Name: 형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 배우세요 조류 세포의 중성 지질을 Nile Red 형광 염색으로 측정하는 간단한 방법을. 에탄올 처리와 530nm 여기광을 사용하여 604nm에서 형광을 측정하고, 이 기법은 바이오프로세스 모니터링에 효율적입니다.

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저자는이 프로젝트에 대한 재정 지원을 제공하기 위해 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 건조 해조류 바이오 매스의 분리 형광 판독을위한 기준으로 사용되는 <ol><li> 건조 바이오 매스의 적어도 200 밀리그램을 제공 할 것입니다 성장하는 조류 배양에서 샘플 볼륨을 제거, 400 ~ 600 밀리그램이 바람직하다. </li><li> 10,000 × g에서 10 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 성장 미디어와 같은 pH로 공식화 인산염 완충액 같은 부피와 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 3 세척 단계의 총 단계 1.2를 반복한다. </li><li> 탈 이온수의 펠렛을 다시하면 일시 중지하고 무게를 미리 무게를 접시에 전송할 수 있습니다. 48 시간 동안 50 ℃에서 건조시켜주십시오. 참고 : 진공 상태에서 건조하면 건조 시간을 단축하고 50 ° C 이상의 온도에서 문화를 건조하는 것은 재 부상을 어렵게 만들 수 있습니다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 상온에서 저장, 건조 해조류 문화. </li></ol> 헥산 추출 중성 지질의 2. 중량 측정 정량화 (Bligh 고와 다이어 4에서 적응) <ol><li> 무게 접시에 건조 해조류 바이오 매스의 약 50 밀리그램을 측정합니다. 주 : 40 ~ 80 밀리그램에 이르기까지 대중 재현성의 손실없이 사용할 수 있습니다. </li><li> 박격포 헥산으로 미리 세척에 바이오 매스를 전송합니다. 필요한 경우, 완전 모르타르에 바이오 매스를 옮기기 위하여 파스퇴르 피펫을 사용하여 소량의 헥산 (1 ㎖)로 계량 접시 세척. 참고 : 헥산이 높은 휘발성과 독성 물질이다. 그것은 적절한 보호 복 흄 후드에서 처리해야합니다. </li><li> 유봉을 이용하여 5 분 동안 조류 바이오 매스를 분쇄. 부드러운 연마로 시작하고 점차 강도를 증가시킨다. 5 분 동안의 미세하고 부드러운 붙여 넣기로 바이오 매스를 갈기. 모르타르에 바이오 매스를 전송할 때 과량의 헥산을 사용하는 경우, 헥산 연삭 전에 증발 기다리는 것이 최상이다. </li><li> 박격포에 헥산 수 ml를 추가하고이 균질화 될 때까지 유 봉 생성 된 슬러리를 혼합한다. 모든 세포 파편이 MOR의 벽에 부착되었는지 확인타르는 무료 두드려 액체에 일시 중단됩니다. </li><li> 원심 관에 헥산 - 세포괴 혼합물을 전송. 참고 : 원심 분리 관은 유리 또는 테플론 헥산과 호환되는 적절한 고분자이어야합니다. </li><li> 모든 바이오 매스는 원심 분리 관 (3 배)로 전송 될 때까지 반복하여 2.4 및 2.5 단계를 반복합니다. </li><li> 원심 분리기 10,000 × g에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플. </li><li> 조심스럽게 미리 무게 금속 접시의 무게에 뜨는을 피펫. 흄 후드에 저장합니다. </li><li> 펠렛에 헥산 3 ㎖를 추가하고 1 분 동안 격렬하게 소용돌이로 교반하여 2 차 헥산 추출을 수행합니다. </li><li> 반복은 2.7 및 2.8 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 모든 세포 파편이 완전히 정착하기 위해 두 번째 추출 동안 원심 분리기에서 30 분 동안 샘플을 실행합니다. 헥산이 증발 한 후 중량 측정 추출 오일의 질량을 결정합니다. </li></ol> 나일 레드를 사용하여 중성 지질 3. 형광 측정 정량화 (REPOR로테드 드 라 Hoz라고 Siegler 등. 11에 의해) 참고 : 5g / L에서 조류 현탁액의 10 μL가 형광 판독 필요합니다. 일반적으로, 배양액의 1.5 ML에서 건조 해조류 바이오 매스의 분리가 충분 이상입니다. 또, 분광 광도계에서 램프의 빛의 세기는 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다. 