Name: 배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 생쥐 척수에서 GABAergic 시냅스 전 억제를 측정하는 배근 전위(DRP) 기록법. 이 방법은 통증 메커니즘 및 척수 손상 연구에 중요한 정보를 제공합니다.

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우리는 방법의 수립시 도움이 토론을위한 프레 Heckmann 감사합니다. 또한, 우리는 비디오를 제작 지원을위한 기술 지원 및 프랭크 슈베르트에 대한 클라우디아 서머 감사합니다. 01EO1002와 예나 대학 병원의 임상 연구를위한 학제​​ 간 센터 (IZKF) : 작품은 연방 교육 연구부 (BMBF), 독일, FKZ에 의해 지원되었다.

다음 프로토콜에 언급 된 모든 실험 절차는 튀 링겐 주 당국 (링거 Landesamt FÜR Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12)에 의해 승인되었다. 1. 실험을위한 준비 <ol><li> 흡입 전극의 제작 <ol><li> 예를 들어, 표준 패치 전극 마이크로 피펫 풀러와 표준 붕규산 유리 모세관을 사용하여 마이크로 피펫을 잡아 당깁니다. </li><li> 브레이크 다이아몬드 파일을 사용하여 (등쪽 뿌리의 직경보다 약간 큰) 0.5 mm의 직경을 팁을 전극. </li><li> 열 광택이 표준 실험실 토치 안으로 빨려 때 등의 루트를 해가되지 않도록 끝이 적당 할 것이다. </li><li> 부압이인가 될 수있는 주사기에 연결된 전극 홀더에 유리 필라멘트를 탑재. </li></ol></li><li> 솔루션의 제조 <ol><li> 마우스의 경우 주입 마취 : 825 ml의 케타민에게 10 %를 혼합, 0.24 ml의 자일 라진 2 %차 5 ㎖의 0.9 % 식염수. 용액 10 μL / g의 체중 (BW)는 (IP)을 복강 내 주사한다. </li><li> 인공 뇌척수 (ACSF) :;의 KCl 3, KH 2 PO 4 1.25, 망초 • H 2 O 2, 탄산 수소 나트륨 (25), 염화칼슘 2, D-NaCl을 134 : 두 번 증류수 (mm 단위) 다음과 같은 염을 희석 10 포도당. 0.003 %의 최종 농도로 H 2 O 2를 추가. 항상 신선하게 준비된 솔루션을 사용합니다. </li></ol></li><li> 녹화 설정의 준비 (그림 2) <ol><li> 데이터를 디지털화하기위한 PC 인터페이스에 앰프를 연결합니다. </li><li> PC 하드 드라이브의 사각 펄스 자극 및 데이터 수집을 트리거하는 PC 기반 프로그램 또는 아날로그 타이머를 사용합니다. </li><li> 자극과 녹음으로 표준 유리 전극 홀더에 연결 염화물로 silverwires를 사용합니다. </li><li> stere 주위에 각각 자극, 기록 및 기준 전극에 대한 세 가지 조종 조립마우스에 대한 otactic 프레임, 모든 전극이 나중에 준비 척수에 액세스 할 수 있도록. </li><li> 부정적인 압력을 적용하는 사과로 전극 홀더에 호스와 주사기를 연결합니다. </li></ol></li></ol> 2. 동물 실험 및 녹음 과정에 대한 동물 준비에 대한 일반적인 설명 <ol><li> 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 마우스를 사용하는 모든 실험을 수행합니다. 동물의 고통을 최소화 할 것을 보장 깊은 마취하에 모든 수술과 녹음을 수행합니다. </li><li> (; 상기와 같이 제조 된 용액 10 μL / g의 BW 각각 125mg과 케타민과 자일 라진의 G의 BW 당 8mg의) 케타민 / 자일 라진의 IP 주입하여 동물을 마취. 장기 녹화 중에 필요한 경우 추가 주사는 IP 또는 IM을 할 수있다 주 : 0.05 ~ 0.1의 반복 임 주사를 허벅지 위쪽에있는 케타민 / 자일 라진 용액 ㎖를 적합한 것으로 입증최대 3 시간 동안 깊은 마취에서 동물을 유지합니다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li><li> 정위 프레임에서 동물의 머리를 고정하고 실험 기간 동안 동물의 체온을 조절하는 직장​​ 프로브 및 휘어진 루프 가열 패드를 사용한다. 