단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

이 절차의 전반적인 목표는 단일 DNA 결합 단백질과 DNA 분자 사이의 동적 상호 작용을 관찰하는 것입니다. 이는 맞춤형 현미경, 두 가지 단일 분자 기술, 이중 광학 핀셋 및 형광 현미경 검사를 결합하여 달성됩니다. 이 설정에는 시료의 시각화 및 나노미터 안정화를 위한 명시야 조명도 장착되어 있습니다.

두 번째 단계로, 마이크로 유동 시스템에 통합된 다중 채널 플로우 셀은 최대 4개의 층류를 허용하여 실험에 필요한 모든 구성 요소를 효율적으로 모집하고 조립할 수 있도록 구축되었습니다. 다음으로, 실험을 수행하기 위해 단일 분자 구조체를 조립합니다. 처음 두 개의 스트립 타이틴 코팅 마이크로스피어는 첫 번째 채널의 이중 광학 핀셋으로 포착됩니다.

그런 다음 두 개의 갇힌 구슬을 두 번째 채널로 이동하여 양쪽 사지에 비오틴으로 표시된 DNA 템플릿을 부착할 수 있습니다. 단일 DNA 분자의 존재는 A DNA 힘 확장 분석에 의해 세 번째 채널에서 확인됩니다. 마지막으로, DNA 덤벨(DNA dumbbell)이라는 비드 DNA 비드 구조체는 형광 표지된 유당 억제 단백질이 있는 단백질 채널로 이동합니다.

단일 늘어난 DNA 분자에 대한 단일 LAC 눈 분자의 확산 및 특이적 결합과 LAC 눈 운동의 운동 매개변수의 정량화를 보여주는 결과가 얻어졌습니다. 기존 단일 분자 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 새로운 분자에 가해지는 장력을 제어할 수 있는 가능성, 나노미터의 안정적인 지점에서 결합 단백질의 움직임을 정확하게 추적할 수 있는 가능성, 덮개 수면 표면에서 멀리 떨어진 곳에서 작동할 수 있는 능력입니다. 이 방법은 단백질 DNA 상호 작용, 특히 유전자 발현 조절의 메커니즘과 표적 검색 메커니즘에서 DNA를 따라 단백질 확산의 역학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법에 대한 이러한 시연은 flow cell 시료 처리 및 beat DNA bead 구조체 조립의 실제 측면을 보여주는 데 매우 유용합니다. 이 비디오는 먼저 커버 슬립 표면에 부착된 마이크로 비드를 참조로 사용하여 두 트래핑 레이저의 포인팅 안정성을 확인하는 방법을 보여줍니다. 광학 핀셋 설정의 설계 및 구성에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 프로토콜 텍스트에서 확인할 수 있습니다.

24 x 60mm 커버 슬립을 사용하여 24 x 32mm 커버 슬립 표면에 2마이크로리터의 실리카 비드를 펴 바릅니다. 양면 테이프 2장을 사용. 24 x 32mm 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 부착하여 플로우 셀을 만듭니다.

플로우 셀에 50mmol의 인산염 완충액을 채우고 실리콘 그리스 이미지로 밀봉합니다. 약 2000배 배율의 명시야 현미경 검사에서 하나의 실리카 비드. 시야는 7 x 68 x 5 76 픽셀에서 획득된 약 7 x 5 마이크로미터여야 하며, 비드 이미지의 직경이 약 190 픽셀이고, 이미지 중심에서 XY 위치를 계산하고 회절 링에서 Z를 계산하고 드리프트를 보정하는 피드백 소프트웨어로 열 드리프트를 보상합니다.

나노미터 정확도로 pizo 스테이지를 이동하거나 왼쪽 트랩의 중심을 비드 중심과 더 잘 겹치게 하고 위치, 노이즈 및 사분면 검출기, 포토 다이오드 또는 QDP로부터의 표준 편차를 측정합니다. 오른쪽 트랩에 대해 측정을 반복합니다. 위치 잡음의 표준 편차는 플로우 셀을 만들기 위해 DNA 결합 단백질의 정확한 국소화를 허용하기 위해 몇 나노미터 이내여야 합니다.

다이아몬드 팁은 먼저 76 x 76 x 1mm 현미경에서 직경 1mm의 구멍을 뚫는 데 사용됩니다. 밀어서 4개의 입구와 1개의 출구를 만듭니다. 이렇게 하면 최대 4개의 병렬 버퍼 흐름이 허용됩니다.