그것은 악기의 변화는 측정에 불필요한 오류를 추가하지 않도록 모든 실험에서 기준을 포함​​하는 것이 좋습니다. <ol><li> 알코올 시약 급 에탄올 10 μg / ml의 농도로 나일 레드 용액을 준비한다. 4 ° C에서 어둠 속에서이 솔루션을 저장 </li><li> 4 ℃에서 탈 이온수 및 저장에 30 % (v / v) 에탄올 용액을 제조 </li><li> 같은 바이오 매스 농도 (/ L 5g 권장)에서와 측정에 사용되는 기준과 동일한 방식으로 모든 조류의 샘플을 준비합니다. 적절한 양의 하나를 중단 미리​​ 건조 샘플하여이 작업을 수행인산염 완충액 (0.6 g / L 칼륨, 제 2 인산, 1.4 g / L의 칼륨 인산) 또는 탁도를 측정 한 후, 인산 완충액으로 5g / L로 증가 조류 배양의 농도를 조정. 참고 : 라이브 조류 배양에서 수행되는 측정은 종종 탁도 보정 곡선의 정밀도에 따라 그와 관련된 더 큰 과실이있을 것이다. 건조 된 샘플을 완전히 재현 탁하여 바이오 매스를 분산시키는 호모 게 나이저를 사용하는 방법을 필요로 할 수있다. </li><li> 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 하나의 잘에 30 % 에탄올 용액 80 μL, 나일 레드 용액 10 μL, 그리고 조류 현탁액의 10 μl를 섞는다. 적절 형광 측정의 변동을 고려하기 위해서, 각 샘플을 5 회 반복 수행한다. </li><li> 악기와 준비 일상적인 변동을 고려하기 위해 미리 제조 기준을 두 포인트 보정 곡선을 실행합니다. 발을 이용한 형광 측정 용 표준 준비샘플로 AME 절차. 참고 : 일반적으로 두 점은 악기의 재 교정을 위해, 3 점 선형성을 확인하기 위해 실행할 수있는 충분합니다. </li><li> 멀티 웰 플레이트 리더 분광 광도계의 형광 측정을 수행합니다. 다음 조건은 가장 일관된 결과 (11)를 수득 발견 하였다 : <ol><li> 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어. </li><li> 10 분 동안 40 ° C에서 알을 품다. </li><li> 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어. </li><li> 기록 형광, 530 nm에서 여기, 604 nm에서 방출. </li></ol></li><li> 내부 표준의 결과를 이용하여 유분을 형광 측정을 변환. </li></ol> 4. 형광 현미경 기술 NOTE : 섹션 3에 기재된 염색 프로토콜은 정량 분석​​을 위해 설계되지만, 또한 교육 및 예시를 위해 PU 스며 기반 기술의 시각적 표현을 제공하는 것이 유용 할 수있다rposes. 샘플 형광 하나의 이미지를 생성하려면 기존의 전송 및 추가 표면 형광 조명 소스와 광학 현미경이 필요합니다. 530 nm의 (녹색) 및 604 nm의 (적색) 범위의 여기 및 발광 광 필터는 각각 나일 레드 얼룩뿐만 아니라 관련 소프트웨어와 현미경 장착 된 카메라가 필요합니다. 이 연구 결과 (도 1)에 도시하는 이미지는 RGB 변환 부에 카메라와 흑백 구비 명 시야 현미경을 사용하여 획득 하였다. 이러한 도구를 사용하여 나일 레드 형광 이미지를 생성하는 절차는 아래에 설명되어 있습니다 : <ol><li> 프로토콜의 제 3 항에 따라 나일 레드 얼룩과 문화의 샘플을 준비합니다. NOTE : 5g / L의 농도 범위에있는 샘플에서는 혼잡없이 적절한 세포 밀도의 슬라이드를 생성한다. </li><li> 염색 프로토콜의 단계 3.6를 완료 한 후, 표준 실험실 절차에 따라 처리 된 시료의 현미경 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 전송 모드에서 현미경을 시작으로, 현미경에 준비된 슬라이드를로드하고 원하는 배율 (이 문서에 표시된 이미지가 100X의 목적으로 취득한)에서 세포를 찾습니다. </li><li> 집중되면, 표면 형광 조명 모드로 송신으로부터 현미경을 전환. 광원은 이제 (이것은 슬라이드와 대물 렌즈 사이의 공간을 육안으로 관찰함으로써 확인 될 수있다), 대물 렌즈로부터 직접 올 것이다. </li><li> 관찰의 빛 경로에 광원과 적색 발광 필터에 녹색 여기 필터를 삽입; 염색 된 세포의 형광 지금 접안 렌즈를 통해 직접 볼 수 있어야합니다. </li><li> 마운트 카메라에 접안에서 현미경 관찰 모드를 전환 한 세포의 형광 이미지를 캡처 시청 소프트웨어를 이용한다. 카메라의 감도에 따라 샘플은 처음에 (미리보기 창에 표시되지 않을 수도 화면, 즉 것) 검은 색으로; 이 문제를 해결하기 위해, 세포를 볼 수 있습니다 수준으로 노출 시간과 카메라의 게인을 조정합니다. 특정 설정은 악기, 장비, 세포 유형에 따라 다르다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

