고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

이 절차의 전반적인 목표는 박테리아의 세포 분열 중 단백질 FTSZ의 동적 변화를 관찰하는 것입니다. 이것은 FTS가 GFP 융합을 말한 간균 미묘한 세포를 작은 aros 패드의 표면에 적용함으로써 달성됩니다. 그런 다음 패드를 뒤집어 유리 덮개 슬립 바닥이 있는 페트리 접시로 옮깁니다.

두 번째 단계는 3D 구조 조명 현미경 또는 3D SIM 이미징 시스템을 사용하여 세포 분열 중 박테리아의 타임 랩스 이미지를 획득하는 것입니다. 다음으로, 원시 데이터의 품질을 평가하고 광표백으로 인해 강도가 30% 이상 감소한 이미지를 폐기합니다. 마지막 단계는 시간 경과에 따른 F-T-S-Z-G-F-P 단백질의 형광 강도 분포를 측정하여 세포 분열 중 단백질 국소화의 변화를 정량적으로 분석하는 것입니다.

궁극적으로 빠른 3D SIM은 박테리아의 세포 분열 중에 디온 단백질이 얼마나 역동적인지를 보여주는 데 사용됩니다. 컨포칼 현미경 검사와 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포의 세포 분열에서 발생하는 변화에 대한 3차원 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 방법은 박테리아 사이토키네시스에 대한 통찰력을 제공하지만, M 포유류 세포와 같은 동적 단백질 변화를 보고자 하는 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

우리는 고정된 박테리아 세포의 전통적인 3D 시뮬레이션 이미지에서 FDZ 단백질이 제드 고리 주위에 균일하게 분포되어 있지 않다는 것을 보았을 때 처음으로 이에 대한 아이디어를 떠올렸습니다. 우리는 이 분포가 제드 고리 수축 중에 발생한 변화와 관련이 있는지 추가로 조사하고 싶었습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 사용하는 개인은 오일의 굴절률을 샘플과 일치시키지 못하기 때문에 어려움을 겪을 것이며, 이로 인해 이미지 품질이 저하될 수 있습니다.

이미징을 위해 간균의 가장 미묘한 세포를 준비하려면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 중간 지수 단계까지 세포를 성장시킵니다. 다음으로, 먼저 얇은 폴리에스테르 시트를 제거하여 표준 유리 현미경 슬라이드에 접착 프레임을 부착합니다. 그런 다음 프레임의 노출된 접착 표면을 현미경 슬라이드의 표면에 적용하여 슬라이드 상단에 정사각형 우물을 효과적으로 만들고 프레임에 부착된 두꺼운 폴리에스터 시트를 남겨 두어 후속 단계에서 커버 슬립이 달라붙는 것을 방지합니다.

다음으로, 녹은 aros의 피펫 67 마이크로 리터가 접착 프레임에 끓을 때까지 전자 레인지에서 aro 용액을 녹입니다. 즉시 aros 위에 커버 슬립을 올려 평평한 표면을 만들고 5-10분 동안 실온에 두십시오. 샘플을 채취하는 동안 1-2분 동안 커버 슬립을 제거합니다.

8, 000 RPM에서 원심분리 후 시료의 1 밀리리터 분취액을 수확하고, 상등액을 200 마이크로 리터의 신선한 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. 농축된 샘플 2.5마이크로리터와 피펫을 미리 준비된 aros 패드에 넣습니다. aros 패드의 평평한 표면을 따라 샘플을 고르게 펴십시오.

그런 다음 aros 패드를 건드리지 않고 핀셋을 사용하여 현미경 슬라이드에서 접착 프레임을 제거합니다. 현미경에서 aros 패드를 옮깁니다. 유리 덮개 슬립 바닥이 있는 35mm 직경의 페트리 접시로 밀어 넣습니다.

