배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정

시냅스 전 억제는 척수에서 가장 강력한 억제 기전 중 하나입니다. 시냅스 전 억제의 병리적 변화는 여러 질환의 발병 기전에서 중요하게 작용합니다. 예를 들어, 신경병성 및 염증성 통증뿐만 아니라 비정상적인 중추성 통증 처리 과정이 이에 해당합니다.

이는 척수 손상 및 운동 과흥분성을 동반한 중추 신경계 질환에서 중요합니다. 따라서 이러한 질환의 동물 모델을 연구할 때, 시냅스 전 억제(presynaptic inhibition)의 강도를 파악하는 것은 유의미한 정보를 제공할 수 있습니다. 본 논문에서는 마우스 모델에서 시냅스 전 억제를 평가하는 방법을 제시합니다.

생체 내 시냅스 전 억제는 1차 구심성 뉴런의 탈분극에 의해 매개되며, 이는 감각 시냅스 전 섬유에 작용하는 GABA성 축삭-축삭 시냅스에 의해 유도됩니다. GABA_A 수용체 활성은 염화 이온 전도도의 증가를 가져오며, 이는 국소 이온 농도 분포로 인해 1차 구심성 탈분극을 유발합니다. 이러한 탈분극은 활동 전위가 축삭 말단으로 전파되는 것을 차단하고 그 강도를 감소시켜, 칼슘 유입의 감소와 신경전달물질 방출의 감소로 이어집니다.

따라서 단일 시냅스로 흥분되는 뉴런의 흥분성 postsynaptic potential은 postsynaptic membrane potential과 해당 뉴런의 흥분성을 변화시키지 않고도 억제될 수 있습니다. 이러한 1차 구심성 탈분극의 체적 전도 전위는 척수 내의 presynaptic inhibition을 직접적으로 측정할 수 있게 하며, 이러한 전위는 자극 후 척수 dorsal root에서 측정할 수 있는데, 이를 dorsal root potential이라고 합니다. dorsal root potential의 측정법은 잘 확립되어 있으며 고양이, 쥐, 개구리에서 널리 사용되어 왔으나, 생쥐의 경우 기록이 거의 대부분 ex vivo isolated spinal cord 표본에서만 수행되었습니다. 본 영상에서는 마취된 생쥐의 in vivo 상태에서 이러한 root potential을 기록하는 방법을 설명하며, 이를 통해 온전한 유기체 내에서의 presynaptic inhibition을 직접적으로 측정할 수 있습니다.

생체 내(in vivo) 마우스 DRP 기록을 위해서는 다음과 같은 장비가 필요합니다. 표준 설탕 도구, 자극 전극, 기록 전극 및 기준 전극의 위치를 각각 잡기 위한 수동 스테레오 현미경 3대가 필요합니다. 또한, 자극 및 기록만을 위한 마우스 프레임과 마우스의 체온을 조절하기 위한 가열 패드 또는 자극기가 필요합니다.

신호 대 잡음비를 높이기 위해 표준 증폭기와 데이터 수집 장치가 필요합니다. DRP 기록 중에는 맞춤 제작된 단면 전극이 필요하며, 이를 위해 전극 제작 과정이 필요합니다. 표준 피펫 풀러를 사용하여 일반적인 유리 튜브를 당겨 제작하십시오.

다이아몬드 줄을 사용하여 전극의 팁 끝부분을 깨뜨려 팁 개구부를 넓힙니다. 표준 실험용 토치로 팁을 연마하여 표면을 매끄럽게 만듭니다. 준비를 시작하기 전, 케타민을 IP 주사하여 동물을 마취시키고 정위 고정 장치 내에 마우스의 머리를 고정합니다.

그런 다음 마우스의 뒷발 발가락(PO)을 꼬집어 마취 깊이를 테스트합니다. 발가락의 회피 반응이 보이지 않을 때만 준비 과정을 시작하십시오. 마취 깊이는 실험 과정 중에 반복적으로 확인해야 합니다. 케타민을 뒷다리 대퇴사두근에 반복적으로 주사합니다.

마취 상태를 유지하며, 직장 프로브를 사용하여 동물의 체온을 모니터링합니다. 후주(dorsal column) 준비를 위해, 등 쪽 정중선을 따라 피부를 절개합니다.