고정대에있는 척수의 고정이 필요하지 않습니다. </li><li> 준비를 시작하기 전에, 마우스의 발가락 사이 eyeblink 반사 및 경련에 의해 마취의 깊이를 확인합니다. 반사 신경은 폐지되어야한다. </li><li> 메스를 사용하여 클리어 연산 필드를 얻을 요추 영역을 낮추는 상부 흉추 레벨로부터 척수 상기 정중선을 따라 피부를 연다. 피부 절개를 만들기 위해 가위를 사용하지 마십시오. 조심스럽게 하부 조직으로부터 피부를 느슨하게. 다음 단계는 0.9 % 식염수에 적신 상처를 계속하는 동안. </li><li> 메스와 가위를 사용하여 힘줄과 가슴 수준으로 요추에서 척추의 양쪽에 결합 조직을 잘라. </리&gt; <li> 작은 니퍼를 사용하여 척추 주위의 극돌기 및 결합 조직의 나머지 부분을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 니퍼 해부 현미경 요추 수준 (L4/L5)에서 시작하는 척추 균열. 척추와 척추 사이의 공간에 니퍼의 끝을 밀어과 떨어져 뼈 조각을 들어 올립니다. 경질을 해와 척수에 압력을 피하지 마십시오. 모두의 성공을 위해 중요하다. 전체 절차를 수행하는 동안 적신 척수를 유지합니다. 중반 흉부 수준으로 진행합니다. </li></ol> 3. 지느러미 뿌리와 DRP 기록의 분리 (그림 2) <ol><li> 조심스럽게 구부러진 끝으로가는 바늘 (30 G)를 사용하여 경막을 엽니 다. 지금부터 습에 ACSF를 사용합니다. </li><li> 게이지를 사용하여 가능한 한 등의 뿌리를 분리하고 가능한 한 말단으로 인접한 두 뿌리를 잘라. 격렬한 분리하는 동안 뿌리에 당기는 실험의 성공에 영향을 미친다. </li><li> 할 수있는 흡입 전극을 아래로 내립니다뿌리를 rsal. 액체 등의 뿌리에서 빨아 수 있기 때문에 가능한 한 척추에 많은 ACSF를 추가합니다. </li><li> 주사기를 통해 부정적인 압력을 적용하여 하나의 유리 피펫에 하나의 지느러미 루트의 단면을 빨아. 필요한 경우, 미세 바늘을 사용하여 전극의 구멍 앞에 지느러미 루트를 이동합니다. </li><li> 지느러미 루트 흡입 전극에서 건조에있는 경우 피펫 충분히 ACSF 가득 될 때까지주의 깊게 빨고있는 동안, 그 팁을 몇 가지 ACSF를 추가합니다. </li><li> 등의 루트를 흡입 한 후, 척수에서 전극의 끝 부분을 올립니다. 주의하는 피펫 팁 및 척수 단락의 기록 / 자극 전극 사이에 &quot;물 다리&quot;.에게 </li><li> 반복 동측 인접 루트에 대한 3.3-3.6 단계를 반복합니다. </li><li> 등의 뿌리에 최대한 가깝게 기준 전극을 배치하고 ACSF을 적용하여 촉촉하게 유지합니다. </li><li> 녹화 설정을 구축함으로써, 하나의 루트가 이미 자극을위한 선택,기록에 대한 다른. 두 번째 지느러미 루트에서 기록이 현재 클램프 모드에서 수행하는 동안 전압을 단계적으로 증가한다. 하나는 DRP를 나타내는 천천히, 오래 지속 상향 편향에 의해 다음에 짧은 하향 편향을 알 수 있습니다. </li><li> (- 0.1 Hz에서 30 스윕 / 후근, 0.3 Hz에서 3 kHz에서 필터를 적어도 20) 수준을 supramaximal 여러 스윕을 기록하는 자극의 전압을 조정합니다. </li><li> DRP의 시간에 따른 합산에 대한 정보를 얻기 위해 세 가지 자극 (100 Hz에서)의 짧은 기차를 기록합니다. </li><li> 추가 반대측 기록에 대한 기록 및 자극 사이트를 전환합니다. </li><li> 동물 절차를 생존하는 것은 아니다. 반면 여전히 깊은 마취 (케타민 / 자일 라진은, 위 참조 2.2 단계) 잘린 마지막 촬영 후 동물을 희생. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 분석 프로그램에 데이터를 전송 (예 : 시그마 플롯, 이고르 프로, 또는 MATLAB). </li><li> 평균 추적의 FR을 계산톰 20-30 스윕. </li><li> 추가 분석을 위해 (그림 3), (DRP 피크 진폭 기준에서) 전압 편향의 최대 진폭을 가지고. </li><li> 후속 전위의 시간 종속 합산의 측정치를 얻기 위해 세 개의 펄스 및 단일 펄스 후에 DRP 피크 진폭의 비율을 계산한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

