미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

다음 실험의 전반적인 목표는 간단한 미세유체역학 기반 분석을 사용하여 다양한 세포 유형의 변형 능력을 조사하는 것입니다. 이것은 미크론 가늠자 순서를 통해서 세포 이동의 timescale를 조사하기 위하여 poly dimethyl suboxane 또는 PDMS microfluidic 장치를 제작해서 달성됩니다 수축 압력 몬 교류는 그들의 microfluidic 수로를 통해서 세포를 몰기 위하여 이용됩니다, 분석하는 것을 가능하게 하는 개인적인 세포의 개악 그리고 시간 의존하는 이완. 다음으로, 비디오를 처리하고 통과 시간 데이터의 히스토그램을 얻기 위해 자동화된 이미지 분석 프로그램이 실행됩니다.

그 결과, 서로 다른 세포 유형은 일련의 수축을 통한 이동 시간에 따라 세포 변형 능력에 차이를 보인다는 것을 보여줍니다. 원자력 현미경 또는 마이크로 피펫 흡인과 같은 기존 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 미세유체 장치가 높은 처리량으로 성공적으로 작동할 수 있다는 것입니다. 다른 microfluidic 장치는 또한 세포 de formability를 분석하기 위하여 이용될 수 있는 그러나.

우리는 세포가 폐 모세혈관 층(pulmonary capillary bed)과 같은 생리학적 맥락에서 흔히 볼 수 있는 기하학적 기하학인 순차적인 수축을 통과하도록 장치를 설계합니다. 시작하려면 수축 배열 채널의 너비를 평균 셀 직경의 약 30-50%로 선택하고 채널 높이를 셀 직경의 50% 이상으로 선택하여 미세유체 장치를 설계합니다. 입구 포트에 필터를 포함하여 파편을 제거하고 세포 클러스터를 분해합니다.

실험을 시작하기 전에 리소그래피 마이크로 가공을 위한 표준 기술을 사용하여 장치 마스터를 제작하십시오. 프로파일로미터를 사용하여 패턴 피쳐의 높이를 확인합니다. 다음으로, 압축 공기 탱크와 일련의 공기 조절기 및 피팅을 사용하여 압력 구동 흐름을 위한 공기 공급원을 수리합니다.

먼저 공기 공급 탱크와 수동 조절기를 설정합니다. 그런 다음 수동 조절기에 따라 전자 제어식 압력 조절기를 설정합니다. LabVIEW로 작성된 간단한 코드를 사용하여 원하는 압력을 입력합니다.

전기 공압 변환기는 내부 피드백 루프를 사용하여 미세유체 장치 전반에 걸쳐 지정된 압력과 일치하도록 밸브 출구 압력을 조정합니다. 표준 유세포 분석기 튜브에서 세포 현탁액 챔버를 조립하고 튜브에 압력 밀폐를 생성하는 기계 가공 캡을 조립하여 세포 현탁액의 흐름을 구동하기 위해 가압 챔버를 설정합니다. 압력 챔버 캡에는 두 개의 오리피스가 있는데, 하나는 압축 공기 탱크에 연결되는 입구이고 다른 하나는 셀이 가압 챔버에서 장치로 흐르는 배출구입니다.

다음으로, 초당 100프레임 이상의 획득 속도를 가진 카메라가 장착된 도립 현미경을 설정합니다. 수축 배열을 통해 흐르는 세포의 이미지를 캡처하려면 세포 배지 용액에 소량의 계면활성제를 첨가하면 PDMS 벽에 대한 세포 접착을 최소화하는 데 도움이 되므로 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 스톡 계면활성제 용액을 준비합니다. 미세유체 채널로 PDMS 블록을 제작하려면 PDMS 베이스 10g에 경화제 1g을 첨가하고 철저히 혼합합니다.

혼합물을 장치 위에 붓습니다. 갇힌 거품이 사라질 때까지 또는 약 10-20분 동안 진공 청소기가 적용된 벨 항아리에 Degas를 마스터합니다. 이 시간이 지난 후에도 AIR PDMS 인터페이스에 여전히 기포가 있을 수 있으며, 이는 정상적인 현상입니다.

이것들은 일반적으로 굽는 동안 소멸됩니다. 그런 다음 장치가 냉각된 후 4시간 동안 섭씨 65도에서 Degas 장치를 굽습니다. 마스터 몰드에서 미세유체 장치를 제거합니다.

장치의 한쪽 모서리를 부드럽게 들어 올려 시작합니다. PD DMS 블록을 똑바로 들어 올리는 것과는 대조적으로 느리고 부드러운 박리로 PDMS와 마스터 모두에 대한 스트레스를 줄입니다 면도날로 PDMS 블록에서 개별 미세유체 장치를 절단하고 PDMS 장치의 마스터 펀치 구멍에서 장치를 제거하여 튜브와 마이크로 채널 사이에 액세스하기 위한 연결 포트를 만듭니다. 생검 펀치를 사용하여 채널 쪽에서 장치 외부측까지 구멍을 만듭니다.