각각은 실험 비드, DNA 형광 표지 단백질 및 이미징 버퍼에 필요한 다양한 구성 요소 중 하나를 포함합니다. 에탄올로 현미경 슬라이드를 청소하고 O-링이 삽입된 상태로 포트를 중앙에 놓고 접착 링을 액세스 구멍을 둘러싼 슬라이드에 놓습니다. 접착 과정을 방해할 수 있는 지문을 피하기 위해 이 단계에서 장갑을 착용하는 것이 필수적입니다.

두 번째 슬라이드 클램프를 사용하여 나노 포트를 슬라이드에 고정하고 섭씨 180도로 예열된 오븐에 1시간 동안 넣어 완전히 부착할 수 있습니다. 그 동안, 플로우 셀(flow cell)의 윤곽선 패턴을 종이 한 장에 그립니다. 채널의 너비는 약 3mm여야 하며 현미경 슬라이드의 전체 위치와 일치해야 합니다.

두 개의 퍼플 조각 위에 그림을 놓고 메스로 그려진 윤곽을 따라 날카롭고 연속적으로 자릅니다. 형성된 돌기를 제거하고 깨끗한 지지를 보장하는 데 사용되는 아래쪽 퍼퓸 층을 버리십시오. 다음으로 부착된 나노 포트가 들어 있는 현미경 슬라이드를 금속 지지대에 거꾸로 놓습니다.

파라폼 챔버 윤곽을 구멍에 조심스럽게 정렬하고, 파라가 청소된 현미경 커버 슬립으로 챔버 커버의 입구와 출구를 돌출시키지 않도록 하고 챔버를 둘러싼 과도한 파라를 조심스럽게 제거합니다. 이전에 섭씨 120도로 가열된 두 개의 열 블록을 플로우 셀 위에 놓고 균일한 압력을 가합니다. 파라 필름을 약 25분 동안 녹입니다.

다음 단계는 압력 저장소와 버퍼 용기를 준비하는 것입니다. 압력 저장소는 플렉시 유리로 만들어졌으며 최대 6개의 버퍼 용기를 수용할 수 있습니다. 먼저 밸브 레버를 수직 위치에 놓고 버퍼 흐름을 켜거나 시계 방향 회전 위치에서 끄기 위해 버퍼 용기 출구에 차단 밸브를 연결합니다.

실험하는 동안 플로우 셀을 현미경 스테이지에 장착합니다. 그런 다음 폴리 에테르, 에테르 케톤 또는 피크 튜빙을 통해 차단 밸브를 연결하고 플랜지가 없는 회전을 흐름 챔버 입구에 연결합니다. 피크 튜빙은 약 150μm 킬로미터의 내경을 가지며, 약 3cm의 내경을 가진 플루오르화 에틸렌 프로필렌 튜빙이 플로우 셀의 나노 튜빙과 나노 포트 어셈블리 사이의 연결로 사용됩니다.

이는 플로우 셀의 파손 또는 유리에서 나노 포트 분리를 방지하기 위해 챔버 입구에서 버퍼 흐름을 줄이는 데 필수적입니다. 반면에 큰 내경의 튜브를 단독으로 사용하려면 많은 양의 생물학적 샘플이 필요합니다. 플로우 챔버 배출구를 대기압에서 열린 Falcon 튜브에 연결합니다.

이 튜브는 흐름 챔버에서 흘러나오는 버퍼의 처리 역할을 합니다. 이 절차를 시작하려면 각 버퍼 용기에 1ml의 버퍼 A를 추가하고 200mbar의 압력을 가하여 연결 튜브와 플로우 셀을 세척합니다. 압력 제어 시스템이 가능합니다.

마지막으로 압력 저장소 내부의 공기 압력을 조정합니다. 흐름의 부드러움을 방해할 수 있는 기포가 있는지 확인하십시오. 배출 튜브를 가볍게 두드리면 남아 있는 기포를 제거하고, 압력을 20mbar로 낮추고, 모든 채널과 튜브에 기포가 없는지 확인하고 버퍼가 모든 채널에서 유사한 속도로 흐르는지 확인하는 데 도움이 됩니다.

