Name: 네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 뱀 근육을 이용한 4차원 형광 이미징으로 신경 말단의 엔도좀 역학을 시각화하는 방법을. 이 기술은 시냅스 기능 연구에 필수적인 생세포 내 소포 운동을 실시간 관찰합니다.

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이 작품은 건강 그랜트 NS-024572 (RSW에)의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. Supravital 염료와 준비 얼룩 <ol><li> 가터 뱀 해부 프로토콜의 스튜어트 등. 5를보고 탱 등. 6 파충류 조직은 긴 시간에 대한 생리 학적 남아 있고, 적은 세균 오염과, (아래 참조) 낮은 온도로 유지합니다. 포유 동물 조직은 일반적으로 실온 또는 그 이상으로 유지된다. </li><li> 리소좀 중요한 염료의 염색을 위해, 차가운 파충류 링거 용액 1:5,000 (0.2 μM)에 염료를 용해. 15 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 차가운 링거 여러 번 씻는다. 가능한 한 빨리 이미지. </li><li> 의 KCl 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 고의 KCl 링거 1:500 (7 μM)에 염료를 희석. 30 ~ 60 초에 최대 4 ° C에서 알을 품다. ~ 1 분 / 린스, 차가운 링거 빠르게 세 번 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지. </li><li> 고장 성 (자당) 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 상기와 0.5 M의 자당 링거의 염료를 희석. 4 &amp; #을 품다176, 2-5 분 동안 C. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지. </li><li> FM1 - 43 염색에 대한 전기 자극을 통해, 탱 등. 6 간단히 참조, 준비는 생리 식염수와 염료를 포함하는 요리를 배치됩니다. 신경은 200 마이크로 초 직사각형 펄스 (~ 12 V, 30 Hz에서, 18 마이크로 초)의 사전 프로그래밍 된 기차로 자극된다. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지. </li></ol> 2. 이미징을위한 준비를 구성 <ol><li> 그 구조는 현미경 대물에 최대한 가깝게되도록 준비 배향. </li><li> 도립 현미경을 사용하는 경우, 그 하부 라운드 얇은 커버 슬립을 포함하는 챔버를 이용한다. 전형적으로, 촬상 챔버는 중앙에 25mm 직경 중 1 두께 유리 커버 슬립으로 얇은 스텐레스 바닥을 가져야한다. 직립 현미경을 사용하는 경우, 하부 커버 슬립은 필수이지만 유용되지전송 된 빛으로 영상을 허용 (예를 들어 미분 간섭 대비, DIC)는 시편의 방향과 관심의 개체를 찾을 수 있습니다. </li><li> 가장 높은 3D 해상도를 얻기 위해 적절한 목표를 선택합니다. 장단점이 개구 렌즈 (NA), 작동 거리, 확대 및 유형 가운데있다 (건조, 물과 기름 침지). 조직 문화와 같은 얇은 준비를 위해, 석유 목표는 최고입니다. 직립 현미경을 사용하여, 수계 욕 커버 슬립을 띄워 커버 슬립의 상단과 대물 간의 침지 오일을 사용한다. </li><li> 디콘 볼 루션 소프트웨어가 사용되는 경우, 판매자는 특정 목적의 소정의 점 분포 함수 (PSFS)을 제공 할 수 있습니다. 이러한 정보가 제공되지 않거나 지원되지 않는 목적을 선택하면, 형광 마이크로 도트 또는 유사한 회절 한정 개체 7,8 촬상하여 PSF를 결정하는 경우. </li></ol> 3. 원하는 필드의 깊이와 이마의 번호를 설정시간 경과 프레임 당 원하는 GES <ol><li> 필드의 전체 깊이를 선택하는 것이 너무 이동하거나 그 구조가 사라지거나 그들이 Z-방향으로 이동 초점이 이동하지 않는 상호 작용. Z 필드는 약간 군데 중의 셀 또는 셀 공정의 수직 치수를 초과해야한다. 척추 모터 단자의 경우, 15 ~ 20 μm의는 일반적입니다. </li><li> 포커스의 각 증가에 필요한 Z-축 단계를 계산한다. Z-축을 따르는 해상도의 목적 특성에 따라 변화한다; 이것은 XY 플레인의 해상도의 약 네번째이다. 공 촛점 이미징 또는 컨볼 루션 소프트웨어 중 하나를 사용하는 경우, Z-축 해상도가 향상된다. z 방향 5 의도적으로 오버 샘플링에 의해 최종 해상도를 향상뿐만 아니라, 아래 3.3 단계를 참조하십시오. 전형적인 스텝 간격은 40-100X 목적의 400-1,500 nm 내지 범위이다. 