표준 곡선에 사용 된 조류는 그 측정되는 것과 같은 실험 조건에서 재배 같은 종해야합니다. 미디어 구성, 재배 기술 및 염색 프로토콜의 중요한 변화는 형광 독서의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. (섹션 1 및 2에 기재되어 있음)의 헥산 추출에 사용되는 표준 곡선 샘플의 중성 지질 함량을 결정하는 데 사용되었다. 정확한 형광 강도 측정의 경우, 모든 샘플은 같은 미생물 농도 (5g / L이 연구에 사용 된)에서 분석해야합니다. 유분은 쉽게 표준 곡선과 비교함으로써 결정될 수있다. 이 프로토콜에 대한 조류가 질소원 (0.2 내지 2.0 g / L)와 같은 탄소 소스 (30g / L) 및 글리신과 같은 포도당과 종속 영양 상태 (28 ° C, 100 RPM)에서 쉐이크 플라스크에서 배양 하였다. 자세한 미디어 조리법을 위해, 표 1을 참조하십시오. 수행에 중요한 고려 사항프로토콜은 표준 곡선을 준비 할 때 젖은 조류 바이오 매스를 건조하기위한 조건입...

인해 특정 스트레스 조건하에 지질 체를 저장할 수있는 능력으로, 조류 전위 재생 연료 원 1,2로서 최근 주목을 받아왔다. 중성 지질은 적절한 성장 조건 3에서 세포 건조 중량의 60 %를 차지하고 있습니다. 그러나 업계는 제대로, 생물 공정의 성능을 모니터링 문화를 분석하고, 새로운 변종에 대한 화면을 위해 조류 세포의 지질 함량을 정량하는, 간단한 청소, 신속하고 신뢰할 수있는 표준화 된 프로토콜을 가지고 있지 않습니다. Bligh 고 - 다이어 중량 측정 방법은 약 50 년 전에 개발 된 오늘날 4,5 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나 남아있다. 이 절차는, 간단하고 안정적​​이며 수행하기 쉬운 반면, 시간 소모적 인 큰 양의 샘플을 필요로하고, 독성 용매를 사용한다. 그것은 발효 실행에서 많은 샘플을 분석하거나 새로운 석유가 풍부한 균주 선별을위한 실용적되지 않습니다. 다른 방법은 ㄱ있다EEN 개발 만, 통상 첨단 장비가 필요하고 6 표준화되지 않았다. 관심의 큰 거래를 얻고있다 대체 나일 레드 얼룩입니다. 나일 레드, 비극성 환경에서 우선적으로 형광 염료, 선충 7, 효모 8, 9 박테리아, 조류 10-19 등 다양한 생물 지질 시체의 신원을 확인하거나 정량하는 데 사용되었습니다. 나일 레드를 포함하는 초기 기술은 단일 베트 광도법 또는 유동 세포 계측법 얼룩을 결합, 주로 정성 또는 반 정량적이었다. 또, 녹조류와 같은 조류의 일부 클래스는 기술 (10)의 범위를 한정 염료에 주로 불 투과성이다 두꺼운 셀 웰있다. 나일 레드 염색법에 최근 개선은 프로토콜 10, 11의 초기 단점을 무시하는보고되었습니다. 카의 존재하에 세포를 염색IER은 DMSO (10)로서 용매 또는 에탄올 10,11 안심 정량적 측정을 허용 유분와 흡광도 사이의 관계를 선형화한다. 용매 나일 레드 분자가 통과 할 수 있도록 세포막을 투과 돕는다. 또한, 마이크로 플레이트 판독 기능을 분광 광도계를 통합하는 것은 정량 분석​​에 적합한 높은 처리량 프로토콜을 가능하게한다. 이 문서에서 우리는 세부 사항에있는 에탄올, 중성 용매의 존재 나일 레드와 문화를 염색하여 조류 세포의 오일 함량을 측정하는 간단한 방법. 가장 정확하게하기 위해 측정에서 배경 노이즈를 차지하고, 유분으로 형광 강도를 상관 표준 곡선은 공지 된 오일 조성물의 조류 세포를 사용하여 개발된다. 이 방법은 이전에 발행 된 프로토콜 10, 11에서 적응됩니다. 96 - 웰 분광 광도계를 사용하여, 하나는 시간 그쪽에서 샘플의 동일한 양을 분석 할 수있다t는 중량 측정 방법으로 모니터링 할 수 일이 걸릴 것입니다. 또한, 원하는 조류 종의 대표 샘플을 사용하여 교정하여이 방법은 직접 해석 비교적 정확한 측정을 생산하고 있습니다. 다른 긴장과 애플리케이션에 최적화 나일 레드와 조류를 염색하는 방법을 요약 많은 프로토콜이 존재한다; 그것은 더 많은 종과 클래스에 대한 가능성이 적합하지만 여기에 제시된 프로토콜은 원래, Auxenochlorella의 protothecoides에 드 라 Hoz라고 Siegler 등. (11)에 의해 클로렐라 심상 성, Scenedesmus의 dimorphus 및 Scenedesmus의 obliquus을 개발했다. 이 모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램으로 설계되고있어 성장 문화에서 이전에 건조 된 샘플 및 젖은 샘플 동일하게 작동합니다.