생체 내에서 신경 세포의 활동과 시냅스 전위의 추가 및 세포 내 전기 생리학 기록은 중추 신경계 신경 세포의 기능과 병태 생리를 조사하는 예술 기술의 상태입니다. 척추 통합 운동 기능, 예를 들면 사지 운동과 복합 감각 인식에 중요합니다. 시냅스 억제 감각 입력에 적절한 대응을 보장이 계산 과정에서 하나의 중요한 메커니즘이다. 아이오와 구 심성 섬유에 GABA 성 시냅스가 PAD에 의한 운동 신경원의 흥분을 억제한다. 생체 내 후근 전위 기록은 직접 그대로 동물 내 PAD를 측정 할 수있는 가능성을 연다. 이 기술은 비정상적인 척추 억제 등의 통증, 척수 손상, 말초 신경 손상, 또는 염증으로 관련이있는 질병 상태에 관한 연구에 특히 관심의 대상이 될 수 있습니다. 유전자 변형 마우스 모델의 사용과 조합이 기술은 INVE 강력한 될 수 있습니다stigate 메커니즘은 척추 억제를 방해 기본. 여기 방법은 고립 된 척수 준비를 사용하여 마우스의 DRP 레코딩의 다른 형태의 몇 가지...

시냅스 억제는 척수에서 가장 강력한 억제 메커니즘 중 하나입니다. 그것은 시냅스 막 잠재력과 운동 신경원 1-3의 흥분을 변경하지 않고 monosynaptically 흥분 운동 신경원의 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSPS)을 억제한다. 감각 시냅스 섬유에 GABA 성 AXO - 축삭의 시냅스에 의해 유도 된 기본 심성 탈분극 (PAD)는 기본 메커니즘 4-7 (도 Figure1a 참조). 이 시냅스는 GABA A-와 B-GABA 수용체 (GABA R과 GABA B R)를 포함하고있다. GABA R 활동으로 인해 로컬 이온 분포에 PAD를 이끌어 클로라이드 컨덕턴스의 증가에 이르게한다. 이 탈분극 블록은 축삭 터미널에 활동 전위의 전파와는 감소 칼슘으로 이어지는 그들의 힘을 감소 + - 유입 및 송신기 방출의 감소. GABA B 수용체의 활성화는 않습니다 없음t는 PAD에 기여하지만, 이에 연접 억제를 강화하는 칼슘 2 + 유입의 감소로 연결됩니다. GABA R의 활성화는 단기간의 억제에 관여하는 것으로 보이지만, GABA B R은 장기 변조 8-10에 참여하고 있습니다. PAD와 연접 억제의 주요 부분을 차지하는 GABA에 더하여, 다른 송신기 시스템은 또한 변조 할 수 있으며이기구 (11, 12)에 기여한다. 시냅스 억제의 병리학 적 변화는, 결함이있는 GABA 성 전송 (17)에 의해 매개 모터 hyperexcitability와 주변 염증 및 신경 병증 성 통증 (13, 14)뿐만 아니라, 이상 중앙 통증 처리 (15), 척수 손상 16, 중추 신경계 질환을 예를 들어 여러 가지 질병 상태에 중요한 것 같습니다 18. 따라서 시냅스 억제를 추정하는 것은 생체 내에서 척수 수준에서 병리학 실험 조건을 조사 할 가치가있다 </em&gt;. PAD는 척수 연접 억제의 직접 측정을 제공하는 양 실시 전위를 일으킨다. 그 잠재력은 후근 전위 (DRP)라고 인접 등의 뿌리 (7)의 자극 후 척수 등쪽 뿌리에서 측정 할 수있다. DRP의 첫 번째 측정은 고양이와 개구리 19에보고 된 집중적으로 1970 년대 초 3,4,20,21에서 에클 스, 슈미트, 그리고 다른 사람에 의해 고양이에서 공부했다. 고양이 (22)와 쥐 23 DRP의 생체 내 녹음이 널리 사용되었지만, 마우스의 측정은 거의 독점적으로 생체 고립 척수 준비 15,24에서 수행되었다. 여기서, 우리는 본래 유기체 시냅스 억제 직접적인 측정을 허용 생체 내에서 마취 된 쥐에서 DRP를 기록하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>유리관(내경 1.16mm)</td><td>Science Products(독일 호프하임)</td><td>GB200F-10</td><td>다른 유리관도 적합할 수 있음</td></tr><tr><td>초융합 용액(멸균, 0,9% NaCl)</td><td>Braun Melsungen AG</td><td>3570350</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2%(자일라진)</td><td>Bayer Animal Health GmbH(독일 레버쿠젠)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>Medistar GmbH(독일 Ascheberg)</td><td>케타민 10%</td><td></td></tr><tr><td>30 G 마이크로니들/ 스테리칸</td><td>브라운 Melsungen AG</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>S88 이중 출력 스퀘어 펄스</td><td>잔디 기술용 소금(미국 워릭)</td><td>S88X</td><td></td></tr><tr><td>SIU5 RF 변압기 절연 장치</td><td>잔디 기술(미국 워릭)</td><td>SIU-V</td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8</td><td>HEKA( Lambrecht, Deutschland)</td><td>LIH 8+8 + Patchmaster software</td><td></td></tr><tr><td>Universal amplifier</td><td>NPI (Tamm, Deutschland)</td><td>ELC-03X</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus (Tokyo, Japan)</td>Micromanipulator <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td>MPC-200/MPC-325</td><td>기계식 마이크로 매니퓰레이터도 가능</td></tr><tr><td>Homeothermic Blanket System</td><td>Stoelting (Wood Dale, USA)</td><td>50300V</td><td></td></tr><tr><td>Intra-/extracellular recording electrode holder</td><td>Harvard Apparatus (Holliston, USA)</td><td>641227</td><td></td></tr></tbody></table>

