Name: 인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 학습하세요 인간 혈청에서 고품질 소형 비암호화 RNA를 분리하는 최적화된 방법을. 단백질 오염을 최소화하고 microRNA 수율을 극대화하여 DNA 어레이 및 정량 PCR 분석에 활용할 수 있습니다.

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사만다 Khoury와 파멜라 Ajuyah는 호주 석사 과정을 지원합니다. 우리는 또한 사만다 Khoury 자신의 추가 지원에 대한 번역 상 암 연구 네트워크, 로위 암 연구 센터, 뉴 사우스 웨일즈 대학과 북부 번역 상 암 연구 단위를 인정하고 싶습니다.

참고 : 건강한 환자 또는 암을 가진 환자에서 인간의 혈청 샘플, 로얄 프린스 알프레드 병원 시드니 (프로토콜 번호 X10-0016 및 HREC/10/RPAH/24) 기술 대학에서 승인 된 인간의 윤리 프로토콜에서 동의 얻어졌다 시드니. 혈청 샘플은 다양한 시드니 병원에서 수술 전 환자로부터 수집 및 -80 ° C.에 저장에 넣었다 혈청에서 1. 작은 RNA 격리 전체 RNA는 트라이 RT 시약의 LS 프로토콜의 변형 된 버전을 사용하여 인간 혈청으로부터 제조 하였다. <ol><li> 얼음에 냉동 혈청 샘플을 해동 한 다음 레이블 microcentrifuge 관에 갓 해동 혈청 400 μl를 전송합니다. </li><li> 자유롭게 된 RNase H 2 O 100 μL로 혈청을 희석하고 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 단백질 분해 K을 추가한다. </li><li> 프로 테 K.에 의해 단백질의 소화를 할 수 있도록 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> 티오, 완전한 용해를 보장 트라이 시약 RT LS의 1.5 배의 양 및 4 - 브로 모 아니 솔의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 간단히, 균질 반전 5 초 동안 반복 피펫 팅을 수행하고 표시된 2 ㎖ 무거운 위상 잠금 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 12,000 × g에서 균질 스핀 </li><li> 정중 신선한 DNA LOBIND 튜브로 얻어진 수용액의 적어도 1 ㎖를 가만히 따르다. 유기 계면과는 위상 잠금 튜브의 흰색 겔 아래 포획한다. </li><li> 수용액에 글리코겐의 5.0 μL (5 ㎎ / ㎖) 및 100 % 이소프로판올 500 μl를 추가 반전하여 혼합하고, -20 ℃에서 O / N을 품어 </li><li> 다음 O / N 배양, 4 ° C에서 원심 분리기에서 12,000 × g에서 20 분 동안 원심 분리기 샘플. </li><li> 맑은 상층 액을 버리고 4 ° C에서 원심 분리기에서 16,000 × g에서 2 분간 &quot;플래시&quot;스핀을 수행합니다. </li><li> 조심스럽게 분명 졸을 제거피펫을 사용하여 펠렛을 주변의 ution. </li><li> 10 분 동안 10,000 × g에서 70 %의 에탄올과 원심 분리기 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오. 세척 솔루션을 가만히 따르다 및 세척 단계를 반복합니다. </li></ol> 솔루션에 2. RNA 재 부상 <ol><li> 펠렛이 완전히 용해 보장 된 RNase H 2 O 자유로운 10 μL에 펠렛을 재현 탁. RNA가 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 샘플을 5 분 동안 55 ° C로 가열 할 수있다. 이 시간 동안 반복 피펫으로 시료를 혼합. 높은 총 RNA 수율의 경우, 동일 환자에서 두 가지 RNA 준비를 풀. </li><li> UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 재현 탁 RNA 정량과 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. 다운 스트림 응용 프로그램에 사용하기 위해 -80 ° C에서 풀링 된 RNA 샘플을 저장합니다. </li></ol>

<ol><li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li>
<li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li>
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</ol>

공개 아무것도 없다.