<table><tbody><tr><td>건조 중량</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25ml 일회용 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>피펫 전구</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40ml Nalgene 테프론 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td> 헥산 계량 접시에 <td>필요한 테프론</td></tr><tr><td>(폴리프로필렌)</td><td>Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>건조 오븐 (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>보관 바이알</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>벤치탑 마이크로 원심분리기 (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>중량 측정 정량화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도자기 모르타르 (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>도자기 유봉 (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40 ml 원심분리 튜브 (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>유리관을 사용할 수도 있습니다</td></tr><tr><td>파스퇴르 유리 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 무게 접시</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>오일 함량</td><td></td><td></td><td></td>의 형광 정량화</tr><tr><td>형광 멀티 웰 플레이트 리더</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>형광 리더 소프트웨어</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent 소프트웨어 2.6</td><td></td></tr><tr><td>COSTAR 96 웰 플레이트(둥근 바닥 포함</td>) <td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 (알코올 시약 등급)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>이미징 형광 세포</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMRXA2 (또는 동급) 현미경</td><td>Leica</td><td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 슬립</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>이미징 소프트웨어</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

조류는 자연 지질 저장 기능으로 인해 신 재생 연료 원에 대한 우수한 후보로 간주됩니다. 조류 발효 공정과 새로운 석유가 풍부한 균주에 대한 심사의 강력한 모니터링은 세포 내 지질 함량의 측정을위한 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 현재 관행이 기름 내용을 결정하기 위해 크게 중량 측정 방법에 의존, 기술은 시간이 소요되며 많은 양의 샘플을 필요로 수십 년 전에 개발. 본 논문에서는, 나일 레드, 생물의 다양한 종류의 지질 기관의 존재를 식별하는 데 사용 된 형광 염료는 Auxenochlorella의 protothecoides의 중성 지질 함량, 녹색을 측정하기위한, 간단하고, 빠르고, 믿을 수있는 프로토콜에 통합 조류. 방법은 염색 전에 세포막 및 형광 세기 측정 중에 샘플 용량을 증가 96 웰 마이크로 플레이트를 투과하는, 에탄올, 비교적 온화한 용매를 사용한다. 그것은 설계되었습니다모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램과 ED. 성장 배양 물로부터 샘플을 건조 또는 살아있는 샘플 분석에 사용될 수있다.