빛은 각각의 Z-단계의 이미지에 사이 문을 닫았해야합니다. </li><li> Z-스택 당 이미지 수를 선택, 즉 필드의 원하는 깊이는 분할스텝 간격으로. 일반적인 Z-스택을 완료하는 시간은 1-10 초이다. 각각의 이미지 비행기가 약간 다른 시점에 해당하기 때문에 빠른 속도로 움직이는 물체 (100 ㎚ / 초) 3D 이미지 스택에서 흐리게 나타날 수 있습니다. 또한, 각각의 추가 이미지는 광표백 가능한 광독성 (토론 참조)에 기여한다. 어느 상황이 속하는 경우, 스택 당 적은 수의 이미지를 수집하는 더 큰 Z-단계를 선택합니다. 이미지 보간 소프트웨어 (아래 단계 6.3)를 사용하여 나중에 보정합니다. </li></ol> 4. 시간 경과 프레임 속도를 선택합니다 부드럽게 같은 움직임, 상호 작용 또는 융합 이벤트를 9로 시간 변화를 해결하기 위해 단지 충분 속도를 실험에 의해 선택합니다. 오버 샘플링이 불필요하게 빛에 대한 노출이 증가하면서 샘플링에서 모션 아티팩트 (표본 오차)를 생성 할 수 있습니다. 하나의 긴 시퀀스 나 같은 준비, 상대적으로 작은 총 시간 간격으로 각 (에서 몇 가지 반복되는 시퀀스 중 하나를 수집 <eM&gt; 예를 들어 10 시간의 점 X 30 초 간격 = 5 분). 가능하면, 전체 제제의 드리프트를 포함하여, 대략 추정 동작 속도로 연속적인 표면 형광 조명 제제를 본 경우에. 5. 특정 준비를 위해 모든 라이브 영상을 완료 파충류 준비는 일반적으로 냉각 긴 경우, ~ ~ 2 시간 동안 강력한 남아있다. 6. 원하는 용도에 따라 데이터 분석 <ol><li> 모든 원시 데이터 파일을 유지합니다. 디지털 저장은 일반적으로 문제가되지 않지만, 처리 시간도 빠른 개인용 컴퓨터 나 워크 스테이션과 함께 중요하다. 이러한 이유로,이자 [투자 수익 (ROI)]의 영역에 자르기 이미지. 관심의 전체 영역이 전체 시간의 과정 동안 자른 창에 있음을 확신합니다. </li><li> Deconvolve 콘텐츠 적절한 소프트웨어 및 정확한 점 분포 함수를 사용하여 스택. 그 해상도가 향상 확인하고 아무 유물에 의해 생성되지 않았디컨 볼 루션 알고리즘. 그림 3은 예를 들어 이미지를 보여줍니다. </li><li> z 축 명백한 해상도를 확장 보간 알고리즘을 사용합니다. 명백한 0.25 μm의 분리에 실제 1.5 μm의 이미지 평면 분리에서 배의 확장을 제안한다. 또한, 오버 샘플링의 조합 (단계 3.2) 및 보간을 사용합니다. </li><li> 원하는 경우, 콘트라스트, 밝기, 노이즈 필터링, 광표백 유용한 일반적인 화상 처리의 조정을 수행한다. 이미지 처리 표준은 대부분의 과학적인 작업을 위해, 그것은 동일한 수정을 스택 내의 서로 다른 시점에서 모두, 모든 화상에 적용되는 것이 적절하다는 것을 지시. 특정 조정의 결과는 모든 이미지 9 사이에서 평가되어야한다. </li><li> 데이터의 수출을 위해 특정 표시 모드를 선택합니다. 가장 간단한 디스플레이는 녹색 - 빨강 또는 빨강 - 파랑 입체 사진 (그림 3의 예), 스테레오 쌍, 또는 교대를 사용하여 스테레오 영상입니다 맞 왼쪽 /T 눈은 셔터 안경 프레임. 입체 사진은 단일 색상으로 제한됩니다. Z 축 시각적 해상도를 향상시키기 위해 필요한 경우 겉보기 화상 농도를 향상시킨다. </li><li> 다양한 필터링 및 이미지 향상 기술을 실험. 예를 들어, 라플라스 필터링을 배경 위의 작은 구조의 대비를 증가하는 데 유용합니다. 주변 영역의 밝기가 감소하는 동안 실행되는 윈도우의 중심 화소의 밝기가 향상된다. 몇 가지 필터링 방법은 조합에서 잘 작동하지 않습니다. </li><li> 시간에 따른 제제의 상당한 움직임이있을 경우, 드리프트 보정을 적용한다. 이러한 운동은 약이 활동 전위와 시냅스 전위를 억제하기 위해 추가 심지어, 근육을 생활에 일반적입니다. 픽셀 등록 알고리즘 (예. IMARIS, 어도비 애프터 이펙 츠, ImageJ에 대한 TurboReg 플러그인) 시간 경과 이미지를 정렬 줄일 수 있지만, 일반적으로 완전히 같은 동작을 제거하지. </li></ol>

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<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

