Name: 밀폐 무부하 흐르는 콜로이드 중합체 혼합물의 공 촛점 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 배우세요 공촛점 현미경을 이용하여 밀폐된 콜로이드-폴리머 혼합물의 상 거동과 수송 특성을 정량화하는 방법을. 얇은 웨지 셀과 자동 이미지 분석으로 입자 역학을 분석하고, 흐름 거동에서 비뉴턴적 특성을 밝혀내어 재료 과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 책에서보고 된 연구는 휴스턴 대학의 새로운 능력을 부여, 초전도에 대한 텍사스 센터에서 시드 부여하고, 미국 화학 학회 석유 연구 기금 (52537-DNI)에 의해 지원되었다.

콜로이드 중합체 혼합물의 하나. 제조 주 :이 프로토콜은 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 입자, 입체적 폴리 (12 - 하이드 록시 산)를 사용하여 안정화 및 표준 다음 합성 하였다 (예 나일 레드, 로다 민 B, 또는 플루오 레세 인 등) 형광 염료로 표지를 사용 조리법 52. <ol><li> 주식 용매로 헥실 브로마이드 (CXB)과 데카 (DHN)의 3:1 W / W 혼합물을 준비합니다. 이 혼합물은 거의 입자의 굴절의 밀도 및 인덱스와 일치합니다. 부분적으로 입자에 전하를 화면에 1.5 mm의 농도로 용매에 유기 염, 테트라 부틸 암모늄 클로라이드 (TBAC) 46을 추가합니다. </li><li> DHN 용매 : 정확하게 입자의 밀도를 확인하려면 대략 입자의 부피 분율 Φ에서 서스펜션 = CXB 0.10를 준비합니다. 75 분 800 XG에 현탁액을 원심 분리기 및 부력을 향상시키기 위해 CXB 또는 DHN의 적하 추가일치. 이들 실험에서, PMMA 입자의 밀도 = 1.223 g / ㎖ ρ 될 측정 하였다. </li><li> DHN 혼합 용매 : CXB의 PMMA 입자의 집중 주식 서스펜션 (여기서, Φ = 0.40) 준비합니다. </li><li> DHN 혼합 용매 : CXB 선형 폴리스티렌 (PS)의 농축 된 용액을 준비합니다. 여기에, 3,000,000가 (선회 R G = 15 ㎚의 반경) 50 ㎎ / ㎖ ≈ 농도 C의 P에서 준비 ≈ W 분자량 M의 PS의 솔루션을 제공합니다. </li><li> 입자와 고분자의 원하는 농도로 현탁액을 공식화하는 입자, 폴리머, 용제 주식 혼합물의 가중치를 적절하게 혼합한다. 참고 : 여기에, 단 분산 입자의 현탁액은 일정 콜로이드 체적 분율 Φ에서 준비 = 무료 볼륨 53 C의 P 0.15 변수 중합체 농도 = 0 ~ 25 ㎎ / ㎖ 및 W, 콜로이드 입자의 두 가지 크기를 포함하는 현탁액을 bidispersed독특한 형광 라벨 담지 i 번째의 각 크기는 고정 된 전체 콜로이드 부피비 Φ로 제조된다 = 소립자 0.15, 체적 분율의 비율은 5 ~ 25 ㎎ / ㎖의 자유 부피 = 0.50 R 및 중합체 농도. </li><li> 각 현탁액을 제조 한 후, 현탁액 내의 입자 클러스터 부력 일치 남아 있는지 확인하기 위해 최소 75 분 800 XG에 CXB 또는 DHN 적하 원심 분리기 샘플을 추가합니다. </li><li> 이전의 영상 실험에 최소 24 시간 동안 모든 샘플을 평형. </li></ol> . 2 대기 샘플 실험 : 위상 동작 <ol><li> 벌크 상 거동을 결정하기 위해, 유리 커버 슬립 (그림 1a)에서 직사각형 챔버를 제작. 