높은 가위 균질화 및 시리얼 농도로 농축, 지질 기반 산소 마이크로 버블 에멀젼의 제조

본 절차의 전반적인 목적은 정맥 내 산소 전달을 위한 자가 조립 지질 기반 산소 마이크로버블(OMS)을 대량으로 제조하는 것입니다. 이는 고전단 균질기와 가스 밀폐 탱크를 사용하여 OMS를 제조하고 연속적으로 농축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 개조된 주사기를 사용하여 산소 부피 백분율이 70%인 LOM 에멀젼을 압출하는 것입니다.

다음으로, 에멀젼을 원심분리하여 농축함으로써 부피 백분율 90%의 산소 폼을 생성합니다. 마지막 단계는 부피 백분율 산소 함량을 계산하고 광산란 기술을 사용하여 입자 크기 분포를 평가함으로써 품질 관리를 수행하는 것입니다. 최종적으로, 고전단 균질화를 통해 부피당 90%의 산소를 함유한 2L의 OMS가 생성됩니다.

이 기술이 초음파 처리 및 아말감화와 같은 기존 제조 방법보다 갖는 주요 장점은, 균질화(homogenization)를 통해 치료용 산소 전달을 위한 대동물 실험에 필요한 부피인 리터 단위의 자기 조립 마이크로버블을 생성할 수 있다는 점입니다. 이 기술의 용도 중 하나는 고도의 저산소혈증 환자를 치료하는 것인데, 이는 산소 가스가 채워진 마이크로버블이 수초 내에 탈산소헤모글로빈으로 산소를 전달하며 혈액보다 3배 더 많은 산소 함량을 운반하기 때문입니다. 균질기 헤드의 깊이에 따라 이 방법의 시연 결과가 중요하게 나타납니다.

순수하게 산화된 환경의 유지와 수성 상 대비 농축된 LMS의 구별을 이해하는 것은 어려울 수 있습니다. 지질 기반 산소 마이크로버블 또는 OMS 제조 시스템은 단단한 믹서가 장착된 유지 및 농축 탱크(HCT), 인라인 고전단 균질기, HCT와 균질기 사이에서 유체를 이동시키는 롤러 펌프 및 열교환기로 구성됩니다.

시스템 설정을 시작하려면, 하단 포트 2개와 측면 포트 3개가 장착된 멸균된 4L 광구 유리 수집 용기를 단단(single stage) 믹서 아래에 배치하십시오. HCT 1번 포트인 하단 포트 중 하나에 농축 에멀젼 수집을 위해 팁에 3방향 스톱콕이 장착된 약 10인치 길이의 멸균된 3/8인치 내경 투명 튜브를 연결하십시오. 다음으로, 두 번째 하단 포트인 2번 포트에 약 36인치 길이의 멸균된 3/8인치 내경 튜브를 연결하십시오. 이 튜브를 롤러 펌프에 통과시키십시오.

고전단 균질기의 입구에는 두 개의 포트가 포함된 티(tee) 피스가 장착되어 있습니다. 롤러 펌프를 거쳐 포트 2번에서 나오는 튜브를 티 피스의 측면 포트에 연결합니다. 다른 포트는 저유량 산소 가스 유량계를 사용하여 산소 탱크에 연결합니다.

고전단 균질기의 배출구를 4°C로 유지되는 인라인 열교환기의 유입구에 연결하십시오. 열교환기의 배출구를 HCT의 회수 포트에 연결하여 폐쇄 루프 시스템을 구성하십시오. 유량계를 통해 산소 탱크를 HCT의 4번 포트에 연결하십시오.

마지막으로, 대기에 개방된 가스 조성 모니터를 HCT의 상단 포트에 연결합니다. 이 절차를 시작하려면 GMP one two DYS steer oil, SN glycerol three PHOSPHOCHOLINE 또는 DSPC 20g과 콜레스테롤 10g을 HCT 바닥에 넣습니다. HCT에 plasma light A 1L를 추가하고 1분 동안 수동으로 저어주어 가능한 한 많은 지질이 수성상으로 통합되도록 합니다.

단일 단계 믹서를 수성상으로 내려, 믹서 헤드 전체가 수성상에 잠기도록 합니다. 주변 공기가 헤드스페이스를 오염시키는 것을 방지하기 위해, 고무 씰이나 테이프를 사용하여 HCT 상단이 기밀 상태이며 개방된 측면 포트가 없음을 확인하십시오. 4번 포트에 연결된 가스원을 켜고 HCT 헤드스페이스의 산소 분율이 95% 이상이 될 때까지 기다립니다. 단일 단계 믹서를 사용하여 전구체 에멀젼을 5분 동안 혼합합니다. 5,000 RPM에서 결과 혼합물은 옅은 흰색으로 보여야 하며 가시적인 지질 덩어리가 포함되지 않아야 합니다.

혼합 후, 사용하지 않은 지질 수성 혼합물은 단일 사용 전까지 4°C에서 최대 30일 동안 보관할 수 있습니다. 롤러 펌프를 1.3 liters per minute 또는 LPM으로 작동시켜 전폐루프 시스템을 전구체 에멀젼으로 프라이밍하십시오. 시스템 프라이밍이 완료되면, 펌프를 1.3 LPM으로 계속 유지하여 LO 제조를 시작하십시오.