고해상도 이미징용. 세포 현탁액이 페트리 접시의 커버 슬립과 접촉하도록 aros 패드를 뒤집습니다. 실험 당일에는 이미징 최소 1시간 전에 OMX 3D SIM 이미징 시스템을 켜서 시스템과 레이저가 완전히 안정화될 수 있도록 합니다.

그런 다음 마스터 컨트롤러 워크스테이션의 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 다른 구성 요소를 켭니다. 아이콘을 클릭하여 OMX 소프트웨어를 엽니다. 데이터 저장을 위한 파일 경로를 적절한 데이터 폴더로 설정합니다.

다음으로 소프트 워크 소프트웨어를 시작합니다. 실험에 필요한 레이저는 조명 매개변수 섹션의 메인 화면에서 켭니다. 채널 선택에서 FITC 카메라를 활성화하고 텍스트 프로토콜에 나열된 대로 매개변수를 확인합니다.

대물렌즈 상단에 기름 한 방울을 바르십시오. 준비된 세포가 들어있는 샘플 페트리 접시를 스테이지 삽입물에 넣고 원형 가열 뚜껑으로 덮습니다. 기름이 샘플 페트리 접시의 바닥에 닿을 때까지 s를 낮추십시오.

접시를 15분 동안 평형으로 가열합니다.tage에서 낮은 노출 설정을 사용하여 나노 포지셔닝을 사용하여 샘플에 집중합니다.tage 컨트롤. 샘플을 통해 위아래로 초점을 맞춰 빛이 샘플 초점면의 위와 아래에 고르게 퍼져 있는지 확인합니다. 그런 다음 0.5 미크론 단계 크기를 사용하고 이미지 스택의 상단과 하단을 표시한 후 실험 탭에서 샘플의 중앙으로 돌아가기 전에 두께 가져오기 버튼을 클릭하여 샘플 획득 두께를 설정합니다.

현재 노출과 투과된 빛의 백분율 설정을 사용하여 샘플 이미지의 최대 강도 값을 결정합니다. 이 값은 이미지 창 아래에 있습니다. 타임랩스 이미징의 경우 1100에서 1400의 최대 강도를 얻기 위해 투과되는 빛의 노출과 비율을 조정합니다.

위의 배경. 이미지의 경우 실험 탭에서 타임랩스 섹션을 활성화합니다. 필요한 프레임 속도와 데이터 파일의 총 시간을 설정합니다.

적절한 파일 이름을 입력합니다. 실행 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작할 때 이미지 획득을 시작합니다. 시계열의 첫 번째 프레임에 대한 이미지 획득의 시작 부분에 있는 이미지의 최대 농도 값을 주목하십시오.

첫 번째 프레임의 획득이 끝나면 이 첫 번째 프레임에 대해 Zack을 통한 신호 강도가 10% 이상 감소하지 않았는지 확인합니다. 시계열 수집이 끝나면 DV 접미사가 있는 결과 원시 이미지 파일을 열고 시계열 시작부터 최종 이미지까지 최대 신호 강도의 감소를 확인합니다. 프로세스 메뉴에서 30% 이상의 광표백이 발생한 시점을 버리고 SI 재구성 창을 활성화합니다.

모든 매개변수에 대해 기존 설정을 사용합니다. 사용된 채널별 OTF 버튼을 활성화하고 표준 필터 세트로 설정합니다. 사용된 채널별 KO 각도 버튼을 활성화하고 표준 필터 세트로 설정합니다.

원시 파일을 입력 파일 공간으로 끌어다 놓습니다. do it을 클릭합니다. Z 링 주위의 FTSZ 분포를 검사하여 3D 명암 플롯을 생성합니다.

그런 다음 3D 이미지 파일을 엽니다. 개별 z 슬라이스를 봅니다. 보기 메뉴 탭 아래에 있는 볼륨 뷰어 도구를 사용합니다.