이 연구에서 콜로이드 고분자 혼합물의 경우, (현미경 슬라이드의 두께에 의해 설정) 두께 H = 1 ㎜의 챔버 대량 동작을 제공합니다. </li><li> 하나의 현미경 실험에서 여러 confinements에 액세스하려면, 얇은 쐐기 - 제작하나의 웨지에 스페이서로서 단일 커버 슬립을 사용하여 실 모양 (도 1B). 뷰의 단일 필드에서 벽은 매우 거의 평행이되도​​록 챔버의 개방 각도는 &lt;0.5 °이다. 대표적인 챔버&gt; 100 μm의 = 6 시간의 구속 두께에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 이미징을위한 커버 슬립베이스에 실을 구축하고 CXB-DHN 혼합 용매에 용해되지 않는 UV 경화형 에폭시로 밀봉. </li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 이미지 샘플. 이 프로토콜은 NA가 1.40 = 개구의 100X 기름 침지 렌즈가 장착 된 거꾸로 현미경에 부착 된 라인 스캐닝 공 촛점과 영상을 보여줍니다. </li><li> 레이저 소스를 사용하여 염료를 여기. 여기에서 λ = 491 또는 561 nm의 각각의 형광 및 로다 민 / 나일 레드 염료를 자극하는 데 사용되는 파장을. </li><li> 포인트 - 스캔 시스템에서 급속에서 (샘플에 걸쳐 초점을 스캐닝 x-의해 화상을 생성공 초점 소프트웨어를 사용하여 Y 평면). 512 픽셀의 2 차원 이미지가 1 / 32 초에서 획득 할 수있는 약 50 ㎛ × 50 ㎛의를 덮고 512 픽셀, 배. 여러 이미지들을 평균하거나 획득 시간을 증가시킴으로써 화질을 향상시킨다. </li><li> 챔버의 바닥을 찾습니다 (Z = 0), 그 아래에 부착 된 입자에 초점을 맞춤으로써, 예를 들어. 이 설정에서, 높이 (z)는 챔버 내로 포커스 증가와 함께 증가한다. </li><li> 예로서, 챔버의 미드 플레인에서 (XY 평면) 화상의 2-D의 시계열을 취득함으로써 입자의 역학에 구속 효과를 특성화. 전형적인 실험에서, 치수 500 이미지가 X 512 픽셀 512 픽셀이 1 프레임 / 초의 프레임 속도 (시간의 Δt = 1 초 간격)에 인수된다. </li><li> 두 번째 예로서, 화상의 입체 시리즈 (x, y, z)를 취득하여 입자의 3-D 구조를 특성화. 전형적인 실험에서, 이차원 이미지 (512 화소 × 512 화소)이다ΔZ의 일정한 간격 = 압전 설정 연속 된 이미지 사이에 0.2 μm의와, 챔버 내에서 여러 Z 위치에 인수했다. H의 두께를 포함하는 볼륨 스택 = 30 μm의, 따라서 151 이미지가 포함되어 있습니다. </li><li> 찾기 및 2-D 또는 3-D에서 시간이 지남에 따라 추적 입자 IDL 23,54-56, MATLAB 57, 58, LabVIEW는 59, 파이썬 (60)로 작성 입자 추적 소프트웨어를 사용하여. 이러한 알고리즘은 일반적으로 입자의 중심이 40 ~ 50 나노 미터 내에 해결 될 수있다. 성공적인 입자 추적 입자가 연속 된 프레임 사이의 입자 간 간격보다 이동하는 것이 필요합니다. </li><li> 입자의 위치에서, 구조 및 동적 통계를 계산합니다. 여기에 도시 된 세 가지 편리한 메트릭 (3-D 쌍 상관 함수 g (R) (61), 2-D, 평균 제곱 변위 (MSD) 58,62, 및 반 호브 상관 함수 G (S)의 2-D자가 일부인 x, t) 58. 후자의 두 메트릭은 또한 3-D로 계산 될 수있다. </li></ol> . 3 흐르는 실험 : 유동 특성 <ol><li> 테프론 튜브에 부착되어 사각형 단면 (100 μM × 100 μM)와 유리 마이크로 모세관을 사용하여 간단한 플로우 셀을 제조. 