마이크로 RNA의 인구는 혈청에서 발견 된 총 RNA의 약 0.4 ~ 0.5 %를 구성한다. 또한 인간 혈청에서 발견 높은 단백질 함량이있다. RNA를 개선하고 단백질과 페놀 양을 줄이기 위해 우리가 여러 단계의 추가와 함께 기존의 Chomczynski 방식 9을 수정 한 오염. 우리 연구실에서 수행 할 때 전체 RNA는 표준 트라이 시약 RT-LS (분자 연구 센터)를 사용하여 혈청에서 분리 하였다 그러나이 방법은 여러 가지 오염 물질과 낮은 수량 RNA를 얻었다. 그림 1은 280 nm의, 270 nm에서의 페놀 오염, 및 230 nm에서 다른 유기 오염 물질의 단백질 오염의 증거 UV 분광 RNA 프로파일을 보여줍니다. 시약, 구 아니 디늄 티오 시아 네이트는 또한 260 nm에서 검출되었다. 낮은 혈청 RNA 수율의 ...

최근, 인간의 질병의 조기 진단을위한 새로운 바이오 마커 발견 성장 밀기가 있었다. 많은 관심 잠재적 마커와 같은 마이크로 RNA 2 (의 miRNA 또는 미르)의 작은 RNA를 사용에 초점을 맞추고있다. 이러한 작은 RNA를가 혈청 및 연구 등의 체액에서 발견되는 그들이 분해에 탄력과 다양한 환경 조건 (3)의 범위에서 안정적 보여 주었다. 이러한 기능, 혈청 또는 순환의 miRNA가 이상적인 바이오 마커 4, 5 감안할. 현재 생체 액에서 작은 RNA의 분리에 대한 두 가지 접근 방법이있다. 두 번째 방법은 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약 7과의 오랜 프로토콜을 사용하면서 첫 번째 방법은, 작은 RNA를 6 바인딩 및 용출 컬럼 기반 기술을 사용한다. 우리는 인간의 혈청에서 작은 RNA를 격리하는 간단한 효과, 열이없는 프로토콜을 개발했습니다. 분리 된 RNA는 즉시 주입니다DNA 올리고 뉴클레오티드의 배열과 RNA의 염기 서열을 포함하여 다운 스트림 애플리케이션에서 ately 사용할. 혈청에서 RNA를 분리하는 페놀 계 방법을 사용할 때 우리는 몇 가지 문제에 직면했기 때문에이 프로토콜이 개발되었다. 전통적인 Chomczynski 방법은 자주 대부분의 상용 공급 업체에서 제공 시약의 범위와 대부분의 실험실에서 사용된다. 그러나 그들의 광범위한 사용을 고려, 엄격한 가이드 라인은 지속적으로 특정 혈액이나 혈청, 체액에서 고품질의 RNA를 생산하기 위해 개발되지 않았습니다. 혈청에서 RNA를 분리와 관련된 일반적인 문제는 낮은 RNA 수율 및 격리, 특히 페놀 동안 사용 된 시약의 오염이 (가) 있습니다. 우리의 접근 방식은 정량 PCR (qPCR에)와 RNA 서열 분석 등의 다운 스트림 분석을위한 고품질의 RNA를 제공하기 위해 이러한 페놀 오염 물질을 제거한다. 우리는 더 miRNA의 배열에서이 RNA를 테스트했습니다.