관심 영역을 자르려면 이 3D 이미지의 창 번호를 입력 창에 입력하고 새 창 번호와 사용하지 않는 창 번호를 출력 창에 입력합니다. 영역 선택 버튼을 사용하여 원래 40 x 40 미크론 시야에서 관심 있는 개별 Z 링을 자를 수 있습니다. 회전 탭에서 원하는 축과 회전 각도를 조정합니다.

do it 버튼을 클릭합니다. 볼륨을 스크롤하여 원하는 관점인 Z 링을 얻습니다. 데이터 인스펙터 툴을 사용하여 열 행 차원을 조정하여 개별 Z 링 주위에 새로운 관심 영역을 만들 수 있습니다.

이미지의 중심을 클릭하여 이 새로운 관심 영역을 배치합니다. 텍스트 이미지 데이터는 관심 영역 내의 각 픽셀의 형광 강도를 표시하는 자동으로 생성된 테이블입니다. 3D 그래프 버튼을 클릭하여 처음에 강도 플롯을 봅니다.

또는 Save table data 버튼을 클릭하여 텍스트 이미지 데이터를 내보낼 수 있습니다. 파일 메뉴에서 저장된 텍스트 파일의 이미지 데이터를 새 스프레드시트에 복사합니다. 스프레드시트 내의 모든 셀을 선택하고 새 3D 표면 그래프를 만듭니다.

타임랩스 데이터를 게시하기 위해 3D 강도 플롯 그래프의 형식을 지정합니다. 3D 이미지 파일의 서로 다른 각 시점에 대해 이 단계를 반복합니다. 기존의 광시야 형광 현미경으로 시각화할 때 Z 고리는 미묘한 간균에서 형광의 단일 횡방향 띠로 나타납니다.

이 밴드 전체의 형광 강도는 균일합니다. 국소화 패턴은 여기 고리 내에서 FTS가 말한 폴리머의 구조적 조직과 분포에 대한 통찰력을 거의 제공하지 않으며, 동일한 세포가 검사됩니다. FAST 3D sim 방법을 사용합니다.

Z축을 중심으로 3D 시뮬레이션 이미지를 회전하면 Z 링을 3차원 공간에서 실제 링 구조로 시각화할 수 있습니다. 해상도가 향상되면 고리 내에서 FTSZ의 이질적인 분포를 시각화할 수 있습니다. 이 기법으로 시각화된 바실러스 Z 고리의 또 다른 예는 Z 고리 주변의 형광 강도가 어떻게 동일하지 않은지를 보여줍니다.

또한, 매우 낮은 형광 강도 또는 갭이 관찰됩니다. 이러한 관찰을 정량화하기 위해 Z 링에 대한 3D 강도 플롯이 생성되었습니다. 강도 플롯은 형광의 양이 간균의 가장 미묘한 Z 고리의 다른 영역에서 최대 4배까지 변할 수 있음을 보여줍니다.

3D 강도 플롯은 갭이 Z 링 내에서 발생하는 동적 변화를 분석하기 위해 배경 형광의 기준선 수준을 거의 읽는다는 것을 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 3D 시뮬레이션 타임랩스가 수행됩니다. 이 동영상은 간균의 미묘한 Z 고리 내의 FTSZ가 어떻게 지속적으로 변화하고 각 이미지에 대해 생성된 강도 플롯으로 측정되는지 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 박테리아 세포를 성장시키고 준비하는 방법, 3D Sim을 사용하여 박테리아 세포를 이미지화하는 방법, 정량적 데이터를 얻기 위해 박테리아를 분석하는 방법, 마지막으로 프레젠테이션 품질의 이미지를 제공하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미지 획득 중에는 세포의 건강을 모니터링하고 개발 후 획득 중 형광 단백질의 발현 수준을 모니터링하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술은 박테리아 세포 생물학 분야의 다른 사람들이 다른 초고해상도 현미경 방법을 사용하고 다른 유기체에서 다른 박테리아 단백질을 국소화할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차에 따라, 광 활성화 국소화 현미경 검사와 같은 다른 형태의 초 해상도 현미경 검사를 수행하여 FDS 단백질의 동적 변화를 살펴 볼 수 있습니다.