형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

다음 실험의 전반적인 목표는 나일 적색 형광 염료를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 세포벽과 세포막을 투과할 수 있도록 에탄올 용액에 세포를 현탁시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 나일 적색 형광 염료가 첨가되어 세포에 들어가 중성 지질체를 포함한 세포의 비극성 영역에 축적됩니다.

다음으로, 샘플을 530나노미터의 여기 광원에 노출시켜 중성 지질체에 흡수된 나일홍색이 604나노미터에서 형광을 발하도록 합니다. 결과는 마이크로 웰 멀티플에서 개별 테스트를 수행하고 분광 광도계를 사용하여 빠른 형광 판독값을 생성함으로써 대규모로 얻어집니다. 판독값은 lgal 세포의 중성 지질 함량과 형광 측정의 강도 사이의 선형 관계를 보여줍니다.

형광 측정을 오일 함량으로 변환하는 것은 알려진 오일 조성의 세포로 준비된 검량선을 사용하여 달성할 수 있습니다. Bly dire 중량 측정 방법과 같은 기존 프로토콜에 비해 이 기술의 주요 장점은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있는 재료를 사용하여 중성 지질 함량을 신속하게 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 조류 배양 중 바이오 프로세스 성능에 대한 즉각적인 피드백을 제공합니다.

또한 96 Well 플레이트 리더가 허용하는 높은 처리량은 스크리닝 연구 및 요인 실험에 이상적입니다. 이 기술은 클로렐라와 Desus에 최적화되어 있지만 다른 lgal 종의 분석을 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 그래. 먼저 성장하는 조류 배양물에서 최소 200mg의 건조 바이오매스를 제공할 수 있는 샘플 부피를 제거합니다.

400-600mg이 바람직합니다. 4 섭씨 온도에 10 분 동안 10, 000 시간에 표본을 분리기로 만드십시오. G, 상층액을 버리고 성장 배지와 동일한 pH로 제형화된 동일한 부피의 인산염 완충액으로 펠릿을 세척합니다.

이 과정을 총 3단계 세탁에 반복합니다. 펠릿을 탈이온수에 다시 현탁시키고 미리 계량된 계량 접시로 옮깁니다. 샘플을 섭씨 50도에서 48시간 동안 건조시킵니다.

건조된 조류 배양물은 향후 사용을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. 유청 접시에 약 50mg의 건조 조류 바이오매스를 측정합니다. 필요한 경우 바이오매스를 헥산으로 미리 세척된 모르타르로 옮기고, 바이오매스를 모르타르 주문으로 완전히 옮기기 위해 과거 피펫을 사용하여 소량의 헥산으로 유청 접시를 씻습니다.

다음으로, 유봉을 사용하여 조류 바이오매스를 5분 동안 갈아줍니다. 부드럽게 분쇄하는 것으로 시작하여 점차적으로 강도를 높입니다. 바이오매스를 가늘고 부드러운 페이스트로 갈아줍니다.

5분 동안 모르타르에 몇 밀리리터의 헥산을 첨가하고 생성된 슬러리를 균질화될 때까지 유봉과 혼합합니다. 모르타르 벽에 부착된 모든 세포 파편이 두드려져 액체에 부유하는지 확인하십시오. 다음으로, 헥산 세포 질량 혼합물을 호환 가능한 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

모든 바이오매스가 원심분리기 튜브로 옮겨질 때까지 3-5회 반복합니다. 4 섭씨 온도에 10, 000 시간에 20 분 동안 표본을 원심 분리하십시오. G. 원심 분리 후 상등액을 흄 후드에 보관할 수 있는 미리 계량된 금속 방식 접시에 상등액을 조심스럽게 피펫으로 넣습니다.

펠릿에 3ml의 헥산을 첨가하고 격렬하게 소용돌이하여 두 번째 헥산 추출을 수행합니다. 1분 동안 상층액의 원심분리 및 이동을 반복합니다. 헥산이 완전히 증발한 후 중량 측정으로 추출된 오일의 질량을 측정합니다.

플루오로 미터법 정량화를 위해 모든 조류 샘플을 측정에 사용된 표준물질과 동일한 바이오매스 농도 및 동일한 방식으로 준비합니다. 사전 건조된 샘플을 적절한 양의 인산염 완충액에 현탁하여 이를 수행합니다. 필요한 경우 균질기를 사용하여 건조된 유혈 세포의 현탁액을 촉진합니다.