도 7에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 모세관을 지원 및 기계적 강성을 제공하기 위해 유리 커버 슬립을 사용한다. </li><li> 유리 주사기에 콜로이드 폴리머의 혼합물을로드합니다. 주사기 펌프 또는 공기 유체 분배 시스템에 주사기를 연결합니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 흐름 전지 설치를 탑재합니다. 유량 프로파일에 중력의 영향을 최소화하기 위해 동일한 높이로 셀 및 유출 흐름 주사기 유지. </li><li> (시린지 펌프) 체적 유량 또는 (압력 상자)인가 압력에 의해 유동 셀을 통해 현탁액의 유량을 제어한다. 마이크로 채널에있는 현탁액의 평균 속도는 SU에 의존spension 제제. 여기에서 측정 된 사각형 마이크​​로의 최대 속도의 일반적인 값은 200-2,000 μm의 / 초이다. </li><li> 흐름 동안, 빠른 프레임 속도에서 2-D 촛점 시계열을 획득. 여기서 차원의 500 이미지가 X 512 픽셀 512 픽셀 Z에서 = 5에 이르기까지 마이크로의 바닥 (Z = 0 μm의) 위의 서로 다른 높이에 (시간 간격 Δ의 T = 1 / 32 초) 32 프레임 / 초에 취득 - 50 ㎛. 7 그림 삽입과 같이 각각의 이미지는, 마이크로의 측면 치수 (Y)의 약 절반을 커버한다. 입자가 타원 나타날 경우 인수의 프레임 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 대기 실험에서와 같이, IDL 또는 MATLAB에서 입자의 위치 및 추적에 대한 표준 알고리즘을 사용하여 2-D의 입자를 찾습니다. 입자는, 프레임 사이의 평균 입자 간 거리보다 적게 이동 궤적을 구하는 추적 알고리즘을 사용하는 느린 흐름하십시오. </li><li> CALC 이미지의 상관 관계를 사용하여ulate 빠른 흐름의 속도 프로파일. <ol><li> 흐름의 방향을 따라 일정한 높이 (Y)의 수평 이미지로 이미지를 세분 (X). 두 순차 이미지 I 1 (X, Y) 및 I 2 (X, Y)에 대한 계수 ΔX에 의해 후자의 이미지를 이동하고 나서 1 (X, Y) 사이의 교차 공분산을 계산하고 I 2 (X + ΔX, Y). </li><li> 각각의 횡 방향 위치 (y)에서의 평균 이류 속도를 얻기 위해 이미지의 각 쌍 사이의 크로스 공분산을 최대화 ΔX 값들의 히스토그램의 피크 위치를 식별한다. 이러한 분포가 강하게 뾰족하지 않은 경우 빠른 프레임 레이트로 영상을 획득. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

마이크론 크기의 콜로이드 입자는 원자와 분자보다 훨씬 느린 역학을 전시하기 때문에 쉽게 몇 군데 시간 10 이상 추적 할 수 있기 때문에 콜로이드 현탁액은 널리 국한 상 거동에 대한 모델로 연구한다. 이러한 기초 연구의 경우, 밀폐 된 단계 행동에 입자 간 관광 명소의 효과를 이해하는 것은 모세관 응축 및 증발 21,22,67 등의 현상을 탐구 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 밀폐 된 매력적인 현탁액은 산업 및 기술 응용 프로그램에서 보편적으로 나타납니다. 이러한 적용 연구의 경우, 제한된 흐름에 현탁 제제의 효과를 이해하는 것은 신속한 프로토 타입 1-3, 약물 전달 4, 강화 된 오일 복구 5-7, 에너지 스토리지 애플리케이션 8 원료 및 잉크의 개선 된 제제로 이어질 수 있습니다. 마이크론 크기 콜의 구조를 조사하는 데 사용되는 다른 기술얇은 형상의...