인라인 고전단 균질기를 7,500 RPM으로 켭니다. 그 직후, 균질기 입구 부분으로 0.5 LPM의 산소 흐름을 공급합니다. HCT 내의 단일 단계 믹서를 3,500 RPM으로 계속 가동합니다.

Oms는 인라인 균질기 내의 로터 블레이드와 에멀션 스크린의 접합면에서 형성됩니다. 처음 몇 분 이내에 유체의 점도가 눈에 띄게 증가해야 합니다. 시스템을 15분 동안 작동시킨 후, 고전단 균질기와 산소 유입구를 끕니다.

이렇게 하면 상 분리가 완화되어 HCT 내에서 생성물이 비교적 균일하게 유지됩니다. 연속 농축 단계 동안 가스가 충전된 에멀젼의 부피가 약 2~3배 증가해야 함에 유의하십시오. 제조된 OMS를 수집하기 위한 140 milliliter 루어 락 시린지는 이전에 100 milliliter의 공기를 시린지에 채운 후, 140 milliliter 표시선 위의 과도한 플런저와 시린지 부분을 잘라내어 수정하였습니다.

멸균 처리된 변형 주사기를 수집 용기의 1번 베이스 포트에 부착된 스톱콕에 연결합니다. 톱니 핀셋을 사용하여 플런저를 내려 100 mL의 액체를 흡입하고 주사기 캡을 단단히 닫습니다. 모든 액체가 제거될 때까지 이 과정을 반복합니다. 캡을 닫은 끝부분이 아래로 향하도록 하여 냉장 버킷 원심분리기를 사용하여 225 ×g에서 10분 동안 주사기를 원심분리합니다. 원심분리 후 세 개의 층이 나타나면, 가장 아래층의 과잉 불투명 수성층을 배출하여 폐기합니다.

두 번째 층은 밝은 흰색이며 농축된 oms를 포함하고 있습니다. 주변 가스 오염을 방지하기 위해 3방향 스톱콕을 사용하여 농축된 거품을 가스 불투과성 유리 시린지로 옮깁니다. 파열된 oms에서 나온 유리 산소 가스가 포함된 마지막 층은 폐기하십시오.

거품의 품질은 다음과 같이 가스 농도를 계산하여 평가할 수 있습니다. 고품질의 거품은 가스 농도가 90 volume percent 이상에 도달해야 하며, 두 번째 품질 관리 단계로 광산란법을 통해 마이크로버블의 크기를 측정하여 입자 크기가 예상 범위 내에 있는지 확인합니다. 균질화 시간이나 제형의 변경은 버블 크기를 변화시킬 수 있다는 점에 유의해야 하며, 농축된 oms가 담긴 유리 시린지는 단단히 캡으로 닫아야 합니다.

루어 락(lure lock) 피팅을 사용하면 시린지를 22°C, 4°C 또는 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 더 낮은 온도에서 보관할 경우 저장 안정성이 향상될 수 있습니다. 본 프로토콜을 사용하여 최대 2L의 농축 OMS를 90분 이내에 제조할 수 있습니다.

광학 현미경을 통해 10 µL의 OMS 샘플을 시각화한 결과, 구형의 OMS와 상대적으로 다량의 지질 잔해(lipid debris)가 관찰되었습니다. 동일한 OMS 샘플을 광산란법으로 분석했을 때, 평균 입자 직경은 2.624 ± 0.332 µm였습니다. OMS의 90% 이상이 직경 10 µm 미만이었으며, 해당 입자군은 다분산성(poly disperse)을 나타냈습니다.

에멀젼 점도는 가스 분율, 따라서 마이크로버블 농도에 크게 의존하였습니다. 가스 부피 백분율이 60, 70, 90%인 LOM 에멀젼 2 mL 분취액을 40 mm 평행판을 이용한 정상 상태 유동 소인법(steady state flow sweep)으로 분석하였습니다.

스트레스를 0.1에서 1000 past gass까지 변화시켰을 때의 기하학적 구조에서, 60 부피 퍼센트의 가스를 함유한 OMS는 인간의 혈액과 유사한 방사선 프로파일을 나타냈습니다. OMS의 산소 함량은 알려진 산소 결핍 상태의 탈포된 인간 혈액 분취물에 60 부피 퍼센트 OMS 내에 포함된 다양한 부피의 산소를 첨가하여 테스트하였습니다. OMS 내에 첨가된 산소의 부피와 혈액의 산소 함량의 부피적 증가 사이의 관계는 1.053 ± 0.03025였습니다.

테스트된 OMS가 거의 100%의 산소를 함유하고 있으며, 갇힌 가스 포켓이 거의 나타나지 않았고, in vitro에서 전체 산소 페이로드를 인간 혈액으로 효과적으로 전달한다는 점을 시사합니다. 이 기술을 숙달하여 적절하고 효율적으로 수행한다면, 90분 만에 2리터의 LMS를 제조할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 축적되는 OMS를 지속적으로 육안으로 점검하고 LOM 폼의 농도에 대해 품질 관리를 수행하는 것이 중요합니다. 이러한 제조 절차를 거친 OMS는 치료용 가스의 대규모 정맥 주사 및 전달에 사용될 수 있습니다.