쥐의 뇌에 직접 약물 전달 이소성 점막 Engrafting 절차
July 16th, 2014
인간의 내시경 두개골 바닥 재건의 마우스 모델은 코 점막 이식을 사용하여 뇌와 코 사이의 반투과성 인터페이스를 만듭니다 개발되었다. 이 방법은 연구자가 체계적으로 관리, 그렇지 않으면 혈액 - 뇌 장벽에 의해 제외되는 고 분자량 치료제의 중추 신경계에 전달을 연구 할 수 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 화합물을 뇌로 전달하기 위한 종속영양 점막 이식 수술을 성공적으로 수행하는 것입니다. 이는 먼저 기증자 마우스에서 코 중격 이식편을 분리하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 중격의 점막을 이식 마우스의 두개골 결손에 이식
하는 것입니다.다음으로, 뇌는 원하는 기간 동안 이식편을 통해 투여됩니다. 마지막 단계는 형광, 현미경 검사 또는 면역조직화학을 사용하여 전달된 화합물이 뇌로 확산되는 것을 보여줌으로써 뇌 투여 절차의 결과를 분석하는 것입니다. 실질. 뉴롭 의약품의 활용은 혈액뇌장벽(blood-brain barrier)의 존재로 인해 매우 제한적입니다.
우리는 인간 내시경 비강 경 수술을 기반으로 한 기술을 개발했는데, 이 기술을 개발하여 점막을 혈액-뇌 장벽의 구멍에 그래프로 표시하여 뇌에 약물을 직접 전달하는 통로로 사용할 수 있습니다. 여기, 보스턴 대학의 Han's Lab에서 박사 후 과정을 밟고 있는 Richie Komen은 마우스 모델에서 이 기술을 시연할 예정입니다. 안락사된 쥐의 코 주변 피부를 제거하여 두개골을 노출시키는 것으로 이 절차를 시작합니다.
그런 다음 공압 드릴로 세 줄을 표시합니다. 두 개의 선은 코 부위의 측면에 있고 세 번째 선은 두 선을 수직으로 연결하는 눈과 일직선상에 있습니다. 다음으로, 복부로 드릴다운합니다.
비중격을 주변 조직과 분리하려면 비중격에 부착된 조직을 제거하십시오. 그런 다음 현미경 아래의 멸균 식염수에 보관하고 이식편을 세척하고 연결된 조직을 모두 제거합니다. 이상적인 상황은 연골 중격의 양쪽에 있는 점막을 손상시키지 않고 모든 결합 조직을 성공적으로 제거하는 것입니다.
신학적 프레임에 장착된 표준 무균 미러링 수술 절차를 사용하여 마우스를 마취한 후 눈에 연고를 도포하여 건조함을 방지합니다. 다음으로 두개골을 노출시키고 머리를 수평으로 만듭니다. 그런 다음 공압 드릴을 사용하여 두개골에 직경 1.25mm의 원형 구멍을 자릅니다.
아투를 목표로 할 때는 천공된 부위를 멸균 식염수로 적시고 면도날을 사용하여 두개골을 제거합니다. 그런 다음 30게이지 바늘 끝을 사용하여 경막을 수동으로 제거합니다. 그런 다음 점막을 뇌 표면 위에 놓고 상피 쪽이 상처에서 멀어지도록 각별히 주의합니다.
수술용 가위의 끝을 사용하여 연골에서 멤브레인을 잡고 두개골과 뇌 표면에 올려 개두술 부위의 모든 뼈 가장자리를 넉넉하게 겹칩니다. 다음으로, 멸균 된 니트릴 조각으로 이식편을 덮습니다. 이것은 치유 중에 이식편에 피부가 부착되는 것을 방지하는 역할을 합니다.
필요한 경우 여분의 멤브레인을 자르고 이식편과 접촉한 니트릴의 움직임을 피하십시오. 그런 다음 봉합사로 피부를 닫고 다음 단계로 진행하기 전에 3-7일 동안 마우스가 회복되도록 합니다. 적절한 수술 후 치료를 수행하고 정기적인 진통제를 투여하여 동물에게 투여하십시오.
마취된 마우스를 입위 프레임에 고정한 후 가위로 봉합사를 자르고 두개골 주변의 여분의 피부를 제거합니다. 니트릴 장벽을 제거하고 두개골 표면을 청소합니다. 멸균 식염수와 면봉을 사용하여 이식편이 보일 때까지 해당 부위를 청소합니다.
원하는 표면적보다 크게 자란 경우 면도기로 이식편을 절단해야 할 수도 있습니다. 다음으로, 가장자리가 두개골과 접촉하도록 이식편 위에 우물을 놓습니다. 그런 다음 웰과 두개골 사이의 접합부에 시아노아크릴레이트 접착제를 바릅니다.
웰에 멸균 식염수를 채우고 누출이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 두개골에 시멘트를 바르고 우물을 제자리에 고정합니다. 그런 다음 피펫으로 우물에서 식염수를 제거하십시오.
우물을 여러 번 세척하여 접착제가 누출되지 않았는지 확인하십시오. 그런 다음 50마이크로리터의 형광 덱스트란을 추가합니다. 시아노아크릴레이트 접착제로 상단에 고정된 원형 니트릴 조각을 사용하여 웰 상단을 덮고 접착제가 웰 내용물과 접촉하지 않도록 합니다.