각 샘플에 대해 80마이크로리터의 준비된 30% 에탄올 용액, 10마이크로리터의 준비된 나일 적색 용액 및 10마이크로리터의 조류 현탁액을 96웰 플레이트의 단일 웰에 혼합합니다. 형광 측정의 가변성을 적절하게 설명하려면 각 샘플에 대해 5번의 반복을 수행합니다. 다음으로, 이전에 준비된 표준물질로 2점 검량선을 실행합니다.

기기의 일일 변동을 고려하고 멀티웰 플레이트 리더 분광 광도계에서 형광 측정을 수행하기 위한 준비를 하기 위해 매개변수를 1, 200RPM으로 흔들고 30초 동안 3mm 궤도를 선회한 다음 섭씨 40도에서 10분 동안 배양합니다. 1, 200RPM으로 한 번 더 흔들고 30초 동안 3mm 궤도를 돌며 530나노미터에서 여기와 604나노미터에서 방출로 형광을 기록합니다. 그런 다음 마지막 단계로 실행을 시작합니다.

내부 표준물질의 결과를 사용하여 형광 측정값을 오일 함량으로 변환하여 형광 현미경 검사를 수행합니다. 나일 레드 염색으로 준비된 샘플을 사용하여 표준 실험실 절차에 따라 공정 샘플의 현미경 슬라이드를 준비합니다. 투과 모드의 현미경으로 시작하여 준비된 슬라이드를 현미경에 로드하고 원하는 배율에서 세포를 찾습니다.

초점이 맞춰지면 현미경을 투과에서 에피 형광 조명 모드로 전환합니다. 광원은 이제 대물 렌즈에서 직접 나와야 하며, 이는 슬라이드와 대물 렌즈 사이의 공간을 관찰하여 시각적으로 확인할 수 있습니다. 녹색 여기 필터를 광원에 삽입하고 빨간색 방출 필터를 관찰 광 경로에 삽입합니다.

염색된 세포의 형광은 이제 접안렌즈를 통해 직접 볼 수 있어야 합니다. 현미경 관찰 모드를 접안렌즈에서 장착된 카메라로 전환하고 보기 소프트웨어를 사용하여 형광 세포의 이미지를 캡처합니다. 특정 설정은 기기, 장비 및 셀 유형에 따라 다릅니다.

나일붉은염료로 염색된 대표적인 조류 세포는 과도한 질소에서 성장한 프로테가 매우 낮은 세포 내 지질 축적을 유도하는 이미지를 보여주며, 이는 질소 제한 하에서 성장한 oid의 샘플과 대조를 이룹니다. 투과 조명에서 세포의 지질체는 반짝이는 원형 구조로 나타나고 세포 부피의 대부분을 구성하는 곳을 주의 깊게 검사하여 시각화할 수 있습니다. 여기에 표시된 세포는 건조 중량 기준으로 오일이 5%에 불과하며 적절한 광 조건에서 볼 때 상당한 수준의 지질체를 포함하지 않습니다.

이러한 샘플의 차이는 확대됩니다. 기름 야윈 세포는 몸체가 어두운 형광 고리로 나타나는 반면, 기름이 풍부한 세포는 지질체가 축적된 곳에서 밝은 주황색 붉은 빛을 나타냅니다. 나일레드는 중성 지질, 세포벽에 위치한 인지질 및 비극성 세포 단백질의 존재 여부에 따라 다른 파장에서 형광을 발하기 때문에 기름 희박 세포가 어두운 몸체를 가진 형광 고리로 나타납니다.

이러한 비특이성은 또한 분석의 최적화된 조건에서 중성 지질의 분광광도계를 측정하는 동안 형광의 배경 수준을 유발하는 원인이며, 0.980보다 큰 R 제곱 값을 가진 검량선은 쉽게 달성할 수 있습니다. 세포 오일 함량과 형광 사이의 관계는 세포가 에탄올과 같은 운반체 용매가 없는 용액에서 염색되는 경우 비선형이 됩니다. 여기에 제시된 데이터는 0.395의 R 제곱을 가지며 0% 에탄올 용액에서 프로토콜을 수행하여 얻은 것입니다.

일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 15분에서 20분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 모든 샘플이 동일한 바이오매스 농도로 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 기존의 헥산 추출 프로토콜과 더 간단한 NAL 적색 형광 염색 절차를 모두 사용하여 lgal 세포의 중성 지질 함량을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.