단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

본 실험 절차의 전반적인 목적은 단일 DNA 결합 단백질과 DNA 분자 사이의 역동적인 상호작용을 관찰하는 것입니다. 이는 사용자 정의 제작된 현미경에서 두 가지 단일 분자 기술인 이중 광집게와 형광 현미경법을 결합하여 달성됩니다. 이 장치에는 시각화를 위한 명시야 조명과 시료의 나노미터 단위 안정화 기능이 함께 갖춰져 있습니다.

두 번째 단계로, 최대 4개의 층류가 실험에 필요한 모든 구성 요소를 효율적으로 모집하고 조립할 수 있도록 마이크로 유체 시스템에 통합된 다채널 플로우 셀을 구축합니다. 다음으로, 실험을 수행하기 위해 단일 분자 구조체를 조립합니다. 먼저, 첫 번째 채널에서 이중 광학 집게를 사용하여 strip titin이 코팅된 두 개의 미세구체를 포획합니다.

그 후 트랩된 두 비드를 두 번째 채널로 이동시켜 양 끝단에 비오틴이 표지된 DNA 템플릿을 부착시킵니다. 세 번째 채널에서 DNA 힘-신장 분석(DNA force extension analysis)을 통해 단일 DNA 분자의 존재 여부를 확인합니다. 마지막으로, DNA 덤벨(DNA dumbbell)이라고 불리는 비드-DNA-비드 구조체를 형광 표지된 락토스 억제 단백질이 존재하는 단백질 채널로 이동시킵니다.

단일 신장 DNA 분자 위에서 단일 LAC eye 분자의 확산 및 특이적 결합을 보여주는 결과와 LAC eye 운동의 역학적 파라미터에 대한 정량화 결과가 도출되었습니다. 기존의 단일 분자 분석법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 분자에 가해지는 장력을 조절할 수 있다는 점, 나노미터 단위로 안정된 지점에서 결합 단백질의 움직임을 정밀하게 추적할 수 있다는 점, 그리고 커버 슬립 표면에서 충분히 떨어진 상태로 작동이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 단백질-DNA 상호작용, 특히 유전자 발현 조절의 메커니즘뿐만 아니라 표적 탐색 메커니즘에서 DNA를 따라 일어나는 단백질 확산의 역학에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법의 시연은 플로우 셀 샘플 처리 장치의 구축과 DNA 비드 구조체 조립의 실질적인 측면을 보여주는 데 매우 유용합니다. 이 비디오에서는 먼저 커버 슬립 표면에 부착된 마이크로 비드를 기준으로 사용하여 두 트래핑 레이저의 지향 안정성을 확인하는 방법을 보여줍니다. 광학 집게 설정의 설계 및 구축에 관한 자세한 내용은 동반된 프로토콜 텍스트에서 확인할 수 있습니다.

24 by 60 mm 커버슬립을 사용하여 24 by 32 mm 커버슬립 표면에 2 µL의 실리카 비드를 도포합니다. 양면테이프 두 조각을 사용하여 24 by 32 mm 커버슬립을 현미경 슬라이드 위에 부착함으로써 플로우 셀을 제작합니다.

플로우 셀을 50 millimolar 인산염 완충액으로 채우고 실리콘 그리스로 밀봉합니다. 명시야 현미경 하에서 약 2000배 배율로 실리카 비드 하나를 관찰합니다. 시야는 약 7 by 5 micrometers여야 하며, 비드 이미지의 지름이 약 190 pixels가 되도록 768 by 576 pixels로 획득합니다. 이미지 중심에서 XY 위치를 계산하고 회절 링에서 Z를 계산하여 드리프트를 보정하는 피드백 소프트웨어로 열 드리프트를 보정합니다.

나노미터 수준 또는 그 이상의 정밀도로 피조 스테이지(pizo stage)를 이동시켜 왼쪽 트랩의 중심을 비드 중심과 겹치게 한 뒤, 쿼드런트 검출기 포토다이오드(QDP)를 통해 위치 노이즈와 그 표준 편차를 측정합니다. 오른쪽 트랩에 대해서도 측정을 반복합니다. DNA 결합 단백질의 정밀한 국소화를 가능하게 하여 플로우 셀을 제작하려면, 위치 노이즈의 표준 편차가 수 나노미터 이내여야 합니다.

먼저 다이아몬드 팁을 사용하여 76 x 76 x 1 mm 크기의 현미경 슬라이드에 직경 1 mm의 구멍을 뚫어 4개의 유입구와 1개의 유출구를 만듭니다. 이를 통해 최대 4개의 완충액을 병렬로 흐르게 할 수 있습니다.