피부를 하부 조직으로부터 느슨하게 하여 척추를 주변 결합 조직과 분리합니다. 척추 양측에 두 번의 절개를 가하고, 메스로 조직을 밀어내어 절개 부위를 넓힙니다. 그 후 작은 골 니플(bone nipple)을 사용하여 극돌기를 제거합니다.

요추 부위부터 시작합니다. 수술 부위의 건조를 방지하기 위해 흉추 중간 부위까지 진행하십시오. 상처 주변에 작은 거즈 조각들을 배치하고 0.9% sodium chloride로 적셔줍니다.

그런 다음 요추 부위부터 척수를 준비하기 시작합니다. 인접한 두 척추 사이의 공간으로 본 니플(bone nipple)의 팁을 조심스럽게 밀어 넣습니다. 이때 척수에 가해지는 압력을 가능한 한 줄일 수 있도록 각별히 주의하십시오.

인공 뇌척수액으로 척수의 흉수 부위를 습윤하게 유지하십시오. 이후의 모든 단계에서 이 작업을 반복적으로 수행하십시오. 30G 바늘을 사용하여 듀로미터(durometer)를 조심스럽게 개방하십시오.

그 다음, 척추에서 인접한 동측 신경근 두 개를 느슨하게 하여 분리합니다. 그런 다음 신경근을 가능한 한 원위부에서 절단합니다. 시술 과정 중에.

뿌리가 과도하게 당겨지지 않도록 주의하십시오. 이는 결과적으로 DRP의 성공적인 기록을 방해하게 됩니다. 기준 전극을 척수 가까이에 배치한 후, 섹션 전극 하나의 팁을 한쪽 등쪽 뿌리(dorsal root)의 근위단에 가깝게 이동시킵니다. 그런 다음, 흡입 전극의 팁 개구부 위에 등쪽 뿌리를 위치시킵니다.

그 후 전극에 연결된 시린지를 통해 짧게 음압을 가하여 등쪽뿌리를 전극 속으로 흡입합니다. 다음으로, 용액이 전극 내의 등쪽뿌리와 염화은선을 모두 감쌀 때까지 낮은 음압을 지속적으로 가하면서 전극을 A CSF로 채웁니다. 이어서 액체 브리지가 전극을 단락시키지 않도록 전극의 팁을 척수로부터 들어 올립니다.

두 번째 동측 인접 신경근에 대해 동일한 단계를 반복합니다. 두 전극이 모두 배치되면, 한쪽 경로를 자극하는 동안 다른 쪽에서 기록하여 DRP 기록을 시작하며, 자극 전압을 최대치 이상의 수준(supra maximal levels)으로 높입니다. 전형적인 배측 신경근 전위(dorsal root potentials) 기록은 왼쪽 패널에 표시된 것과 같습니다.

짧은 자극 아티팩트 이후에 짧은 양성 편향과 긴 음성 편향이 뒤따릅니다. 마지막 편향이 실제 배근 전위입니다. 이 진폭은 자극 기록 직전에 기록된 기선(baseline)을 기준으로 계산할 수 있습니다.

호흡 운동이나 EKG 아티팩트로 인한 한 쌍의 뿌리로부터 발생하는 여러 트레이스가 기록된 DRP를 방해할 수 있습니다. 기록이 성공적으로 완료된 후, 자극 부위와 기록 부위를 서로 바꾸어 두 번째 기록을 수행하는 것이 가능합니다. 제시된 기록 방법입니다.

생체 내(in vivo) 뿌리 전위 측정은 특히 유전자 변형 마우스와 결합하여 일차 구심성 신경, 항분극 및 온전한 동물의 상태를 평가할 수 있게 해줍니다. 이는 척수 억제의 기저 메커니즘을 조사하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 척수 통합은 운동 기능과 다중 모드 감각 인지에 있어 매우 중요합니다.

이 방법은 통증, 척수 손상, 말초 신경 손상 및 염증을 다루는 연구에 유용합니다. 생체 내(in vivo)에서 DRP를 기록하면 분석자가 척수 상위 활동과 패드(pad) 간의 상호작용을 분석할 수 있습니다. 이는 일반적으로 마우스의 DRP를 측정하는 데 사용되는 분리된 척수 표본에서는 불가능합니다.

원칙적으로, 기록 중에 척수로 약물을 투여하는 것이 가능합니다. 추가 피펫을 통한 국소 투여는 국소 약물 농도의 조절을 강화하고 빠르게 할 수 있습니다.