4D 영상의 가장 중요한 측면은 노광의 지속 시간 및 강도의 관리이다. 광표백은 화상 신호 대 잡음비를 감소 및 형광체의 선택을 포함하는 다양한 요인에 따라 문제 여부 일 수있다. 생체 조직 (광독성)에 비특이적 손상 photobleaching에 관련되어, 때로는 목적 2,12 나 미분 간섭 대비 (DIC)로서 적합한 시야 광학계와 형태의 시험에 의해 설계 형광 프로브를 이용하여 식별 될 수있다. 확실히 광표백 및 광독성과 관련된 이들의 크기 이하 가벼운 수준에서 발생 생리적 효과를 유도하는 것도 가능하다. 예를 들어, 다 제제를 사용하는 초기 실험에서, 각 자극 후 다른 시간에 고정 MES 간단한 자극 후 시간에 따라 소실되는 속도는 6을 측정 하였다. 표준 연습 T는로그들이 볼 때까지 O 퇴색 최소화, 준비는 어둠 속에서 유지되었다. 유사한 실험 4D 라이브 영상을 사용하여 수행되었을 때, 많은 MES 실험 (~ 20 ~ 60 분)에...

조직 생활의 시간 경과 영상은 시간의 한 지점에서 이미지가 고정 또는 생활 준비에 알 수없는 동적 구조 - 기능 관계에 대한 시각에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 종종 시간 정보에 액세스하기위한 트레이드 오프는 광학 해상도의 감소이다. 높은 수치 조리개 기름 침지 목표는 유일한 대안으로 침수 또는 건조 목적을두고 있기 때문에 초점이 자신의 좁은 범위의 조직 생활에 실용적이다. 또한, 공 초점 광학에 의해 제공 증가 된 해상도는 조명의 상대적으로 높은 수준의 1,2 필요한에서 광독성 환경에 따라 약간의 생활 준비에 활용 될 수 없습니다. 여러 실시간 또는 시간 경과 광학 기술이 제공하는 향상된 해상도를 사용할 수있는 동안 마지막으로, 자신의 적용은 그 구조가 목표 1의 몇 백 나노 미터 내에 위치 할 수있는 준비로 제한됩니다. 기재된 방법상대적으로 저가의 장비를 사용한다 다목적, 아직 더 일반적으로 사용되는 시간 경과 기술에 비해 향상된 해상도를 제공합니다. 그것은 개인의 실험실뿐만 아니라 영상 시설에서 사용하기위한 것입니다. 방법은 민감한 디지털 카메라로 급속 약간 다른 초점 평면 (Z-스택)에서의 이미지 세트를 획득하기 위해 설계된 하드웨어와 함께, 종래의 표면 형광 현미경을 이용한다. 각각의 Z-스택은 디지털 해상도를 증가 deconvolved된다. 3D 시간 경과 (4D) 영상의 하나의 기능은 세포 기관 또는 다른 구조물을 이동의 정확한 추적합니다. 제대로 설정하면, 몇 군데 구조는 초점이 이동하지 않고, 세 방향으로의 움직임을 관찰하고 정량화 할 수있다. 스테인드 구조는 단지 좁은 초점 평면 위 또는 아래에 표류하여 하나 이상의 시간 경과 프레임에 사라에 따라서는 불가능하다. 방법은 또한 상호 작용 가능한 푸을 평가하기위한 중요한 툴로서 기능작은 구조의 시온. 기존의 표면 형광 또는 회절 한계 (수백 nm의)에 가까운 구조의 공 촛점 이미지가 병합 된 이미지는 각각의 라벨 3의 중복을 보이고도 융합을 확인하지 않습니다. 융합 제안하지만 개체 회절 한계 이하의 거리에 의해 수평 또는 수직으로 분리되어 남아있을 수있다. 3-4 차원 화상은, 대조적으로, 세 개의 직교하는 방향의 각각에 오브젝트를 볼 수있게. 모두 세 가지보기에서 융합의 모양은 확실성 수준을 증가시킨다. 그리고, 약간의 생활 준비에, 감독 또는 둘 모두 라벨이 시간에 함께 이동할 때 상상 속으로 융합 개체의 브라운 운동은 더 증거를 제공한다. 물론 때 회절 한계 근처에서 배경 엄선한 구조의 확실성 또는 그들이이 염료 (융합)가 포함되어 있음을 보여주는 수준은 절대 아니다. 만약 예컨대 형광 공명 에너지 전달 (FRET)와 같은 적용, 특수 기술4, 더 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>최종 농도: 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>F35335</td><td>최종 농도: 7 mM</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>최종 농도: 0.2 mM</td></tr><tr><td>파충류 Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>: 145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td>, <td>2.5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td> <td>1.0 mM</td></tr><tr><td>Hepes,</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>높은 KCl 파충류 링거 pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td>5.0mM</td></tr><tr><td>고당류 링거 pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2.5mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8mM</td></tr><tr><td>KH2PO4(이염성)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>설탕</td><td></td><td></td><td>0.5 