이 논문은 대기 흐르는 국한 콜로이드 고분자 두의 혼합물 및 세 가지 차원와 (b) 입자 추적 및 상관 관계 상 거동 및 유동 특성에 대한 정량적 인 정보를 얻기 위해 생성 된 이미지의 분석 () 공 초점 영상을 보여줍니다. 매력적인 입자 간 상호 작용 콜로이드 현탁액은 직접 조립 1-3, 약물 전달 4, 개선 된 탄화수소 복구 5-7, 에너지 저장 8 재료로 기술 응용 프로그램에서 보편적으로 나타납니다. 이러한 응용 프로그램의 일반적인 특징은 입자는 노즐, 프린트 헤드, 마이크로, 또는 다공질 미세한 형상을 통해 유입되어야하며, 및 / 또는 얇은 필름 또는 봉으로 형성 될 것입니다. 전자 현미경 (17, 18), x-레이 현미경 (19), 및 레이저 회절 m 등 좁은 형상, 미크론 크기의 콜로이드의 구조를 조사하는 데 사용되는 기술20 icroscopy, 마이크로 스케일의 입자의 구조와 역학을 측정하는데 사용될 수있다. 이러한 기술은, 그러나, 구조 및 동적 메트릭 수치 시뮬레이션 21,22 직항 비교를 위해 계산 될 수있는 개별 입자의 궤적에 대한 액세스를 허용하지 않는다. 공 초점 현미경 형광 샘플의 얇은 부분의 영상을 가능하게 형광 현미경의 변종이다. 콜로이드 과학 (10)의 경우,이 기술은 깊은 밀도 현탁액 내에서 또는 세 가지 차원으로 이미징에 특히 유용합니다. 입자 추적 알고리즘 (23)는 보이는 모든 입자의 궤적을 수득 둘 또는 공 초점 현미경의 입체 시계열에 적용. 결과적으로, 공 초점 현미경 및 입자 추적의 조합 순서 결정 24-27 및 장애를 포함하여, 상 거동, 구조 및 콜로이드 현탁액의 동역학을 연구하기 위해 적용된ED는 28 ~ 31, 젤 32-35 안경. 기타 이미지 분석 알고리즘은 공 초점 현미경의 시계열로부터 입자 동역학을 측정하기 위해 적용될 수있다. 예를 들어, 확산 입자 역학 공 초점 차 동적 현미경 (36)를 사용하여 시간이 지남에 따라 강도의 변동을 분석하여 공부하실 수 있습니다. 입자 변위는 입자 간 간격보다 큰 경우, 입자 화상 유속계 38-40에 근거 화상 상관 관계 (37)는 입자의 속도 프로파일을 측정하기 위해 적용될 수있다. 추적 및 상관 관계 알고리즘의 조합은 콜로이드 역학 느리고 빠른 흐름 11-16,41-45을받은 시스템에서 측정 할 수있다. 우리는 매력적인 콜로이드 현탁액 9 모델로 콜로이드 폴리머의 혼합물을 사용합니다. 이러한 혼합물에서, 매력적인 입자 간 전위의 범위 및 강도 비율을 통해 제어된다입자 반경 및 중합체 및 정전 반발력 농도 관성 중합체 반경 가의 유기 염 (46)의 첨가를 통해 제어된다. 입자 간 상호 작용이 깊게 튜닝 될 수 있으므로, 이들의 혼합물의 고화는 광범위 34,47-51 공 촛점 현미경으로 연구되었다. 여기서 우리는 콜로이드 체적 분율이 Φ 고정 개최되는, 대기 흐르는 콜로이드 고분자 혼합물의 공 촛점 이미징 및 이미지 분석 (37)를 보여 = 0.15, 그 프로브 상 거동 및 이들의 혼합물의 유동 특성에 대한 제한의 효과. 이러한 기술은 굴절되어 입자상 시스템에 광범위하게 적용될 수있다 지수 일치하고있는 입자 및 / 또는 용매를 형광 염료로 표지 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Cyclohexyl bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>CAS 번호&nbsp; 108-85-0, 분자량 = 163.06, 재고 용제</td></tr><tr><td>사용 Decahydronapthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>CAS 번호 91-17-8, 분자량 = 138.25, 재고 용제</td></tr><tr><td>사용 Nile Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>형광 염료</td></tr><tr><td>Fluorescein 5(6)-isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>형광 염료</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>형광 염료</td></tr><tr><td>동적 광 산란&nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-APD</td><td>DLS 장비는 입자 크기 측정에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 