배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정<em&gt; 생체</em

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

시냅스 억제는 척수에서 가장 강력한 억제 메커니즘 중 하나입니다. 기본 생리 학적 메커니즘은 GABA 성 AXO - 축삭의 시냅스 (기본 심성 탈분극)에 의해 매개 차 구 심성 섬유의 탈분극입니다. 기본 심성 탈분극의 강도는 후근 (후근 전위, DRP)에 볼륨 실시 전위의 기록에 의해 측정 할 수있다. 시냅스 억제의 병리학 적 변화는 특정 두통 상태의 비정상적인 중앙 처리 및 모터 hyperexcitability 일부 질환에 중요하다. 여기, 우리는 생쥐에서 생체 내에서 기록 DRP하는 방법을 설명합니다. 마취 된 동물 흡입 전극을 사용하여 기록 절차의 척수 등쪽 뿌리의 제조는 설명합니다. 이 방법은 GABA 성 DRP를 측정함으로써 살아있는 마우스에서 척추 시냅스 억제를 추정 할 수 있습니다. 형질 전환 마우스 모델과 함께, DRP 녹화 할 수있다 SE질병 관련 척추의 병태 생리를 조사 할 수있는 강력한 도구로 RVE는. 생체 내 기록은 예를 들어, 동시 녹음 또는 supraspinal 네트워크 및 말초 신경의 자극에 의해 DRP의 유도 조작의 가능성 생체 고립 척수 준비에 비해 몇 가지 장점이 있습니다.