M (17.1 g / 50 ml)</td></tr> <tr><td>Axioplan 200 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href = http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com< / a ></td></tr> <tr><td>N-Achroplan 63X 물 목표; na = 0.9; 작동 거리=2.4 mm&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 조합 광원/여기 필터 휠 스위처</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>175W 크세논 아크 램프</td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp; 방출 필터 휠 스위처</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Sensicam CCD 카메라</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Cascade 512 CCD 카메라</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><<td>a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>이미징 접시 - 사내에서 제작 - 직경 11cm; 직경 25mm #1 커버슬립 내장형; 마그네틱 핀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO</td><td>Deconvolution; 드리프트 보정; 3D 및 4D 데이터 프리젠 테이션</td> <td><a href = "http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, CT</td><td>드리프트 보정; 3D 및 4D 데이터 프리젠 테이션</td> <td><a href = "http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com< / a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>드리프트 보정</td><td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>여러 플러그인 사용 가능; 스테레오 페어 구성</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>스테레오 페어 구성</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

가터 뱀의 근육을 abdominis 사차원 (4D) 빛의 영상은 얇은 transversus의 모터 신경 터미널에서 작은 구조의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다. 원시 데이터는 3D의 Z-스택의 시간 경과 시퀀스를 포함한다. 각 스택은 400-1,500 nm의로 구분 초점 평면에서 표면 형광 광학으로 획득 한 4-20 이미지가 포함되어 있습니다. 이러한 포커스의 조정 등의 화상 스택의 입수 단계는, 여기 파장의 스위칭, 및 디지털 카메라의 동작은, 화상 비율을 최대화하고, 노광에서의 조직 손상을 최소화하기 위해 가능한 한 자동화된다. 인수 후, 이미지 스택의 세트가 공간 해상도를 향상시킬 수 deconvolved되어, 원하는 3D 형식으로 변환하고, 4D &quot;영화&quot;그 노력 실험 데이터에 따라, 컴퓨터 기반 분석의 다양한 적합을 만드는 데 사용됩니다. 하나의 응용 프로그램은 신경 터미널 - macroendosomes에서 발견 엔도 좀의 두 클래스 (MES)의 동적 거동의 연구이다및 (AES) - 누구의 크기 (두 가지 유형 200 ~ 800 nm의) 산성 엔도 좀은 회절 한계에 또는 근처에 있습니다. 각 시점에서의 3D 정보에 대한 액세스는 종래의 시간 경과 이미징에 비해 여러 장점을 제공한다. 특히, 크기 및 구조의 이동 속도는 날카로운 초점의 손실없이 시간을 통해 정량화 할 수있다. 4D 촬상 데이터의 예로는 그들이 exocytosed보다는 단순히 수직 거리에 초점이 하나의 평면에서 이동하는 것을 제안, MES는 원형질막 접근 사라지는 것으로 나타났다. 또한 각 3 직교 전망에서 볼 때 두 염료를 포함하는 구조에 대한 중복 시각화하여 MES 및 AES의 추정 융합입니다 밝혔다.

