인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

이 실험 절차의 전체적인 목표는 혈청 샘플로부터 고품질의 RNA를 분리하는 것입니다. 이를 위해 일반적인 MRC try 시약 RTLS 프로토콜의 최적화된 버전을 사용합니다. 우선 단백질 오염을 줄이기 위해 nuclease free water로 혈청을 1:5 비율로 희석하여 이를 수행합니다.

두 번째 단계는 첫 번째 원심분리 단계를 위해 2 mL phase lock 튜브를 도입하는 것입니다. 이를 통해 페놀 및 단백질과 같은 대부분의 오염 물질을 유기상에 가둡니다. 다음으로, 세 번째이자 마지막 최적화 단계는 12,000 ×g로 빠르게 원심분리하는 것이며, 이는 에탄올 세척 전 RNA 펠렛에서 잔류 오염 물질을 제거합니다.

더 높은 총 RNA 수율이 필요한 경우, 동일한 환자로부터 얻은 두 개의 수정된 RNA 조제물을 하나로 모으는 것이 마지막 단계입니다. 궁극적으로, nuclease free water로 혈청을 가용화하고, 주요 오염 물질을 포집하기 위해 phase lock tube를 사용하며, flash spin 과정을 도입한 이 수정된 방법을 통해 혈청 RNA 분리 시 소형 non-coding RNA의 회수율을 극대화할 수 있음을 보여줍니다.

표준 triol RNA 분리 프로토콜과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 간단한 수정을 통해 혈청에서 RNA 수득률을 극대화할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 혈청 내 소량으로 존재하는 small RNA로 인해 어려움을 겪습니다. 최적화된 방법과 각 단계의 시각적 자료는 이러한 RNA의 회수율을 높이고 초심자가 성공적으로 분리 팁을 수행할 수 있도록 안내할 것입니다.

먼저 얼음 위에서 이전에 준비한 냉동 혈청 샘플을 해동한 후, 갓 해동된 혈청 400 µL를 라벨이 부착된 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 혈청을 RNase-free water 100 µL로 희석하고 1 mg/mL 농도의 proteinase K 50 µL를 추가합니다. 그 후 희석된 혈청을 37 °C에서 20분 동안 인큐베이션하여 단백질을 충분히 소화시키고, TRI reagent RLTS 1.5 mL 및 4-prenanol 100 µL에서 완전한 가용화가 이루어지도록 합니다.

균질액을 가볍게 뒤집어 섞은 후 5초 동안 반복적으로 피펫팅합니다. 그다음 혼합물을 라벨이 부착된 2 mL heavy phase lock tube에 옮깁니다. 균질액을 4 °C에서 12,000 ×g로 20분 동안 원심 분리합니다.

다음으로 생성된 수용액 1 mL를 조심스럽게 새 DNA low bind 튜브에 옮깁니다. 이때 유기층과 계면층은 phase lock 튜브의 흰색 젤 아래에 갇혀 있어야 합니다. 그 후 수용액에 glycogen 5 µL와 100% isopropanol 500 µL를 첨가합니다.

용액을 반전 혼합하고 -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 4 °C 원심분리기로 12,000 ×g에서 20분 동안 샘플을 원심분리합니다. 다음으로, 투명한 상층액을 제거하고 4 °C 원심분리기로 16,000 ×g에서 2분 동안 플래시 스핀(flash spin)을 수행합니다.

피펫을 사용하여 펠렛 주변의 투명한 용액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 70% ethanol 1 mL로 펠렛을 세척하고 샘플을 10,000 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 펠렛을 확인하려면 튜브를 어두운 배경 앞에서 기울여 세척액을 따라내십시오.

세척 과정을 반복합니다. 다음 단계로 넘어갑니다. 펠렛을 10 µL의 RNA free water에 현탁합니다.

샘플을 55 °C에서 5분 동안 가열하여 펠렛이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 이 과정 동안, 더 높은 총 RNA 수율 풀을 위해 동일한 환자로부터 얻은 두 개의 RNA 준비물을 반복적인 피펫팅으로 혼합하십시오. UV 분광광도계를 사용하여 재현탁된 RNA의 양을 정량하십시오.

분광광도계를 사용하고 2100 bioanalyzer를 이용해 RNA 품질을 평가합니다. 그 다음, 이후의 응용 단계에서 사용할 수 있도록 풀링된 RNA 샘플을 -80 °C에서 보관합니다. 인간 혈청 유래 RNA의 분광광도 프로파일은 기존의 Chomsky 방식에 몇 가지 단계를 추가함으로써 RNA 수율이 향상되었음을 보여줍니다.

인체 혈청에서 분리한 RNA의 전형적인 UV 프로필을 글리코젠 추가 및 추가 스핀(extra spin)을 포함한 최적화 단계를 적용한 프로필과 비교하면, 이러한 도구들을 함께 사용했을 때 오염 물질이 감소하고 총 RNA 수율이 증가하는 결과가 나타납니다. 페놀과 단백질을 포집하는 페이즈 락 겔(phase lock gel)을 사용하면 RNA 샘플의 순도를 더욱 높일 수 있습니다. 또한, 혈청의 부피를 늘리는 것이 RNA 수율에 현저한 영향을 미칩니다.

시료의 품질을 추가로 분석하기 위해 바이오아날라이저(bioanalyzer) 분석을 수행하였습니다. 약 21 nucleotides에서 나타나는 단일 피크는 micro RNA 분획을 나타내며, 이후 절차에 따라 어레이 프로파일링과 QPCR을 수행하였습니다. 세 개의 두경부암 시료와 한 개의 정상 S 시료에 대한 이 어레이 프로파일은 microRNA의 발현을 보여주며, 계층적 군집 분석(hierarchical clustering)을 통해 분석하여 microRNA의 상향 조절 및 하향 조절을 확인할 수 있는 히트맵(heat map)으로 제시하였습니다.

특정 microRNA에 대한 QPCR 증폭 곡선이 생성되었습니다. 이 데이터는 정상 혈청의 raw CT 값을 도식화하는 데 사용되었습니다. 이 기술을 숙달하면, 절차를 적절히 준수할 경우 오늘날의 최대 효율로 고품질의 RNA를 생성하여 다수의 환자를 대상으로 수행할 수 있습니다. 바이오마커 발굴 및 검증과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 정량적 PCR 또는 차세대 염기서열 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.