전형적인 DRP 흔적은도 3에 나타낸다. 눈에 띄는 자극 이슈는 일반적으로 짧은 아래로 편향옵니다. 그 후 DRP 나타내는 느리고 오래 상향 편향은, 명확히 구별이다. 녹음의 하위 집합으로, 지느러미 루트 반사 신경 DRP의 상단에 작은 스파이크로 볼 수 있습니다. 자극의 전압이 과도한 경우 정상적인 야생형 생쥐에서 지느러미 루트 반사 신경이 가장 자주 나타납니다. 지느러미 루트 반사 신경이 준비 재현성 유도 할 수 없기 때문에, 그들은 분석을 위해 촬영되지 않은 및 관리가 가장에 자극 전압을 줄이기 위해 찍은, 그러나 아직도 supramaximal 강도. DRP 피크 진폭의 분석을 위해, 20 ~ 30 연속 스윕의 흔적이 (그림 3a)를 사용하는 평균. DRP 피크 진폭은 종래 자극 이슈 기준선 수준과 비교하여 산출 할 수있다. DRP의 시간 종속 합산 반복적 세인트에서 분석 될 수있다imulations (3 자극, 100 Hz에서, 그림...

GABA 성 시냅스 억제는 모터와 척수 네트워크에서 감각 신호 통합을위한 중요한 척수에서 강력한 억제 메커니즘입니다. 기초 기본 심성의 탈분극은 후근 전위 (DRP)의 기록에 의해 측정 할 수있다. 여기에서 우리는 생쥐의 DRP의 생체 기록하는 방법을 보여줍니다.