표시 데이터 (그림 3에서 낮은 고배율 뷰를 볼 수 있으며, 세포 내 이입 염료 (FM1-43) 흡수는 각 부통을 채우는 안개를 만듭니다) 뱀 신경 근육 터미널에서이고, 특히, macroendosomes (MES) 및 산성 엔도 좀 (AES) 이 터미널 5 이내. MES는 신경 활동 10시 대량 엔도 시토 시스에 의해 만들어지고 활동이 6을 중단 한 후 자신의 수는 시간이 기하 급수적으로 감소된다. 4D 라이브 영상의 사용은 그들 중 일부는 exocytose 때문에 그들의 숫자가 감소한다는 것을 제안, MES는 세포막으로 이동하는 경우를 확인하고 신속하게 사라했다. 그러한 모든 행은 하나의 시점에서 본 (및 전과) 완전히 옆 시점 간 (및 그 이후)되었습니다. 따라서 소멸에 요하는 시간은 우리의 프레임 간격 (30 초만큼 짧게) 및 세포 외 유출에 부합 미만이었다. 4D 데이터가 지원하지 않는 다른 이론은, MES 천천히 V의 신진 통해 ...

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 3차원 공간에서의 시간 경과에 따른 엔도솜을, 즉 4차원으로 정확하게 이미징하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뱀의 근육을 절개하여 이미징 디쉬에 조직을 배치합니다. 두 번째 단계는 생체 염색약을 사용하여 조직을 염색함으로써 엔도솜 형성을 자극하는 것입니다.다음으로, 하나 이상의 신경근 접합부에 대해 4차원 이미징을 수행합니다. 마지막 단계는 거대 엔도좀의 거동을 특성화하기 위한 정밀한 데이터 분석입니다. 결과적으로, 시냅스 전 공간 내에서 시간에 따른 엔도좀의 존재와 이동을 4차원 형광 이미징을 통해 입증할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 뱀의 복근이 단일 섬유 두께라는 점이며, 이를 통해 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 고품질의 이미지를 생성할 수 있다는 것입니다. 본 프로토콜에서는 가터뱀의 조직 준비물을 사용합니다. 파충류 조직은 낮은 온도로 유지하여 생리학적 상태를 더 오래 유지하고 박테리아 오염을 줄여야 합니다. 리소좀 생체 염색을 위해, 염료를 차가운 파충류 링거 용액에 1:5,000 비율로 용해합니다.최종 농도가 0.2 µM이 되도록 염료를 조직에 첨가하고 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 모든 FM 1-43 염색 과정에서 냉각된 링거액으로 조직을 여러 번 세척합니다. 염색 전, 자석 핀이 있는 이미징 디쉬에 샘플을 미리 마운트합니다.본 영상에서는 염화칼륨 자극을 이용한 FM 1 43 염색법만을 시연합니다. 고농도 염화칼륨 링거액으로 1:500 희석하여 최종 농도가 7 µM이 되도록 조제한 염료를 조직에 첨가한 후, 조직을 4 °C에서 최대 30~60초 동안 배양합니다. 이어서 차가운 링거액으로 회당 약 1분씩 빠르게 3회 세척합니다.모든 조직은 염색 및 차가운 링거액(ringer solution)으로 세척한 후 가능한 한 빨리 이미징해야 합니다. 도립 현미경을 사용하는 경우, 바닥에 얇고 둥근 커버 슬립이 포함된 이미징 챔버를 사용하십시오. 일반적으로 이미징 챔버는 직경 25 millimeter의 얇은 스테인리스 스틸 바닥을 가져야 합니다.이미징 준비를 위해 1번 두께의 유리 커버슬립을 중앙에 배치합니다. 자석 핀을 사용하여 근육이 이미징 디쉬 내에 최대한 중앙에 위치하고 가능한 한 평평하게 놓이도록 조정합니다. 준비된 시료를 소량의 링거액(ringer solution)으로 덮습니다.디쉬를 스테이지 중앙에 최대한 가깝게 배치하여 고정합니다. 