폴리스티렌;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>고갈 인력 유도용 폴리스티렌(폴리머)</td></tr><tr><td>테트라부틸(염화암모늄)(TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>1가 염</td></tr><tr><td>UV 접착제</td><td>Norland 접착제 NOA</td><td>68T</td><td>부품 번호 68T01(UV 경화 접착제)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Eye</td><td>컨포칼 스캐너</td></tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT 인피니티</td><td>컨포칼 스캐너</td></tr><tr><td>현미경&nbsp;</td><td>Leica</td><td>DMI3000B</td><td>도립 현미경</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5,000 rpm</td></tr><tr><td>테플론 튜빙</td><td>소형 부품</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite 벽 튜빙 26 AWG 0.016" ID x 0.003" 벽</td></tr><tr><td>에폭시</td><td>Devcon</td><td>DA051</td><td>5 min 에폭시</td></tr><tr><td>주사기</td><td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>유리 주사기(금속 루어 포함) 잠금 팁</td></tr><tr><td>주사기 팁&nbsp;</td><td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA 정밀 팁&nbsp;</td></tr><tr><td>주사기 펌프&nbsp;</td><td>뉴 에라 펌프 시스템 Inc.</td><td>NE1002X</td><td>프로그래밍 가능한 미세유체 펌프(syringepump.com)</td></tr><tr><td>계량 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0.0001-220g</td></tr><tr><td>PMMA 입자</td><td>합성</td><td></td><td>폴리(메틸메타크릴레이트) 콜로이드 입자</td></tr></tbody></table>

밀폐 무부하 흐르는 콜로이드 중합체 혼합물의 공 촛점 이미징

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

매력적인 입자 간 상호 작용이 제한 콜로이드 현탁액의 동작은 직접 조립 1-3, 약물 전달 4 재료의 합리적인 디자인, 개선 된 탄화수소 복구 5-7, 에너지 저장 8 유동성 전극에 중요합니다. 형광 콜로이드 및 비 흡착 중합체를 함유하는 현탁액은 범위와 입자 간 장르의 강도, 각각 중합체 컨트롤의 입자 반경 농도 관성 중합체 반경의 비로서, 모델 시스템을 호소하고있다. 중합체 특성 및 콜로이드의 체적 분율을 튜닝함으로써, 콜로이드 유체가 클러스터의 유체, 겔, 결정 및 유리 구를 얻을 수있다. 공 초점 현미경, 형광 ​​현미경의 변형은, 광학적으로 투명한 형광 샘플이 묘화 될 수있게 높은 공간 및 세 가지 차원의 시간 해상도를 가진. 이 기술, 작은 핀홀이나에서 현미경 광학계의 초점 체적 벗어나는 시료의 영역에서 블록들 출사 형광 슬릿. 결과적으로, 초점 평면에서의 샘플 만 얇은 부분이 묘화된다. 이 기술은 특히 단일 입자의 규모 밀도 콜로이드 현탁액의 구조와 역학을 조사하는 데 적합합니다 : 입자는 가시 광선을 사용하여 해결 될 수있을만큼 큰 상업 공 초점 시스템 (10)의 전형적인 스캔 속도로 캡처 할 정도로 천천히 확산 . 스캔 속도 및 분석 알고리즘의 개선은 흐르는 현탁액 11-16,37의 양적 공 촛점 이미징을 사용할 수있다.이 논문에서, 우리는 좁은 상 거동 및 콜로이드 고분자 혼합물의 유동 특성을 조사하는 공 초점 현미경 실험을 보여줍니다. 우리는 먼저 콜을 준비밀도와 굴절율이다 OID 중합체 혼합물 일치. 다음으로, 우리는 얇은 쐐기 모양의 세포에 변화 감금에서 대기 밀도 콜로이드 고분자 혼합물 이미징을위한 표준 프로토콜을보고합니다. 마지막으로, 우리는 마이크로 유동 중에 콜로이드 중합체 혼합물을 이미징하는 프로토콜을 설명한다.