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

시냅스 전 억제는 척수에서 가장 강력한 억제 기전 중 하나입니다. 시냅스 전 억제의 병리적 변화는 여러 질환의 발병 기전에서 중요하게 작용합니다. 예를 들어, 신경병성 및 염증성 통증뿐만 아니라 비정상적인 중추성 통증 처리 과정이 이에 해당합니다.이는 척수 손상 및 운동 과흥분성을 동반한 중추 신경계 질환에서 중요합니다. 따라서 이러한 질환의 동물 모델을 연구할 때, 시냅스 전 억제(presynaptic inhibition)의 강도를 파악하는 것은 유의미한 정보를 제공할 수 있습니다. 본 논문에서는 마우스 모델에서 시냅스 전 억제를 평가하는 방법을 제시합니다.생체 내 시냅스 전 억제는 1차 구심성 뉴런의 탈분극에 의해 매개되며, 이는 감각 시냅스 전 섬유에 작용하는 GABA성 축삭-축삭 시냅스에 의해 유도됩니다. GABA_A 수용체 활성은 염화 이온 전도도의 증가를 가져오며, 이는 국소 이온 농도 분포로 인해 1차 구심성 탈분극을 유발합니다. 이러한 탈분극은 활동 전위가 축삭 말단으로 전파되는 것을 차단하고 그 강도를 감소시켜, 칼슘 유입의 감소와 신경전달물질 방출의 감소로 이어집니다.따라서 단일 시냅스로 흥분되는 뉴런의 흥분성 postsynaptic potential은 postsynaptic membrane potential과 해당 뉴런의 흥분성을 변화시키지 않고도 억제될 수 있습니다. 이러한 1차 구심성 탈분극의 체적 전도 전위는 척수 내의 presynaptic inhibition을 직접적으로 측정할 수 있게 하며, 이러한 전위는 자극 후 척수 dorsal root에서 측정할 수 있는데, 이를 dorsal root potential이라고 합니다. dorsal root potential의 측정법은 잘 확립되어 있으며 고양이, 쥐, 개구리에서 널리 사용되어 왔으나, 생쥐의 경우 기록이 거의 대부분 ex vivo isolated spinal cord 표본에서만 수행되었습니다. 본 영상에서는 마취된 생쥐의 in vivo 상태에서 이러한 root potential을 기록하는 방법을 설명하며, 이를 통해 온전한 유기체 내에서의 presynaptic inhibition을 직접적으로 측정할 수 있습니다.생체 내(in vivo) 마우스 DRP 기록을 위해서는 다음과 같은 장비가 필요합니다. 표준 설탕 도구, 자극 전극, 기록 전극 및 기준 전극의 위치를 각각 잡기 위한 수동 스테레오 현미경 3대가 필요합니다. 또한, 자극 및 기록만을 위한 마우스 프레임과 마우스의 체온을 조절하기 위한 가열 패드 또는 자극기가 필요합니다.신호 대 잡음비를 높이기 위해 표준 증폭기와 데이터 수집 장치가 필요합니다. DRP 기록 중에는 맞춤 제작된 단면 전극이 필요하며, 이를 위해 전극 제작 과정이 필요합니다. 표준 피펫 풀러를 사용하여 일반적인 유리 튜브를 당겨 제작하십시오.다이아몬드 줄을 사용하여 전극의 팁 끝부분을 깨뜨려 팁 개구부를 넓힙니다. 표준 실험용 토치로 팁을 연마하여 표면을 매끄럽게 만듭니다. 준비를 시작하기 전, 케타민을 IP 주사하여 동물을 마취시키고 정위 고정 장치 내에 마우스의 머리를 고정합니다.그런 다음 마우스의 뒷발 발가락(PO)을 꼬집어 마취 깊이를 테스트합니다. 발가락의 회피 반응이 보이지 않을 때만 준비 과정을 시작하십시오. 마취 깊이는 실험 과정 중에 반복적으로 확인해야 합니다. 케타민을 뒷다리 대퇴사두근에 반복적으로 주사합니다.마취 상태를 유지하며, 직장 프로브를 사용하여 동물의 체온을 모니터링합니다. 후주(dorsal column) 준비를 위해, 등 쪽 정중선을 따라 피부를 절개합니다.피부를 하부 조직으로부터 느슨하게 하여 척추를 주변 결합 조직과 분리합니다. 척추 양측에 두 번의 절개를 가하고, 메스로 조직을 밀어내어 절개 부위를 넓힙니다. 그 후 작은 골 니플(bone nipple)을 사용하여 극돌기를 제거합니다.요추 부위부터 시작합니다. 수술 부위의 건조를 방지하기 위해 흉추 중간 부위까지 진행하십시오. 상처 주변에 작은 거즈 조각들을 배치하고 0.9% sodium chloride로 적셔줍니다.그런 다음 요추 부위부터 척수를 준비하기 시작합니다. 인접한 두 척추 사이의 공간으로 본 니플(bone nipple)의 팁을 조심스럽게 밀어 넣습니다. 이때 척수에 가해지는 압력을 가능한 한 줄일 수 있도록 각별히 주의하십시오.인공 뇌척수액으로 척수의 흉수 부위를 습윤하게 유지하십시오. 이후의 모든 단계에서 이 작업을 반복적으로 수행하십시오. 30G 바늘을 사용하여 듀로미터(durometer)를 조심스럽게 개방하십시오.그 다음, 척추에서 인접한 동측 신경근 두 개를 느슨하게 하여 분리합니다. 그런 다음 신경근을 가능한 한 원위부에서 절단합니다. 시술 과정 중에.뿌리가 과도하게 당겨지지 않도록 주의하십시오. 이는 결과적으로 DRP의 성공적인 기록을 방해하게 됩니다. 기준 전극을 척수 가까이에 배치한 후, 섹션 전극 하나의 팁을 한쪽 등쪽 뿌리(dorsal root)의 근위단에 가깝게 이동시킵니다. 그런 다음, 흡입 전극의 팁 개구부 위에 등쪽 뿌리를 위치시킵니다.그 후 전극에 연결된 시린지를 통해 짧게 음압을 가하여 등쪽뿌리를 전극 속으로 흡입합니다. 다음으로, 용액이 전극 내의 등쪽뿌리와 염화은선을 모두 감쌀 때까지 낮은 음압을 지속적으로 가하면서 전극을 A CSF로 채웁니다. 이어서 액체 브리지가 전극을 단락시키지 않도록 전극의 팁을 척수로부터 들어 올립니다.두 번째 동측 인접 신경근에 대해 동일한 단계를 반복합니다. 두 전극이 모두 배치되면, 한쪽 경로를 자극하는 동안 다른 쪽에서 기록하여 DRP 기록을 시작하며, 자극 전압을 최대치 이상의 수준(supra maximal levels)으로 높입니다. 전형적인 배측 신경근 전위(dorsal root potentials) 기록은 왼쪽 패널에 표시된 것과 같습니다.짧은 자극 아티팩트 이후에 짧은 양성 편향과 긴 음성 편향이 뒤따릅니다. 마지막 편향이 실제 배근 전위입니다. 이 진폭은 자극 기록 직전에 기록된 기선(baseline)을 기준으로 계산할 수 있습니다.호흡 운동이나 EKG 아티팩트로 인한 한 쌍의 뿌리로부터 발생하는 여러 트레이스가 기록된 DRP를 방해할 수 있습니다. 기록이 성공적으로 완료된 후, 자극 부위와 기록 부위를 서로 바꾸어 두 번째 기록을 수행하는 것이 가능합니다. 제시된 기록 방법입니다.생체 내(in vivo) 뿌리 전위 측정은 특히 유전자 변형 마우스와 결합하여 일차 구심성 신경, 항분극 및 온전한 동물의 상태를 평가할 수 있게 해줍니다. 이는 척수 억제의 기저 메커니즘을 조사하는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 척수 통합은 운동 기능과 다중 모드 감각 인지에 있어 매우 중요합니다.이 방법은 통증, 척수 손상, 말초 신경 손상 및 염증을 다루는 연구에 유용합니다. 생체 내(in vivo)에서 DRP를 기록하면 분석자가 척수 상위 활동과 패드(pad) 간의 상호작용을 분석할 수 있습니다. 이는 일반적으로 마우스의 DRP를 측정하는 데 사용되는 분리된 척수 표본에서는 불가능합니다.원칙적으로, 기록 중에 척수로 약물을 투여하는 것이 가능합니다. 추가 피펫을 통한 국소 투여는 국소 약물 농도의 조절을 강화하고 빠르게 할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