가능한 가장 높은 3D 해상도를 얻기 위해 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 본 시연의 모든 실험에서는 63 x 수침 렌즈가 사용됩니다.이 절차를 시작하려면 slide book 5.0의 이미징 창을 엽니다. 여기에는 여러 메뉴가 탭 형태로 포함되어 있습니다. 두 번째 탭 Z를 사용하여 63 x water 대물렌즈를 선택하십시오. Z 스택 간격을 설정하십시오.본 예제에서는 라이브 이미징을 위해 1.5 microns의 Z 단계(Z step)를 사용합니다. 타임랩스 프레임 속도를 선택하십시오. 최적의 속도는 이동 상호작용이나 융합 이벤트와 같이 시간에 따른 변화를 부드럽게 분해하여 관찰하기에 충분한 속도입니다.예를 들어, 총 5분의 시간 간격 동안 32초 간격으로 10개의 시점을 설정합니다. 다음으로, 단말의 라이브 화면을 관심 초점의 상단에 수동으로 맞춘 후 약간 더 위로 이동하여 전체 피사체 심도를 선택합니다. 상단 설정(set top)을 선택하십시오.모든 영역이 초점에서 벗어날 때까지 샘플을 통해 천천히 초점을 맞춥니다. 다시 한번, 표시되는 평면 수와 총 이동 값은 캡처 창에서 선택한 피사체 심도를 나타냅니다. 방금 선택한 파라미터를 전달하려면 사용된 상단 및 하단 위치 라디오 버튼을 선택하십시오. 이미지 캡처를 위해 이미지 획득을 시작합니다.특정 시료 준비물에 대한 모든 라이브 이미징을 완료하십시오. 디지털 저장 공간은 대개 문제가 되지 않으므로 모든 원천 데이터 파일은 그대로 보관하십시오. 고성능 개인용 컴퓨터나 워크스테이션을 사용하더라도 처리 시간이 상당히 소요됩니다.이러한 이유로, 관심 영역(region of interest)을 크롭하여 전체 시간 동안 해당 관심 영역 전체가 크롭된 창 안에 포함되도록 하십시오. 과정 D에서는 적절한 소프트웨어와 정확한 점 퍼짐 함수(point spread function)를 사용하여 이미지 스택을 처리할 수 있으며, 해상도가 향상되었는지와 디컨볼루션(deconvolution) 알고리즘에 의해 생성된 아티팩트가 없는지 확인하십시오. 보간 알고리즘을 사용하여 Z축을 확장하십시오.실제 1.5 micron의 이미지 평면 간격에서 가시적인 0.25 micron 간격으로 6배 확장하는 겉보기 해상도를 권장합니다. 필요한 경우, 대비 및 밝기 조절, 노이즈 필터링, 광퇴색(photo bleaching) 및 기타 일반적인 이미지 처리 조정을 수행하십시오.이미지 조작 표준에 따르면, 대부분의 과학 연구에서는 스택 내의 모든 이미지와 서로 다른 시점의 모든 이미지에 동일한 보정 사항을 적용하는 것이 적절합니다. 특정 조정으로 인한 결과는 모든 이미지에 대해 평가되어야 합니다. 다양한 필터링 및 이미지 향상 기법을 실험해 보십시오.예를 들어, 렐로스(lelos)와 필터링은 배경 대비 작은 구조물의 대비를 높이는 데 유용합니다. 러닝 윈도우(running window) 중심에 있는 픽셀의 밝기는 향상되는 반면, 주변 영역의 밝기는 감소합니다. 일부 필터링 방법은 함께 사용했을 때 효과가 떨어질 수 있음에 유의하십시오.시간 경과에 따라 표본의 상당한 움직임이 있는 경우 드리프트 보정(drift correction)을 적용하십시오. 이러한 움직임은 활동 전위와 시냅스 전위를 억제하는 약물을 추가하더라도 살아있는 근육에서 흔히 발생합니다. 픽셀 등록 알고리즘(pixel registration algorithm)을 사용하면 타임랩스 이미지를 정렬하여 이러한 움직임을 줄일 수 있으나, 대개 완전히 제거하지는 못합니다.