원하는 시간이 지나면 동물을 안락사시키고 임플란트와 뇌를 제거합니다. 이식편을 제자리에 고정하도록 주의하십시오. 일단 제거되면, 번쩍이고, 뇌를 얼립니다 드라이 아이스 욕조에서 냉각된 이소부탄 용액에 뇌를 OCT 용액에 넣고 50마이크로미터로 자릅니다.
원하는 슬라이스를 현미경 슬라이드에 직접 놓습니다. 그런 다음 OCT 용액이 건조되는 즉시 형광 현미경을 사용하여 슬라이스를 이미지화합니다. 이것은 경점막 투여 후 쥐 뇌 절편의 형광 현미경 이미지입니다.
40킬로달톤 테트라에틸 루민 접합 덱스트란을 24시간 동안 사용하면 점막 이식편이 뇌 표면에서 볼 수 있습니다. 이 기술을 완전히 익히면 제대로 작동하려면 총 4시간의 수술 시간이 걸립니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뇌로 약물을 전달하기 위해 개두술 부위를 통해 비중격을 분리하고 점막을 이식할 수 있어야 합니다.
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개요
이 연구는 인간의 경두개저 재건을 위한 새로운 마우스 모델을 제시하고 있으며, 비강 점막 이식을 활용하여 뇌와 코 사이에 반투과성 경계를 만듭니다. 이러한 혁신적인 접근 방식은 중추 신경계로의 고분자량 치료제 전달에 대한 연구를 용이하게 하며, 혈액-뇌 장벽에 의해 제한되는 한계를 극복합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물의학 공학
- 치료제 전달
배경
- 혈액-뇌 장벽은 많은 치료 화합물이 뇌에 들어가는 것을 제한합니다.
- 중추 신경계로의 약물 전달을 위한 현재의 방법은 제한적입니다.
- 이종 점막 이식은 약물 전달을 강화하기 위한 잠재적 해결책을 제시합니다.
- 이 연구는 비강 이식을 이용한 새로운 수술 접근법을 탐구하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 뇌로의 약물 전달을 연구하기 위한 마우스 모델을 개발합니다.
- 비강 점막 이식을 이용하여 전달 경계를 만듭니다.
- 뇌로의 화합물 확산을 분석합니다.
사용된 방법
- 기증자 마우스로부터 비중격 이식의 분리.
- 수용자 마우스의 두개골 결손부위에 점막 막을 이식합니다.
- 지정된 기간 동안 이식을 통해 뇌에 약물을 투여합니다.
- 형광, 현미경 또는 면역조직화학을 이용한 화합물 확산 분석.
주요 결과
- 두개골 결손부위에 비강 점막 이식의 성공적인 이식.
- 뇌 실질로의 화합물 확산을 입증했습니다.
- 형광 및 현미경 분석이 전달 방법의 효과를 확인했습니다.
- 치료 응용을 위한 혈액-뇌 장벽 극복에 대한 통찰력을 제공했습니다.
결론
- 개발된 모델은 뇌로의 약물 전달을 연구하기 위한 유망한 접근법을 제공합니다.
- 비강 점막 이식은 고분자량 치료제의 전달을 강화할 수 있습니다.
- 이 방법은 중추 신경계 질환 치료를 위한 새로운 치료 전략의 길을 열 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Overcoming the blood-brain barrier remains a critical challenge in CNS drug development, limiting the translation of high molecular weight therapeutics. This murine mucosal engraftment model provides a semipermeable interface for direct brain delivery, enabling preclinical evaluation of compounds otherwise excluded by BBB impermeability. The approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery by validating brain exposure of therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming brain parenchyma delivery of high molecular weight compounds.
- Operational Value: Provides a reproducible surgical model for assessing CNS exposure independent of BBB permeability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to compare compound diffusion across experimental conditions.
- Operational Value: Standardizes graft preparation and dosing procedures for scalable compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant testing of neuropsychiatric therapeutics by validating direct brain access.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation through consistent dosing and readout methods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling direct compound delivery to the brain, bypassing BBB-dependent absorption limitations.
- Discovery Biology: Supports target validation by confirming brain exposure of novel therapeutics.
- Screening: Enables assay-ready delivery of compounds for fluorescence-based quantification.
- Analytics: Provides microscopy and immunohistochemistry outputs for spatial and temporal diffusion analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical modeling of neurological disorders requiring CNS-penetrant therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical platform for iterative compound testing across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in CNS delivery by demonstrating direct graft-mediated compound transport.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized graft implantation and well-based dosing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering empirical brain exposure data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutics based on validated delivery efficiency.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise in graft isolation, craniotomy, and mucosal membrane handling.
- Depends on sterile surgical instrumentation, pneumatic drills, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between surgery, imaging, and pharmacology groups for consistent readouts.
- Involves adaptation considerations for graft size and well placement across mouse strains and ages.
- Limited by postoperative recovery time (3–7 days) before dosing can begin, affecting study timelines.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Harvesting of the Mucosal Graft
2:43
Surgical Implantation of Mucosal Graft
4:49
Administration of Dosing Solution
6:44
Analysis of Transmucosal Delivery
7:32
Results: Fluorescent Microscope Image of a Mouse Brain Slice Following Transmucosal Dosing
7:57
Conclusion