공 촛점 이미징 및 입자 추적을 설명하기 위해, 우리는 콜로이드 폴리머의 혼합물을 63 ~ 65의 상 거동에 대한 제한의 효과를 조사 하였다. 이 실험을 위해 콜로이드 직경 2 = 0.865 ㎛,. 콜로이드 부피 분율은 Φ = 0.15로 고정시키고 중합체 C (P)의 농도는 0 내지 23.6 ㎎ / ㎖로 변화시켰다. 대표 공 촛점 이미지는 그림 2 (63), 왼쪽 열에 표시됩니다. 추적 알고리즘을 사용하여 얻어진 입자의 위치에서, 우리는 한 쌍의 상관 함수 (그림 2, 가운데 열), 평균 제곱 변위 (그림 2, 오른쪽 열) 등의 대표적인 구조 및 동적 통계를 계산합니다. 이미지와 구조 및 동적 측정은 &lt;우리가 콜로이드 젤 사이에 (그림 2, 맨 윗줄), 클러스터의 유체 (그림 2, 중간 줄), 및 ...

공 초점 현미경은 매력적인 현탁액을위한 모델 시스템으로 공부하는 이미지 정지 흐르는 콜로이드 폴리머의 혼합물에 사용된다. 이미지 분석 알고리즘은 기하 구속에 의한 변화를 측정 콜로이드 입자의 구조 및 동적 메트릭을 계산하는 데 사용된다.

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

다음 실험의 전반적인 목적은 공초점 현미경을 사용하여 인력성 콜로이드 현탁액의 구속된 상 거동 및 수송 특성의 변화를 정량화하는 것입니다. 이는 인력성 콜로이드 현탁액을 모델링하기 위해 콜로이드-폴리머 혼합물을 제조함으로써 달성됩니다. 이 혼합물을 이미징하고 얇은 쐐기형 셀(wedge cell) 내에 구속시켜, 구속 상태가 이러한 혼합물의 구조 역학과 상 거동을 어떻게 변화시키는지 보여줍니다.다음으로 혼합물이 마이크로 채널을 통해 흐르는 동안 이미지를 촬영하여, 콜로이드 간의 인력 강도가 혼합물의 제한된 수송 특성에 미치는 영향을 결정합니다. 자동화된 이미지 분석 및 입자 추적 알고리즘을 통해 정적인 제한 환경이 고형화 및 이미지 상관관계로 이어지는 과정을 보여줄 수 있습니다. 또한, 인력의 강도가 증가함에 따라 비뉴턴 유체 흐름 특성이 점차적으로 나타나는 과정을 알고리즘으로 확인할 수 있습니다.이 기술 또는 전자 현미경 및 동적 광산란과 같은 다른 방법의 주요 장점은 단일 입자 궤적에 직접적으로 접근할 수 있어, 시뮬레이션과 직접 비교하기 위한 동적 및 구조적 지표를 계산할 수 있다는 점입니다. 이 표준 방법은 입자 간 상호작용이 있을 때 현탁액이 어떻게 자기 조립되는지, 또는 고체와 같은 현탁액이 가해진 힘이나 응력 하에서 어떻게 항복하는지와 같은 연성 응축 물질 물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 프로토콜을 위해 염료로 라벨링된 PMMA 입자를 준비하였으며, 표준 준비 과정에 대해서는 텍스트 프로토콜에 링크된 참고 자료를 확인하시기 바랍니다.브롬화 헥산(bromohexane)과 데카하이드로 나프탈렌(decahydronaphthalene)을 중량비 3:1로 혼합하십시오. 다음으로, 테트라부틸암모늄(tetrabutylammonium)과 유기염을 1.5 mM 농도가 되도록 첨가하십시오. 용매는 입자의 굴절률과 일치하며 전하를 부분적으로 차폐하여 입자의 밀도를 정확하게 결정합니다. 준비된 용매에 입자를 0.1 v/v 비율로 부유시킨 후, 해당 현탁액을 800 ×g에서 75분 동안 원심분리하십시오.원심분리 후 입자가 침전되지 않았는지 확인하십시오. 그다음, 입자의 침전을 방지하기 위해 염기 용매를 한 방울씩 첨가하여 용매의 밀도를 입자의 밀도와 맞추십시오. 