나일 붉은 염료로 염색 대표 조류 세포를 그림 1에 나타내었다. 파트 A와 파트 A의 그림 1 디스플레이 이미지의 B protothecoides 매우 낮은 세포 내 지질 축적에 이르는, 과잉 질소에서 성장. A. 일부 C와 D, 샘플 질소를 제한 한 성장에 따라 protothecoides이 표시됩니다. 투과 조명 하에서, 세포의 지질 체들은 반짝이 원형 구조로 표시하고 세포 부피의 대부분을 구성하는도 1C, 조심 검사로 시각화 할 수있다. 과잉 질소 중에서 성장시켰다도 1a에 도시 된 셀은, 건조 중량으로 5 % 오일이며 지질 체의 유의 수준을 포함하지 않는다. 적절한 조명 조건 아래에 표시하면,이 샘플...

나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다.

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

다음 실험의 전반적인 목적은 Nile red 형광 염료를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 측정하는 것입니다. 이는 먼저 세포를 에탄올 용액에 현탁하여 세포벽과 세포막의 투과성을 높임으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로 Nile red 형광 염료를 첨가하면, 염료가 세포 내로 들어가 중성 지질체(neutral lipid bodies)를 포함한 세포의 비극성 영역에 축적됩니다.다음으로, 샘플을 530 nanometers의 들뜸 광원에 노출시켜 중성 지방체에 흡수된 Nile red가 604 nanometers에서 형광을 발하도록 합니다. 개별 테스트를 마이크로 웰 멀티플에서 수행하고 분광광도계를 사용하여 신속하게 형광 수치를 측정함으로써 대량의 결과를 얻습니다. 측정 결과는 조류 세포의 중성 지방 함량과 형광 측정 강도 사이에 선형 관계가 있음을 보여줍니다.형광 측정값을 오일 함량으로 변환하는 것은 알려진 오일 조성을 가진 세포로 작성된 검정 곡선을 통해 수행할 수 있습니다. Bly dire 중량법과 같은 기존 프로토콜과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 대부분의 실험실에서 사용 가능한 재료를 사용하여 중성 지질 함량을 신속하게 결정할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 조류 배양 중 바이오 공정 성능에 대한 즉각적인 피드백을 제공합니다.또한, 96-웰 플레이트 리더를 통해 구현되는 높은 처리량은 스크리닝 연구와 요인 설계 실험에 이상적입니다. 이 기술은 chlorella 및 s Desus에 최적화되었지만, 다른 조류 종의 분석을 위해 쉽게 수정될 수 있습니다. 우선, 최소 200 mg의 건조 바이오매스를 확보할 수 있는 양의 배양 중인 조류 배양액 샘플을 채취하십시오.400~600 mg이 적당합니다. 샘플을 4 °C에서 10,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 배양액과 동일한 pH로 조제된 인산 완충액을 펠렛과 동일한 부피로 넣어 세척합니다.이 과정을 총 3회의 세척 단계 동안 반복합니다. 펠렛을 탈이온수에 재현탁하여 미리 무게를 측정한 무게 접시로 옮깁니다. 샘플을 50 °C에서 48시간 동안 건조시킵니다.건조된 조류 배양물은 추후 사용을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. 유청 접시에 약 50 milligrams의 건조 조류 바이오매스를 측정합니다. 바이오매스를 필요한 경우 헥산으로 미리 세척한 막자사발로 옮기고, 바이오매스를 막자사발로 완전히 옮기기 위해 파스퇴르 피펫을 사용하여 유청 접시를 소량의 헥산으로 세척합니다.다음으로, 유발을 사용하여 조류 바이오매스를 5분 동안 갈아줍니다. 처음에는 가볍게 갈기 시작하여 점차 강도를 높입니다. 바이오매스가 곱고 부드러운 페이스트 상태가 될 때까지 갈아줍니다.5분 동안 막자에 헥산 몇 밀리리터를 가하고, 생성된 슬러리가 균질해질 때까지 섞어줍니다. 막자 벽면에 붙은 모든 세포 파편이 떨어져 나와 액체에 부유하도록 합니다. 다음으로, 헥산 세포 질량 혼합물을 적절한 원심분리 튜브로 옮깁니다.모든 바이오매스가 원심분리 튜브로 옮겨질 때까지 이 과정을 3~5회 반복합니다. 시료를 4 °C에서 10,000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 상층액을 미리 무게를 잰 금속 웨잉 디쉬(weighing dish)에 조심스럽게 파이펫으로 옮긴 후, 흄 후드 내에 보관합니다.펠렛에 3 mL의 hexane을 추가하고 격렬하게 볼텍싱하여 두 번째 hexane 추출을 수행합니다. 