<table><tbody><tr><td>Tri-Reagent RT LS</td><td>Molecular Research Center, 미국</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>RNase free H2O</td><td>GIBCO Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Finnzymes, Finland</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Phase Lock tube</td><td>5PRIME</td><td>2302830</td><td>2 ml 용량</td></tr><tr><td>DNA Lobind tube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.078</td><td>1.5 ml 용량</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10814-010</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>RNA 등급 이소프로판올</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>I9516</td><td>100%</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>John Morris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop UV-Vis 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 등급 에탄올</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>E7023</td><td>70%</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>애질런트, 미국</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간 혈청에서 작은 비 암호화 rna를의 분리

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

RNA와 그 표현의 분석은 많은 실험실에서 일반적인 기능입니다. 중요한 것은 포유 동물 세포에서 발견되는 마이크로 RNA와 같은 작은 RNA를의 등장입니다. 이 작은 RNA를은 성장, 발달 및 죽음과 많은 관심과 같은 중요한 경로를 제어하는​​ 강력한 유전자 규제 체액에서의 표현에 지시 된입니다. 이것은 암 혈청 바이오 마커로서의 가능성 응용 프로그램으로 인간의 질병에서의 조절 장애에 의한 것입니다. 그러나, 혈청에서의 miRNA 발현의 분석은 문제가 될 수있다. 대부분의 경우 혈청의 양을 제한하고, 혈청 작은 RNA를은 0.4 ~ 0.5 % 1을 구성하는 총 RNA의 낮은 금액을 포함합니다. 따라서 혈청에서 품질의 RNA의 충분한 양의 분리는 연구자들에게 중요한 도전 오늘입니다. 이 기술 문서에서는, 우리는 DNA 배열 또는 qPCR의 분석도 충분한 RNA를 얻기 위해 인간의 혈청 400 μl를 사용하는 방법을 보여줍니다.이 방법의 dvantages은 단순하고 고품질의 RNA를 생성 할 수있는 능력이다. 그것은 작은 RNA를 정제에 대한 전문적인 열을 필요로하지 않습니다 및 일반 실험실에있는 일반 시약 및 하드웨어를 사용합니다. 우리의 방법은 동시에 고품질의 RNA를 수득하면서 페놀 오염을 제거하기 위해 위상 잠금 젤을 이용한다. 또한, 상기 분리 단계에서 모든 오염 물질을 제거하는 추가 단계를 소개한다. 이 프로토콜은 혈청에서 최대 100 NG / μL의 총 RNA의 수율을 분리하는데 매우 효과적이지만 다른 생물 조직에 적용 할 수 있습니다.

그림 1은 혈청에서 분리 된 RNA의 일반적인 UV / 비스 스펙트럼을 나타냅니다. 이 프로필에서 우리는 각각 모두 270 ㎚, 230 ㎚에서의 페놀 및 유기 오염 물질을 280 nm에서 단백질의 오염을 지적했다. 잔류 구 아니 디늄 티오 시아 네이트는 260 nm에서 관찰되었다. 오염물을 줄이기 위해 최적화 일련의 단계는 표준 트라이 시약 RT-LS 절차로 만들어졌다. 우리는 총 RNA의 수율을 모두 증가하고 오염 (검은 선, 그림 1A)를 줄이기 위해 글리코겐의 5 ㎎ / ㎖를 추가했습니다. 더욱이 우리는 이소프로판올을 제거한 후 RNA 펠렛을 둘러싼 세척 완충액 대략 100-300 μL이 있다는 것을 관찰했다. 추가적인 원심 스핀 프로토콜에 첨가하고, 잔류 물을 세척 용액을 조심스럽게 제거 하였다. 이 280 nm의 (적색 추적, 그림 1B) 270 nm의에서 프로파일의 변화의 결...