각각 실험에 필요한 서로 다른 성분인 비즈, 형광 표지 DNA 단백질 및 이미징 버퍼를 포함하고 있습니다. 에탄올로 현미경 슬라이드를 세척하고, O-링이 삽입된 포트를 액세스 홀 주변의 슬라이드 접착 링 중앙에 맞춥니다. 접착 과정에 방해가 될 수 있는 지문을 방지하기 위해 이 단계에서는 반드시 장갑을 착용해야 합니다.

두 번째 슬라이드 클램프를 사용하여 나노 포트를 슬라이드에 고정하고, 완전히 부착될 수 있도록 180 °C로 예열된 오븐에 1시간 동안 넣습니다. 그동안 종이에 플로우 셀의 외곽 패턴을 그립니다. 채널의 너비는 약 3 mm여야 하며, 현미경 슬라이드의 홀 위치와 일치해야 합니다.

도면을 두 개의 perfil 위에 놓고, 메스로 그려진 외곽선을 따라 날카롭고 연속적으로 절개합니다. 형성된 돌출부를 제거하고, 깨끗한 지지대를 보장하기 위해 사용된 하단 parfum 층은 폐기하십시오. 다음으로 나노 포트가 부착된 현미경 슬라이드를 금속 지지대에 뒤집어서 배치합니다.

파라필름 챔버 윤곽을 구멍에 정밀하게 맞추고, 파라필름이 챔버 커버의 유입구와 유출구를 가리지 않도록 주의하며 깨끗한 현미경 커버글라스를 사용하여 챔버 주변의 과잉 파라필름을 조심스럽게 제거합니다. 이전에 120 °C로 가열한 히팅 블록 두 개를 플로우 셀 위에 올려 균일한 압력을 가합니다. 파라필름이 약 25분 동안 녹도록 둡니다.

다음 단계는 가압 저장소와 완충액 용기를 준비하는 것입니다. 가압 저장소는 플렉시글라스로 제작되었으며 최대 6개의 완충액 용기를 수용할 수 있습니다. 먼저, 완충액 용기 출구에 있는 차단 밸브를 연결하십시오. 밸브 레버가 수직 위치에 있으면 완충액 흐름이 시작되고, 시계 방향으로 회전한 위치에 있으면 흐름이 차단됩니다.

실험 중에 플로우 셀을 현미경 스테이지에 장착합니다. 그런 다음 폴리에테르에테르케톤(poly ether ether ketone) 또는 PEEK 튜빙을 통해 차단 밸브를 연결하고, 플랜지리스 스피닝을 플로우 챔버 입구에 연결합니다. PEEK 튜빙의 내경은 약 150 µm이며, 내경 약 500 µm의 불소화 에틸렌 프로필렌(fluorinated ethylene propylene) 튜빙 약 3 cm를 PEEK 튜빙과 플로우 셀의 나노 포트 어셈블리 사이의 연결부로 사용합니다.

이는 챔버 입구에서의 버퍼 흐름을 줄여 플로우 셀의 파손이나 유리로부터의 나노 포트 탈착을 방지하기 위해 필수적입니다. 반면에 내경이 큰 튜빙만 사용할 경우, 다량의 생물학적 시료가 필요하게 됩니다. 플로우 챔버 출구를 대기압 상태의 열린 Falcon 튜브에 연결하십시오.

이 튜브는 유동 챔버에서 흘러나오는 버퍼를 폐기하는 용도로 사용됩니다. 이 절차를 시작하려면, 각 버퍼 용기에 1 mL의 버퍼 A를 넣고 200 mbar의 압력을 가하여 연결 튜브와 유동 셀을 세척하십시오. 압력 제어 시스템을 사용할 수 있습니다.

마지막으로, 압력 저장조 내부의 공기압을 조정합니다. 흐름의 원활함을 방해할 수 있는 기포의 존재 여부를 확인하십시오. 배출 튜브를 가볍게 튕겨 남은 기포를 제거하고, 압력을 20 millibars로 낮춘 뒤 모든 채널과 튜브에 기포가 없는지, 그리고 모든 채널에서 버퍼가 유사한 속도로 흐르는지 확인합니다.

시료를 최종 부피 300 microliters가 되도록 준비합니다. 이 실험에는 strept 코팅 폴리스티렌 비드, 락토스 억제제 결합을 위한 특정 표적 서열을 포함하며 양 끝단이 비오틴화된 선형 DNA, 그리고 형광 표지된 락토스 억제제 단백질이 사용됩니다. 각 시료를 다음 순서대로 시린지 컨테이너에 추가합니다. 첫 번째 채널에는 비드, 두 번째 채널에는 DNA, 세 번째 채널에는 이미징 버퍼, 네 번째 채널에는 표지된 단백질을 넣습니다.

