 정밀하게 측정하여 넣으십시오. 양면 전도성 테이프를 사용하여 조직 절편이 아래를 향하도록 유리 슬라이드를 콜드 핑거에 부착하십시오. 슬라이드가 너무 크면 절단하십시오.승화 챔버의 경우, C 클램프를 사용하여 승화 챔버의 상단과 하단 절반을 함께 고정합니다. 그다음 승화 챔버를 상온 상태의 가열 맨틀에 넣습니다. 진공 장치를 연결하고 상단 저장조에 찬물을 채운 뒤 얼음을 추가합니다.진공 펌프를 켠 후 15분 동안 기다렸다가 가열 맨틀을 켭니다. 10분 후 가열을 중단하고, 진공 밸브를 잠근 뒤 진공 펌프의 전원을 끕니다. 챔버가 상온으로 식으면 밸브를 열어 진공 압력을 해제하고 시료를 꺼냅니다.다음으로, 교정액 펜을 사용하여 샘플의 각 모서리에 티칭 포인트로 사용할 십자 표시를 합니다. 글라스 슬라이드를 MALDI 슬라이드 어댑터 플레이트에 넣고 스캐너를 사용하여 샘플의 광학 이미지를 획득합니다. 컴퓨터에서 이미지를 확인하고 화면에 나타나도록 사진을 회전시킵니다.동일한 방향으로 시료를 기기에 배치합니다. 기기 제조사에서 제공하는 소프트웨어를 사용하여 래스터 스텝 크기는 50 µm로, 레이저 직경은 래스터 스텝 크기와 같거나 더 작게 설정하여 이미지 획득 파일을 생성합니다. 그다음, 광학 이미지를 소프트웨어로 불러와 플레이트를 광학 이미지에 맞춰 정렬합니다.기기를 보정한 후, 블랭크로 사용할 슬라이드 상의 순수 매트릭스 지점을 포함하여 MSI로 분석할 조직 영역을 지정하십시오. 그 다음, 데이터 획득을 시작하십시오. 데이터 획득이 완료되면 벤더에서 제공한 소프트웨어에서 이미징 파일을 열고, 질량 분석 스펙트럼에서 관심 있는 특정 질량 대 전하비를 선택하여 이온 이미지를 추출하십시오. 해당 소프트웨어를 사용하여 추가 식별을 위해 관심 있는 특정 분석물 목록을 작성하십시오.표적 분석 물질의 추정 식별을 결정하기 위해 정확한 질량 데이터베이스 검색을 수행합니다. 정확한 질량 데이터베이스 검색을 통한 추정 식별 결과가 표적 분석 물질의 ms/ms 스펙트럼과 표준 물질, 문헌 및/또는 단편화 예측 소프트웨어의 ms/ms 스펙트럼과 일치하는지 확인합니다. 여기에 표시된 것은 mego Tula 뿌리 结节 단면의 광학 이미지입니다.에어브러시, 자동 분무기 및 승화법을 각각 사용하여 매트릭스 도포 범위와 결정 크기를 확인한 광학 이미지 예시입니다. 에어브러시 도포법은 크고 작은 결정들을 생성합니다. 자동 분무기 방식은 크기가 균일한 작은 결정들을 생성하는 반면, 승화법은 매트릭스의 균일한 단일 층을 형성합니다.DHB와 같은 일반적인 매트릭스는 500 Daltons 미만의 낮은 질량 범위에서 많은 이온을 생성합니다. 이러한 매트릭스 이온은 이 범위 내의 대사산물 검출을 방해할 수 있습니다. 여기는 DHB 매트릭스만 사용한 경우와 DHB 매트릭스를 코팅한 뿌리혹 조직을 비교한 MS 스펙트럼입니다.MS 이미지를 사용하여 매트릭스 피크와 실제 대사물을 구별할 수 있습니다. 피크를 클릭하면 이온 이미지가 추출되어 광학 이미지 위에 겹쳐져 표시됩니다. 조직 내에 뚜렷한 국소화 이미지를 생성하며 매트릭스만 촬영된 영역에는 나타나지 않는 피크를 대사물로 간주합니다. 여기에는 뿌리 결절 조직에서 발견된 대사물의 대표적인 이온 이미지 몇 가지가 나와 있습니다.매트릭스 관련 피크에 해당하는 MS 이미지 예시가 여기에 나와 있지만, 본 이미지는 뿌리혹 조직에 뚜렷하게 국소화되어 있으며 이미징된 매트릭스 전용 영역에서는 신호가 나타나지 않음을 보여줍니다. 이 신호는 국소화 정도가 낮으며 전체 조직에 걸쳐 나타납니다. 또한, 이미징된 매트릭스 전용 영역에서도 신호가 관찰됩니다.비표적 대사체학 실험의 최종 목표는 생물학적으로 중요한 분석물을 검출 및 결정하고 관심 화합물을 식별하는 것입니다. MSI 및 LCMS로 검출된 대사체 중 하나의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 이 대사체는 고해상도 LCMS로 수집된 정확한 질량과 MSM MSS 스펙트럼을 기반으로 heme으로 식별되었습니다.이 MSMS 데이터는 Shima와 Sato가 이전에 발표한 MSMS 스펙트럼과 비교되었으며, 두 MSMS 스펙트럼이 일치하였습니다. 따라서 정확한 질량 데이터베이스 검색과 문헌의 MSMS 데이터와의 비교를 통해 질량 대 전하비 616.02의 정체를 heme으로 확신 있게 지정하였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 다양한 조직 유형과 모델 시스템의 소분자 연구에 적용 가능한 방법을 사용하여 생물학적으로 관련 있는 대사물을 검출하고 공간적 분포를 매핑하기 위해 MALDI 질량 분석 이미징을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