이 프로토콜은 인간 혈청에서 작은 RNA를 추출하는 방법을 설명합니다. 우리는 DNA 배열에 사용하기 위해 암 혈청에서 마이크로 RNA를 분리하고 또한 singleplex 정량 PCR이 방법​​을 사용했습니다. 프로토콜은 고품질의 RNA를 수득 수정하여 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약을 이용한다.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 혈청 샘플로부터 고품질의 RNA를 분리하는 것입니다. 이를 위해 일반적인 MRC try 시약 RTLS 프로토콜의 최적화된 버전을 사용합니다. 우선 단백질 오염을 줄이기 위해 nuclease free water로 혈청을 1:5 비율로 희석하여 이를 수행합니다.두 번째 단계는 첫 번째 원심분리 단계를 위해 2 mL phase lock 튜브를 도입하는 것입니다. 이를 통해 페놀 및 단백질과 같은 대부분의 오염 물질을 유기상에 가둡니다. 다음으로, 세 번째이자 마지막 최적화 단계는 12,000 ×g로 빠르게 원심분리하는 것이며, 이는 에탄올 세척 전 RNA 펠렛에서 잔류 오염 물질을 제거합니다.더 높은 총 RNA 수율이 필요한 경우, 동일한 환자로부터 얻은 두 개의 수정된 RNA 조제물을 하나로 모으는 것이 마지막 단계입니다. 궁극적으로, nuclease free water로 혈청을 가용화하고, 주요 오염 물질을 포집하기 위해 phase lock tube를 사용하며, flash spin 과정을 도입한 이 수정된 방법을 통해 혈청 RNA 분리 시 소형 non-coding RNA의 회수율을 극대화할 수 있음을 보여줍니다.표준 triol RNA 분리 프로토콜과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 간단한 수정을 통해 혈청에서 RNA 수득률을 극대화할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 혈청 내 소량으로 존재하는 small RNA로 인해 어려움을 겪습니다. 최적화된 방법과 각 단계의 시각적 자료는 이러한 RNA의 회수율을 높이고 초심자가 성공적으로 분리 팁을 수행할 수 있도록 안내할 것입니다.먼저 얼음 위에서 이전에 준비한 냉동 혈청 샘플을 해동한 후, 갓 해동된 혈청 400 µL를 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 혈청을 RNase-free water 100 µL로 희석하고 1 mg/mL 농도의 proteinase K 50 µL를 추가합니다. 그 후 희석된 혈청을 37 °C에서 20분 동안 인큐베이션하여 단백질을 충분히 소화시키고, TRI reagent RLTS 1.5 mL 및 4-prenanol 100 µL에서 완전한 가용화가 이루어지도록 합니다.균질액을 가볍게 뒤집어 섞은 후 5초 동안 반복적으로 피펫팅합니다. 그다음 혼합물을 라벨이 부착된 2 mL heavy phase lock tube에 옮깁니다. 균질액을 4

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Research

연구

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Biology

생물학

본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

RNA-단백질 상호 작용은 많은 세포 과정의 핵심에 있습니다. 여기에서는 특정 RNA를 분리하고 이와 관련된 새로운 단백질을 식별하는 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이것은 RNA가 세포에서 어떻게 조절되는지에 대한 새로운 빛을 비출 수 있습니다.

빠른 방법론에 의해 소설 RNA 결합 단백질 분리

이 프로토콜은 고밀도 지단백질 small RNA의 분리 및 정량화를 설명합니다.

작은 RNA 정량 비는 코딩을위한 고밀도 지방 단백질의 분리

Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

진 핵 세포 mRNA 단백질 복합물을 복구 하는 Oligonucleotide 기반 협동 RNA 격리 절차

이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.

RNA 시퀀싱을 사용하는 원형 RNA 식별

본 프로토콜은 진드기 타액선 및 정제된 세포밖 소포로부터 마이크로RNAs의 단리를 기술한다. 이것은 일반적으로 사용되는 시약과 공급을 결합하는 보편적 인 절차입니다. 이 방법은 또한 적은 수의 틱을 사용할 수있게하여 쉽게 시퀀싱 할 수있는 양질의 microRNA를 생성합니다.

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

학습하세요 인간 혈청에서 고품질 소형 비암호화 RNA를 분리하는 최적화된 방법을. 단백질 오염을 최소화하고 microRNA 수율을 극대화하여 DNA 어레이 및 정량 PCR 분석에 활용할 수 있습니다.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

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