유량을 20 millibars로 설정하여 켜고, 차단 밸브를 열어 샘플이 유로 내부로 들어오게 합니다. 이는 비드 채널에서 쉽게 확인할 수 있습니다. 명시야 조명 하에서 첫 번째 채널을 이미징하는 동안, 두 개의 광학 집게를 켜서 각 트랩에 폴리스티렌 비드를 하나씩 포획합니다.

다른 비드가 트랩에 빠지는 것을 방지하기 위해 두 번째 채널로 빠르게 이동하십시오. DNA 채널에 도착하면 비드 흐름이 끝나므로 쉽게 확인할 수 있습니다. 하나의 AO 광 편향기(optic deflector) 또는 OD 이동을 사용하여, 광학적으로 트랩된 두 비드 사이에 흐름으로 확장된 DNA가 부착될 수 있도록 한쪽 트랩 비드를 다른 비드 근처에서 앞뒤로 움직이십시오.

DNA 덤벨이 형성되면, 정지된 비드가 트랩에 의해 앞뒤로 능동적으로 이동하는 비드의 움직임을 따라가기 시작합니다. 빠르게 버퍼 채널로 이동하여 버퍼 흐름을 끕니다. 힘-신장 곡선(force extension curve) 분석을 수행하여 단일 DNA 분자의 존재를 확인합니다.

이는 DNA 인장력을 측정하는 동안 두 비드를 서로 분리함으로써 수행됩니다. 단일 DNA 덤벨이 확보되면, 유동을 다시 켜고 덤벨을 단백질 채널로 이동시킵니다. 광시야 형광 현미경으로 전환하여 표지된 락토스 억제 단백질과 DNA의 상호작용을 관찰하고, 유동을 끈 후 획득을 시작하십시오.

이 방법은 신장된 DNA 분자와 상호작용하는 단일 lactose repressor 또는 lac eye 분자의 검출을 가능하게 합니다. 이 대표적인 CH 도표에서, 하나의 lac eye 분자는 비특이적 DNA 서열을 따라 확산하는 반면, 다른 lac eye 분자는 DNA 분자의 중앙에 위치한 하나의 오퍼레이터에 특이적으로 결합되어 있습니다. 이 그래프는 두 트랩의 중심을 연결하는 방향을 따라 두 lac eye 분자의 위치를 보여줍니다.

시간의 함수로서, 분자들의 위치는 방사 대칭 중심 알고리즘(radial symmetry center algorithm)에 의해 결정되었습니다. 여기 표시된 그래프는 신장된 DNA 분자를 따라 확산하는 단일 lacI 분자의 시간 대비 평균 제곱 변위(mean square displacement, MSD)를 나타냅니다. 단백질의 확산 계수는 데이터의 선형 회귀 분석을 통해 쉽게 얻을 수 있습니다. 조작 및 이미징 기술의 결합은 DNA, RNA 또는 세포골격 필라멘트와 같은 단일 생체 고분자에 대한 기계적 제어와, 해당 고분자와 상호작용하는 단일 단백질 분자의 동시 국소화를 가능하게 하는 강력한 방법입니다.

본 실험 절차를 수행할 때, 단일 분자 조작 및 이미징 기술을 결합하려면 현수된 폴리머의 나노미터 수준 안정성을 보장하기 위해 실험 장치를 세심하게 설계해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 한편, 트래핑 G 레이저와 형광 프로브 사이의 공간적 분리를 보장하기 위해 생물학적 프로브의 적절한 설계가 필요합니다. 자세한 내용은 함께 제공되는 프로토콜 텍스트를 참조하십시오.

이 영상을 시청한 후, 귀하는 두 개의 광학적 급속 비트 사이에 DNA 분자를 조립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 구조체의 조립은 상세한 설명이 제공된 다채널 유체 셀을 사용하여 수행하는 것이 더 효과적입니다. 또한, 실험 결과에 영향을 줄 수 있는 기포를 제거하고 버퍼 흐름을 최적화하는 방법도 안내하였습니다.

결합 텍스트 프로토콜에서 streptavidin 코팅 비즈와의 조립에 필요한 bioTE를 이용한 DNA 라벨링 프로토콜과 단백질 라벨링 프로토콜을 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 신장된 DNA 분자 상에서 단일 lactose repressive protein의 결합 및 확산을 정량화하기 위한 단계별 조작 과정을 설명하였습니다.