PDMS 장치를 이소프로판올로 헹구어 먼지를 제거하고 PDMS 덩어리를 제거합니다. 스퀴즈 병에서 순수한 이소프로판올이 구멍을 통해 꾸준히 흐르도록 하여 펀칭된 구멍에 이물질이 없는지 확인하십시오. 여과된 공기로 말리십시오.

메탄올로 헹궈 유리 기판을 청소하십시오. 그런 다음 여과된 공기로 건조시키고 섭씨 200도의 핫 플레이트에 5-10분 동안 올려 플라즈마 처리 전에 유리가 완전히 깨끗하고 건조되었는지 확인합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 현미경으로 미세유체 장치를 검사합니다.

채널이 축소되거나 파손되지 않았는지, 그리고 입구와 출구 구멍이 모두 저전력 대물렌즈를 사용하여 장치 채널에 직접 연결되었는지 확인합니다. 세포 현탁액을 유세포 분석기 튜브에 넣고 압력 캡에 연결한 후 튜브를 미세유체 장치에 연결하고 압력을 약 14-21킬로파스칼로 조정한 다음 세포 현탁액이 튜브 끝에서 나올 때까지 플러시합니다. 그런 다음 장치를 평평한 표면에 놓고 튜브를 장치 입구에 삽입합니다.

PDMS 장치의 아래쪽에 접착된 유리 덮개 슬립은 깨지기 쉽습니다. 세포 현탁액이 들어 있는 튜브의 끝을 장치 입구에 삽입합니다. 그런 다음 튜브 조각을 출구 포트에 삽입하고 현미경 스테이지 측면에 테이프로 붙인 빈 Falcon 튜브와 같은 폐기물 수거를 위해 빈 튜브에 배선합니다.

압력을 약 28킬로파스칼로 또는 세포가 채널을 통해 흐를 때까지 부드럽게 높입니다. 여러 채널이 시야각에 있고 화면 하단에 수직이 되도록 장치를 배치합니다. 데이터 분석을 시작하려면 마스터 스크립트 m 파일을 열고 프로그램을 실행합니다.

나타나는 Windows 탐색기 창에서 분석할 첫 번째 비디오를 선택합니다. 선택한 비디오의 프레임 속도를 지정하고 Enter 키를 누릅니다. 사용자에게 직사각형 자르기 창을 선택하라는 메시지를 표시하는 그림이 나타납니다.

첫 번째 비디오의 경우 왼쪽에서 오른쪽으로 모든 채널을 포함하고 채널 배열의 첫 번째 전구 바로 위에 있는 채널을 교차하는 창을 선택합니다. 위쪽과 아래쪽에서 자른 이미지에서 수축 영역을 선택합니다. 알고리즘은 각 비디오의 처음 50개 프레임에 대한 셀 분할을 표시합니다.

왼쪽 위 이미지를 면밀히 모니터링하여 알고리즘이 세포를 정확하게 찾고 있는지 확인합니다. 소스 비디오에 이미지화된 이미지가 겹쳐집니다. 식별된 셀의 위치를 보여 주려면 Windows 탐색기 창에서 처리할 다음 비디오를 선택합니다.

알고리즘이 반복됩니다. 선택한 각 비디오에 대해 취소를 선택합니다. Windows 탐색기 창을 통해 원하는 모든 비디오가 추가되어 비디오 목록이 완료되었음을 함수에 지시하면 HL 60 및 호중구 유형 HL 60 셀의 통과 시간에 대한 대표 결과가 단일 세포가 일련의 수축 통과를 통과하는 데 걸리는 시간 척도를 보여줍니다.

시간은 일련의 7개의 수축에서 각 7마이크로미터 수축에서 개별 세포 집단에 대해 측정됩니다. 28킬로파스칼의 구동 압력에서 HL 60 세포는 후속 수축을 통해 패키징하기 전에 중앙값 9.3밀리초 동안 첫 번째 수축을 일시적으로 폐색합니다. 대조적으로, 호중구형 HL 60 세포는 패키징 전에 4.3밀리초 동안만 첫 번째 수축을 폐색합니다.

첫 번째 수축을 통과하면 세포는 2에서 7까지 나머지 수축을 통해 더 빠르게 이동하며, HL 60 세포의 경우 평균 통과 시간이 4.0밀리초, 호중구 유형 세포의 경우 3.3밀리초입니다. 세포 집단 간의 통과 시간을 비교함으로써 세포 정보 형성 가능성의 차이를 밝힐 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 간단한 미세유체 분석을 사용하여 다양한 세포 유형의 변형 능력을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

여기서, 압력 구동 흐름은 미세 유체 채널을 통해 세포를 구동하는 데 사용되며, 이를 통해 개별 세포의 변형 및 이완을 분석할 수 있습니다.