1분 동안 원심분리와 상층액 전송 과정을 반복합니다. hexane이 완전히 증발한 후, 중량 분석법을 통해 추출된 오일의 질량을 측정합니다.형광 측정 정량을 위해, 모든 조류 시료를 측정에 사용된 표준 물질과 동일한 생물량 농도로, 그리고 동일한 방식으로 준비하십시오. 미리 건조된 시료를 적절한 양의 인산염 완충액에 현탁하여 이를 수행합니다. 필요한 경우, 건조된 조류 세포의 재현탁을 용이하게 하기 위해 균질기를 사용하십시오.각 샘플에 대해 미리 준비한 30% ethanol 용액 80 µL, Nile red 용액 10 µL 및 조류 현탁액 10 µL를 96-well 플레이트의 단일 웰에 혼합합니다. 형광 측정의 변동성을 적절히 반영하기 위해 각 샘플당 5회 반복 실험을 수행합니다. 그 다음, 이전에 준비한 표준 물질을 사용하여 2점 교정 곡선을 작성합니다.멀티웰 플레이트 리더 분광광도계에서 형광 측정을 수행할 때 기기 및 준비 과정의 일별 변동성을 고려하기 위해, 1,200 RPM으로 3mm 궤도 진동(orbit)을 30초 동안 수행하고, 이어서 40 °C에서 10분 동안 배양하도록 파라미터를 설정하십시오. 다시 1,200 RPM으로 3mm 궤도 진동을 30초 동안 수행한 후, 들뜸 파장(excitation) 530 nm, 방출 파장(emission) 604 nm에서 형광을 기록하도록 설정합니다. 마지막 단계로 측정을 시작하십시오.형광 현미경 관찰을 위해 내부 표준물질의 결과를 이용하여 형광 측정값을 오일 함량으로 변환하십시오. Nile red 염색액으로 준비한 시료를 사용하여 표준 실험실 절차에 따라 공정 시료의 현미경 슬라이드를 제작하십시오. 현미경을 투과 모드로 설정한 상태에서 준비된 슬라이드를 장착하고 원하는 배율에서 세포를 찾으십시오.초점이 맞춰지면 현미경을 투과 조명 모드에서 에피 형광 조명 모드로 전환하십시오. 이제 광원이 대물렌즈에서 직접 나와야 하며, 이는 슬라이드와 대물렌즈 사이의 공간을 시각적으로 관찰하여 확인할 수 있습니다. 광원에는 녹색 여기 필터를 삽입하고, 관찰 광로에는 적색 방출 필터를 삽입하십시오.염색된 세포의 형광이 이제 접안렌즈를 통해 직접 보여야 합니다. 현미경 관찰 모드를 접안렌즈에서 장착된 카메라로 전환하고, 뷰잉 소프트웨어를 사용하여 형광 세포의 이미지를 캡처하십시오. 구체적인 설정은 기기, 장비 및 세포 유형에 따라 달라집니다.Nile red 염료로 염색된 대표적인 조류 세포의 이미지는 과잉 질소 조건에서 배양되어 세포 내 지질 축적이 매우 낮은 프로테(prothe)를 보여주며, 이는 질소 제한 조건에서 배양된 OID 샘플과 대조됩니다. 투과 조명 하에서 세포의 지질체는 세심한 관찰을 통해 시각화할 수 있으며, 이는 빛나는 원형 구조로 나타나 세포 부피의 대부분을 차지합니다. 여기에 표시된 세포는 건조 중량 기준 오일 함량이 5%에 불과하며, 적절한 조명 조건에서 관찰했을 때 유의미한 수준의 지질체를 포함하고 있지 않습니다.이들 샘플의 차이가 확대되어 나타납니다. 오일 함량이 낮은 세포는 어두운 세포체와 함께 형광 링 형태로 나타나는 반면, 오일 함량이 높은 세포는 지질체가 축적된 부위에서 밝은 오렌지색-붉은색 광채를 띱니다. Nile red는 중성 지질, 세포벽의 인지질 및 비극성 세포 단백질의 존재 여부에 따라 서로 다른 파장에서 형광을 발하며, 이 때문에 오일 함량이 낮은 세포는 어두운 세포체를 가진 형광 링 형태로 관찰됩니다.이러한 비특이성은 분석의 최적 조건 하에서 중성 지질의 분광광도계 측정 중 발생하는 배경 형광 수준의 원인이 되기도 하며, R square 값이 0.980보다 큰 검정 곡선을 쉽게 얻을 수 있습니다. 세포를 에탄올과 같은 운반 용매가 없는 용액에서 염색할 경우, 세포 내 오일 함량과 형광 사이의 관계는 비선형적으로 변합니다. 여기에 제시된 데이터는 R square 값이 0.395이며, 0% ethanol 용액에서 프로토콜을 수행하여 얻은 결과입니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 15분에서 20분 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 모든 시료가 동일한 바이오매스 농도로 준비되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 전통적인 헥산 추출 프로토콜과 더 간편한 NAL red 형광 염색 절차를 모두 사용하여 lgal 세포의 중성 지질 함량을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 그램이시딘 채널 활동의 조치로 형광 담금질의 속도를 모니터링 빠른 형광 기반의 분석을 소개합니다. 그램이시딘 채널 지질 이중층 속성의 변화로 이중층 스패닝 단백질에 의해 감지를 모니터링하는 분자 힘 변환기로 사용됩니다.