출처: Lai, J., et al. 설치류 뇌에서 억제제의 동시 전기생리학적 기록 및 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 쥐 상골에서 동시 신경 기록 및 억제를 위한 미세 주입 기반 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 정위 표적화, 두개골 드릴링, 신경 활동을 기록하면서 억제성 신경 전달 물질을 전달하는 주사대 삽입이 포함됩니다. 빛 자극은 활동 전위를 유발하는 반면 약물 미세 주사는 신경 흥분성을 억제합니다. 신경 전달 물질 수치가 감소함에 따라 신경 활동이 기준선으로 돌아가 억제와 회복에 대한 연구가 가능해집니다.

쥐에서 신경 활동의 억제 및 전기생리학을 사용한 검출

생체 내에서 신경의 전도 특성의 측정은 신경 근육 질환의 다양한 동물 모델을 특성화 할 수있는 강력한 도구를 예시. 여기서, 우리는 마취 된 쥐의 좌골 신경의 전기 생리 분석이 수행 될 수있는 간단하고 신뢰성있는 프로토콜을 제시한다.

마우스 좌골 신경에 생체 전기 생리 측정에서

우리는 젊은 쥐에서 척수의 경사 조각을 준비하는 방법을 보여줍니다. 이 준비는 복부 뿌리의 자극 수 있습니다.

복부 루트 자극에 대한 사선 척수 조각의 준비

신경 유도의 측정 neurodegeneration의 마우스 모델을 평가 하는 유용한 도구 이지만 그것은 자주 hindlimbs에 좌 골 신경을 자극에 적용 됩니다. 여기, 복합 근육 활동 전위 (CMAP) vivo에서 상 완 신경 총에 의해 innervated 마우스 forelimb 근육에서 측정 하는 기술을 설명 합니다.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

이 프로토콜은 동시 트랜스 척추 직접 전류 자극을 가진 쥐 요추 모토뉴런의 생체 내 세포 내 기록을 설명합니다. 이 방법을 통해 멤브레인 특성을 측정하고 척수의 무음 또는 음극 편광 전, 도중 및 후에 모토뉴런의 리듬 발사를 기록할 수 있습니다.

트랜스 척추 직접 전류 자극 중 유형 식별 쥐 척추 운동 신경의 생체 내 세포 내 기록

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

이 연구는 동기식 ECG 기록과 함께 생체 내 칼슘 이미징을 위해 마취된 마우스의 T-DRG를 노출시키는 외과적 조작을 제시합니다. 이 방법은 말초 전기 신경 자극 및 흉부 내장 기관 입력뿐만 아니라 1차 감각 수준에서의 상호 작용을 연구하기 위한 최첨단 도구입니다.

말초 신경 자극 연구를 위한 생체 내 흉부 등근 신경절(DRG) 칼슘 영상 및 ECG 기록

배우세요 생쥐 척수에서 GABAergic 시냅스 전 억제를 측정하는 배근 전위(DRP) 기록법. 이 방법은 통증 메커니즘 및 척수 손상 연구에 중요한 정보를 제공합니다.

배근 잠재적 기록하여 생쥐의 척수 시냅스 억제를 측정

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