maldi-mass-spectrometric-imaging-for-investigation-metabolites

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

대기압에서 작동하는 질량 분석 이미징(MSI) 소스는 중적외선 레이저 탈착과 전기 분무 후 이온화를 결합하여 개발되었습니다. 외인성 얼음 매트릭스는 조직 관련 물질의 공명 탈착을 촉진하기 위해 에너지 흡수 매트릭스로 사용되었습니다. 이 원고는 전신 신생아 마우스의 IR-MALDSI MSI를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

적외선 매트릭스 보조 레이저 탈착 전자 분무 이온화에 의한 전신 질량 분석 이미징 (IR-MALDESI)

잎 스프레이 질량 분석 샘플 준비를 최소화 하 고 착 색 인쇄기, 식물 조직에서 작은 분자의 급속 한 탐지에 대 한 수를 제거 하는 직접적인 화학 분석 기술 이다.

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

이 방법은 xenobiotics에 드러날 때 S. 알바 잎에 있는 신진 대사 과정을 이해하기 위하여 질량 분광법 화상 진찰 (MSI)를 이용합니다. 이 방법을 사용하면 관심 있는 화합물과 예측된 대사산물의 공간 적 국소화를 특정, 그대로 조직 내에서 할 수 있습니다.

살릭스 알바에서 제노바이오틱스 대사에 대한 조사는 질량 분광화상 영상을 통해 나뭇잎

마이크로코일을 이용한 초고장 자기 공명 현미경검사법(MRM)을 이용하여 고공간 분해능에서 생물학적 조직을 연구하는 프로토콜이 제시된다. 마이크로코일을 특성화하기 위한 단계별 지침이 제공됩니다. 마지막으로, 이미징의 최적화는 식물 뿌리에서 입증됩니다.

MRM 마이크로코일 성능 교정 및 사용 에 설명 된 메디카고 트런카툴라 뿌리에 22 T

이 프로토콜의 목표는 생물학적 샘플에서 대사 및 분자 검출을 최대화하기 위해 MALDI MSI를 사용하여 실험을 계획할 때 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.

MALDI 질량 분광화상 영상을 이용한 대사 프로파일링을 위한 샘플 준비

본 연구에서는 플랜트에서 DESI-MSI 샘플을 준비하기 위한 일련의 방법을 제시하고, DESI 어셈블리 설치, MSI 데이터 수집 및 처리 절차를 상세히 설명한다. 이 프로토콜은 식물에서 공간 대사체 정보를 획득하기 위한 여러 조건에 적용될 수 있습니다.

DESI-MSI를 이용한 중국 전통 의학의 공간 대사체에서 확인된 대사산물의 시각화

이 프로토콜은 MALDI-IMS 분석을 위해 수분 함량이 낮은 경질 종자 샘플 절편 준비에 대한 자세한 지침을 설명하고, 분석물의 원래 분포 및 풍부도를 유지하고, 고품질 신호 및 공간 분해능을 제공하는 것을 목표로 했습니다.

Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis

뇌 오가노이드의 질량 분석 이미징(MSI)을 위한 고급 방법이 개발되어 이러한 모델 내에서 대사 산물 분포를 매핑할 수 있습니다. 이 기술은 초기 발달 및 질병 단계에서 뇌 대사 경로와 대사 산물 서명에 대한 통찰력을 제공하여 인간의 뇌 기능에 대한 더 깊은 이해를 약속합니다.

질량분석법을 사용한 인간 뇌 오가노이드의 분자 이미징 

털이 루트 복합 식물이 어려운 변환 종의 식물 rhizobi​​um 상호 작용과 유괴를 공부하는 데 사용할 수있는 방법을 우리가...

의 복합 식물의 생성 Medicago truncatula 유괴의 Assays 사용

배우세요 MALDI 질량 분석 이미징을 사용하여 Medicago truncatula 뿌리 결절의 내인성 대사 산물을 검출하고 공간 분포를 매핑하는 방법을. 이 기술은 식물 조직의 생물학적 과정을 이해하는 데 귀중한 통찰을 제공합니다.

의 대사 산물의 조사를위한 MALDI-질량 분석 이미징

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