그램이시딘 기반의 형광 분석, 지질 이중층의 속성을 수정하는 작은 분자 잠재 결정

이 동영상은 조류 세포의 중성 지질을 나일강 염료로 염색하여 검출하고 정량화하는 프로토콜을 보여줍니다.

Nile Red Staining: 조류에서 세포 내 중성 지질을 검출하고 정량화하는 기술

기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.

미세 조류의 지방산 콘텐츠 및 조성 분석

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

우리는 옵신으로 재구성된 큰 단층 리포좀에서 인지질 스크램블을 측정하기 위한 형광 기반 분석을 설명합니다.

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

여기, 우리 실험실 규모 거품 열 photobioreactors를 생성 하 고 문화 microalgae를 그들을 사용 하 여 프로토콜을 제시. 그것은 또한 문화 성장 율 및 중립 지질 내용에 대 한 메서드를 제공합니다.

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

여기서, 우리는 단백질 추출물과 트랜스포파디딜리노시톨 4-인산염이 체외에서인산염을 배출하는지 여부를 결정하기 위해 형광 지질 센서와 리포좀을 사용하는 프로토콜을 설명합니다.

형광 기반 측정 인스파디딜세린/포스파디딜리노시톨 4-인산염 교환 막 간

이 프로토콜은 세포 엑소사이토시스(exocytosis) 및 세포내이입(endocytosis) 주기 동안 지질 막 이동을 모니터링하기 위해 pH에 민감한 지질 형광단 클래스를 사용하는 형광 이미징 방법을 제시합니다.

pH에 민감한 형광 지질 아날로그 ND6를 사용한 막 지질 회전율 측정

본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.

홍조류 생리학을 평가하기 위한 자가형광 이미징

배우세요 조류 세포의 중성 지질을 Nile Red 형광 염색으로 측정하는 간단한 방법을. 에탄올 처리와 530nm 여기광을 사용하여 604nm에서 형광을 측정하고, 이 기법은 바이오프로세스 모니터링에 효율적입니다.

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

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