본 연구에서는 뱀의 신경근 접합부 말단을 4D 생체 영상화하여, 거대 엔도좀(macro endosomes) 또는 me가 세포막 쪽으로 이동하며 빠르게 사라지는지 확인하였으며, 이는 일부가 세포외 배출(exocytosis)을 통해 소실됨으로써 그 수가 감소함을 시사합니다. 데이터는 60초의 프레임 간격으로 6개 시점의 3D 볼륨 뷰로 표시되었습니다. 단일 버튼(buton)의 Z축 깊이를 보여주기 위해, 빨간색 점선으로 표시된 Y축에서 멀어지며 이동하는 me를 여러 프레임에 걸쳐 관찰할 수 있으며, 이는 5번째와 6번째 시점 사이에 사라집니다. 소실에 소요되는 시간이 프레임 간격보다 짧다는 점은 소실 직전에 세포외 배출이 일어났다는 것과 일치합니다.ME는 바톤(baton)의 세포막에 위치한 것으로 보입니다. 동일한 원시 데이터 세트가 다음으로 더 낮은 배율의 동영상으로 제시됩니다. Y축을 중심으로 24단계의 3D 회전을 수행할 때마다 각 단계의 시작 부분에서 시퀀스가 잠시 일시 정지되며, 이는 빨간색 화살표로 표시된 곧 사라질 ME에 주의를 기울이기 위함입니다.ME가 버튼의 가장자리에 접근하면 사라지며, 모든 관찰 관점에서 다시 나타나지 않는다는 점에 유의하십시오. XY 해상도에 비해 Z축 해상도가 낮기 때문에, 관찰 관점에 따라 ME의 모양이 길어지거나 짧아지는 것처럼 보입니다. 전자 현미경 연구에 따르면 운동 신경 말단의 엔도솜은 빛의 회절 한계에 가까울 정도로 크기가 작습니다.따라서, 이러한 엔도솜의 융합은 광학 수준에서 단순한 공간적 근접성과 절대적으로 구분될 수 없습니다. 본 연구에서 Mees는 녹색으로 표시된 FM 1 43으로 라벨링하였고, 산성 엔도솜(AEs)은 리소좀 활성 염료로 라벨링하여 적색으로 표시하였습니다. 4D 동영상의 한 시점에서 얻은 데이터를 세 가지 방향의 3D 볼륨 뷰로 나타내었습니다.상단 패널 1~3은 XY 평면 위에서 내려다본 일반적인 시점을 보여줍니다. 중간 패널 4~6은 XY 평면에 수직이며 커다란 빨간색 화살표 방향으로 바라본 시점을 보여줍니다. 하단 패널 7~9는 위 두 시점 모두에 수직이며 커다란 파란색 화살표 방향으로 바라본 시점을 보여줍니다.녹색 화살표는 하나의 me를, 빨간색 화살표는 두 개의 AE를 나타냅니다. 두 가지 색상 모두에서 형광을 발하여 노란색으로 나타나는 구조가 네 개의 D 이미지 기록에서 간혹 관찰되었습니다. 이 예시에서, 두 가지 염료를 모두 포함하고 있는 엔도좀은 패널 3, 6, 9에서 노란색 화살표로 표시되어 있습니다.세 개의 직교 투영 모두에서 빨간색과 초록색의 중첩이 동일하게 완전하게 나타나며, 이는 추정되는 융합 em me ae를 나타냅니다. 이 영상은 동일한 데이터 세트가 초당 한 프레임의 속도로 Y축을 중심으로 회전하도록 설정된 모습을 보여줍니다. 추정되는 융합 MEAE는 모든 관점에서 노란색으로 유지됩니다.디지털 디콘볼루션(Digital deconvolution)은 3D 및 4D 이미지의 해상도를 높이는 유용한 도구입니다. 여기에서는 원본 데이터와 디콘볼루션 처리된 데이터의 비교를 보여줍니다. 이는 FM 1 43으로 자극 중에 염색된 전형적인 뱀의 신경 말단 사례입니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 30분에서 60분 내에 완료할 수 있습니다.이 절차 이후에, 거대 엔도솜과 시냅스 전 마커의 공국소화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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연구

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신경과학

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