이어서, 준비된 용매 혼합물에 PMMA 입자를 사용하여 40% 현탁액을 준비하십시오.또한, 고농도의 용매 혼합물 내에 선형 폴리스티렌을 준비합니다. 예를 들어, 폴리스티렌의 분자량과 회전 반경을 기준으로 계산하여 50 mg/mL 농도로 준비합니다. 농축된 PMMA 입자 현탁액과 폴리스티렌 용액을 사용하면, 폴리머가 포함된 원하는 입자 농도의 현탁액을 제조할 수 있습니다.여기서 현탁액은 15 부피 퍼센트의 PMMA 입자를 포함하며, 폴리머 농도는 서로 다른 크기와 표지(label)를 가진 두 종류의 PMMA 입자를 동일한 부피로 분산시켜 0에서 25 mg/mL 범위로 조절합니다. 분획물들을 폴리머 용액과 혼합할 수도 있습니다. 각 현탁액을 혼합한 후 원심 분리하고, 용매를 한 방울씩 첨가하여 용매 밀도를 입자 밀도와 밀접하게 맞춥니다.마지막으로, 이미지 촬영 전 밀봉된 샘플들을 텀블러(Tumblr)에 넣고 최소 24시간 동안 두어 모든 샘플을 평형 상태로 만듭니다. 우선 유리 커버 슬립으로 직사각형 챔버를 조립하는 것부터 시작합니다. 여기서 현미경 슬라이드의 두께는 1 mm이며, 이에 따라 챔버의 두께가 결정되어 칼라 폴리머 혼합물의 벌크 거동이 가능해집니다.다양한 높이의 챔버가 필요한 경우, 웨지 위에 커버 슬립 한 장을 띄워 얇은 쐐기 모양의 챔버를 제작하십시오. 챔버의 개방각은 0.5도 미만이며, 챔버 두께는 6 µm에서 1 mm까지 증가합니다. 이러한 구성은 가둠 두께를 연속적으로 변화시킬 수 있게 합니다. 도립 현미경에 배치할 수 있도록 챔버를 제작하고, 사용되는 현미경의 용매 혼합물에 내성이 있는 UV 경화성 에폭시로 밀봉하십시오.다음은 100x 오일 침수 렌즈가 장착된 도립 현미경에 연결된 라인 스캐닝 공초점 스캔 헤드입니다. 개구수(numerical aperture)가 1.4이므로, 염료를 여기시키는 데 적절한 파장을 사용하고 512픽셀 정사각형 해상도로 50µm 정사각형 이미지를 촬영하십시오. 노출 시간은 1/32초부터 시작하여 이미지 품질에 따라 조정하십시오.다음으로, 입자들이 부착될 챔버의 바닥 부분을 찾습니다. 그런 다음 초점을 챔버의 중간 지점으로 이동합니다. 이제 2D 분석을 위해 중간 평면에서 초당 1프레임의 속도로 약 500장의 이미지를 촬영합니다.그 후 3D 분석을 위해, 모든 부수적인 이미징 실험에서 30 µm 범위에 걸쳐 0.2 µm 간격으로 Z-stack 이미지를 촬영하십시오. 고대조도 이미지를 얻기 위해 이미징 조건을 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 입자 추적 소프트웨어 패키지를 사용하여 이미지를 분석하십시오.입자를 40 또는 50 nanometers 수준으로 분해할 수 있는 알고리즘이 준비되어 있어야 합니다. 입자 추적은 연속된 프레임 사이에서 입자의 이동 거리가 입자 간 간격보다 작을 때만 가능합니다. 입자 구조와 역학을 평가하려면 다음 지표를 사용하십시오.3D 쌍 상관 함수, 2D 또는 3D 평균 제곱 변위, 그리고 2D 또는 3D Van Hove 상관 함수의 자기 부분입니다. 본 실험을 위해 폭 100 microns의 정사각형 유리 모세관으로 간단한 유동 셀을 제작하십시오. Teflon 튜빙을 부착하고 구조적 지지를 위해 유리 커버슬립을 사용하십시오.다음으로, 분석하고자 하는 콜로이드 폴리머 혼합물을 유리 주사기에 채운 후 펌프와 같은 분주 시스템에 연결합니다. 이제 이전 섹션에서 사용한 것과 같이 해당 장치를 도립 현미경에 장착합니다. 주사기 유동 셀과 배출구는 최대한 수평을 유지해야 합니다.