샘플을 300마이크로리터의 최종 부피로 준비합니다. 이 실험은 스트렙트 코팅된 폴리스티렌 비드, 유당 억제 인자 결합을 위한 특정 표적 염기서열 및 형광 표지된 유당 억제 단백질을 포함하는 양쪽 사지에서 비오틴화된 선형 DNA를 사용합니다. 각 샘플을 주사기 용기 중 하나에 다음 순서로 추가합니다: 첫 번째 채널의 DNA, 두 번째 채널의 DNA, 세 번째 채널의 이미징 버퍼, 네 번째 채널의 라벨링된 단백질

20mbar에서 흐름을 켜고 차단 밸브를 열어 샘플이 흐름 채널 내부에 도착하도록 합니다. 이것은 비드 채널에서 쉽게 감지할 수 있습니다. 명시야 조명에서 첫 번째 채널을 이미징하는 동안 두 개의 광학 핀셋을 켜고 각 트랩에 있는 폴리스티렌 비드를 잡습니다.

다른 구슬이 트랩에 떨어지지 않도록 두 번째 채널로 빠르게 이동합니다. DNA 채널로의 도착은 비드 흐름의 끝에서 쉽게 눈에 띕니다. 하나의 AO 광학 디플렉터 또는 OD 이동을 사용하여 하나의 트랩 비드를 다른 비드 근처에서 앞뒤로 움직여 두 개의 광학적으로 트랩된 비드 사이에 흐름 확장 DNA를 부착할 수 있습니다.

DNA 덤벨이 형성되면 정적 비드는 트랩에 의해 활발하게 앞뒤로 움직이는 비드의 움직임을 따라가기 시작합니다. 버퍼 채널로 빠르게 이동하여 버퍼 흐름을 끕니다. 힘 확장 곡선 분석을 수행하여 단일 DNA 분자의 존재를 확인합니다.

이것은 DNA 장력을 측정하면서 두 개의 구슬을 분리함으로써 달성됩니다. 단일 DNA 덤벨을 얻으면 흐름을 다시 켜고 덤벨을 단백질 채널로 이동합니다. 광시야 형광 현미경 검사로 전환하여 표지된 유당 억제 단백질과 DNA의 상호 작용을 모니터링하고 흐름을 끄고 획득을 시작합니다.

이 방법을 사용하면 늘어난 DNA 분자와 상호 작용하는 단일 유당 억제자 또는 lac eye 분자를 검출할 수 있습니다. 이 대표적인 CH agram에서 단일 lac eye 분자는 비특이적 DNA 염기서열을 따라 확산되는 반면, 다른 lac eye 분자는 DNA 분자의 중심에 위치한 하나의 operator에 특이적으로 결합됩니다. 이 플롯은 두 트랩의 중심을 연결하는 방향을 따라 두 lac eye 분자의 위치를 보여줍니다.

시간의 함수로서, 분자의 위치는 방사형 대칭 중심 알고리즘에 의해 결정되었으며, 여기에 표시된 것은 늘어난 DNA 분자를 따라 확산되는 단일 lac eye 분자에 대한 평균 제곱 변위 또는 MSD 대 시간의 플롯입니다. 단백질의 확산 계수는 데이터의 선형 회귀에서 쉽게 얻을 수 있습니다. 조작 및 이미징 기술의 조합은 D-N-A-R-N-A 또는 세포골격 필라멘트와 같은 단일 생물학적 고분자에 대한 기계적 제어와 고분자 자체와 상호 작용하는 단일 단백질 분자의 동시 국소화를 허용하는 강력한 방법입니다.

이 절차를 시도하는 동안 단일 분자 조작 및 이미징 기술을 결합하려면 부유 폴리머의 나노미터 수준 안정성을 보장하기 위해 실험 설정을 신중하게 설계해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 다른 한편으로는, 트래핑 G 레이저와 형광 프로브 사이의 특별한 분리를 보장하기 위해 생물학적 프로브의 적절한 설계가 필요합니다. 자세한 내용은 동봉된 프로토콜 텍스트를 참조하십시오.

이 비디오를 시청한 후에는 두 개의 광학 빠른 속도 사이에서 DNA 분자를 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자세한 설명을 제공한 다중 채널 플로우 셀을 사용하는 것이 더 좋습니다. 또한 버퍼 흐름을 최적화하고 실험을 손상시킬 수 있는 기포를 제거하는 방법도 표시했습니다.

결합 텍스트 프로토콜에서는 단백질을 라벨링하기 위한 프로토콜뿐만 아니라 streptavidin 코팅된 비트로 조립하는 데 필요한 bioTE로 DNA를 라벨링하는 프로토콜을 찾을 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 스트레치 DNA 분자에서 단일 유당 억제 단백질의 결합 및 확산을 정량화하기 위한 단계별 작업을 설명했습니다.