콜로이드 폴리머 혼합물에 따라 유속을 설정하십시오. 유동 중에 200에서 2000 µm/s의 농도가 사각 모세관을 통해 사용되었습니다. 이전 섹션에서 설명한 대로 채널 바닥으로부터 5에서 50 µm의 서로 다른 거리에서 2D 이미지를 수집하십시오.입자가 타원형으로 보인다면, 획득 프레임 속도를 높이십시오. 흐름을 분석하려면 트래킹 소프트웨어와 IDL 또는 MATLAB을 사용하십시오. 입자 트래킹에서 서브 픽셀 해상도를 얻으려면 트래킹 매개변수를 세밀하게 조정하여 특정 방향으로 편향되지 않은 OID를 산출해야 합니다.느린 유동의 경우, 프레임 간 입자의 이동 거리가 입자 간 거리보다 짧을 때, 더 빠른 유동에서 사용하는 추적 루틴을 통해 궤적을 얻을 수 있습니다. 속도를 계산하려면 이미지 상관법(image correlation)을 사용하십시오.각 이미지를 흐름 방향으로 수평 이미지들로 세분화합니다. 연속된 이미지에서, 두 번째 이미지를 첫 번째 이미지와 일치하도록 이동시키고, 이 이동 거리를 사용하여 이미지 쌍 또는 원본 이미지의 각 세분화 영역 간의 속도를 계산합니다. 계산된 모든 이동 값에 대한 히스토그램을 작성합니다.값이 뚜렷한 피크를 형성하지 않는 경우, 더 빠른 프레임 속도로 실험을 반복하십시오. 직경 0.865 microns의 PMMA 입자를 혼합 용매 mL당 23.6 milligrams의 폴리머가 포함된 용액에 부피 기준 15%로 현탁시켰습니다. 쌍 상관 함수(pair correlation) 및 평균 제곱 변위(mean square displacement)를 포함한 구조적 및 동적 지표를 사용하여 이미지를 평가합니다.현탁액을 변경하면 구속된 현탁액의 구조와 동역학이 변화할 수 있습니다. 예를 들어, 1.48 micron 및 0.73 micron 입자로 구성된 분산 현탁액을 조제하여 구속 두께를 감소시킴으로써 입자가 부피의 15%를 차지하도록 하였습니다. 두 종류의 입자를 모두 포함하는 고체와 같은 콜로이드 겔 상이 유도되었으며, 시스템의 구속 정도가 증가함에 따라 큰 입자의 평균 제곱 변위가 감소하였습니다.응고 흐름과 일관되게, 약한 인력과 강한 인력을 가진 입자들의 특성을 비교하였습니다. 폴리머 농도는 5 mg/mL에서 25 mg/mL까지 변화를 주었습니다. 현탁액에서 약한 인력을 가진 현탁액은 채널 전반에 걸쳐 위치에 따라 크게 변하는 밀도 프로파일을 보였습니다.10 µL/h의 유량에서, 강한 인력을 가진 현탁액의 밀도 프로파일은 동일 조건하의 채널 전체에서 거의 일정하게 유지되었습니다. 마찬가지로, 이러한 현탁액들의 속도 프로파일에서도 차이가 나타났습니다. 약한 인력을 가진 입자들의 속도는 뉴턴 유체 예측값에 가까웠던 반면, 강한 인력을 가진 입자들은 특히 Y가 0인 채널 벽면에 가까울수록 뉴턴 유체 예측값에서 약간 벗어나는 경향을 보였습니다.이 영상을 시청하고 나면, 본 절차에 따라 공초점 현미경을 사용하여 콜로이드 현탁액의 상 거동과 유동 특성을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 입자 위치로부터 클러스터 크기 및 프랙탈 차원과 같은 다른 지표들을 계산하여, 구속 조건이 응집된 클러스터의 형태를 어떻게 변화시키는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

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연구

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