Name: 네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 학습하세요 뱀 근육을 이용한 4차원 형광 이미징으로 신경 말단의 엔도좀 역학을 시각화하는 방법을. 이 기술은 시냅스 기능 연구에 필수적인 생세포 내 소포 운동을 실시간 관찰합니다.

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이 작품은 건강 그랜트 NS-024572 (RSW에)의 미국 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. Supravital 염료와 준비 얼룩 <ol><li> 가터 뱀 해부 프로토콜의 스튜어트 등. 5를보고 탱 등. 6 파충류 조직은 긴 시간에 대한 생리 학적 남아 있고, 적은 세균 오염과, (아래 참조) 낮은 온도로 유지합니다. 포유 동물 조직은 일반적으로 실온 또는 그 이상으로 유지된다. </li><li> 리소좀 중요한 염료의 염색을 위해, 차가운 파충류 링거 용액 1:5,000 (0.2 μM)에 염료를 용해. 15 분 동안 4 ° C에서 알을 품다. 차가운 링거 여러 번 씻는다. 가능한 한 빨리 이미지. </li><li> 의 KCl 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 고의 KCl 링거 1:500 (7 μM)에 염료를 희석. 30 ~ 60 초에 최대 4 ° C에서 알을 품다. ~ 1 분 / 린스, 차가운 링거 빠르게 세 번 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지. </li><li> 고장 성 (자당) 자극을 사용하여 FM1 -​​ 43 염색의 경우, 상기와 0.5 M의 자당 링거의 염료를 희석. 4 &amp; #을 품다176, 2-5 분 동안 C. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지. </li><li> FM1 - 43 염색에 대한 전기 자극을 통해, 탱 등. 6 간단히 참조, 준비는 생리 식염수와 염료를 포함하는 요리를 배치됩니다. 신경은 200 마이크로 초 직사각형 펄스 (~ 12 V, 30 Hz에서, 18 마이크로 초)의 사전 프로그래밍 된 기차로 자극된다. 차가운 링거와 함께 위의 단계 1.3로 씻으십시오. 가능한 한 빨리 이미지. </li></ol> 2. 이미징을위한 준비를 구성 <ol><li> 그 구조는 현미경 대물에 최대한 가깝게되도록 준비 배향. </li><li> 도립 현미경을 사용하는 경우, 그 하부 라운드 얇은 커버 슬립을 포함하는 챔버를 이용한다. 전형적으로, 촬상 챔버는 중앙에 25mm 직경 중 1 두께 유리 커버 슬립으로 얇은 스텐레스 바닥을 가져야한다. 직립 현미경을 사용하는 경우, 하부 커버 슬립은 필수이지만 유용되지전송 된 빛으로 영상을 허용 (예를 들어 미분 간섭 대비, DIC)는 시편의 방향과 관심의 개체를 찾을 수 있습니다. </li><li> 가장 높은 3D 해상도를 얻기 위해 적절한 목표를 선택합니다. 장단점이 개구 렌즈 (NA), 작동 거리, 확대 및 유형 가운데있다 (건조, 물과 기름 침지). 조직 문화와 같은 얇은 준비를 위해, 석유 목표는 최고입니다. 직립 현미경을 사용하여, 수계 욕 커버 슬립을 띄워 커버 슬립의 상단과 대물 간의 침지 오일을 사용한다. </li><li> 디콘 볼 루션 소프트웨어가 사용되는 경우, 판매자는 특정 목적의 소정의 점 분포 함수 (PSFS)을 제공 할 수 있습니다. 이러한 정보가 제공되지 않거나 지원되지 않는 목적을 선택하면, 형광 마이크로 도트 또는 유사한 회절 한정 개체 7,8 촬상하여 PSF를 결정하는 경우. </li></ol> 3. 원하는 필드의 깊이와 이마의 번호를 설정시간 경과 프레임 당 원하는 GES <ol><li> 필드의 전체 깊이를 선택하는 것이 너무 이동하거나 그 구조가 사라지거나 그들이 Z-방향으로 이동 초점이 이동하지 않는 상호 작용. Z 필드는 약간 군데 중의 셀 또는 셀 공정의 수직 치수를 초과해야한다. 척추 모터 단자의 경우, 15 ~ 20 μm의는 일반적입니다. </li><li> 포커스의 각 증가에 필요한 Z-축 단계를 계산한다. Z-축을 따르는 해상도의 목적 특성에 따라 변화한다; 이것은 XY 플레인의 해상도의 약 네번째이다. 공 촛점 이미징 또는 컨볼 루션 소프트웨어 중 하나를 사용하는 경우, Z-축 해상도가 향상된다. z 방향 5 의도적으로 오버 샘플링에 의해 최종 해상도를 향상뿐만 아니라, 아래 3.3 단계를 참조하십시오. 전형적인 스텝 간격은 40-100X 목적의 400-1,500 nm 내지 범위이다. 빛은 각각의 Z-단계의 이미지에 사이 문을 닫았해야합니다. </li><li> Z-스택 당 이미지 수를 선택, 즉 필드의 원하는 깊이는 분할스텝 간격으로. 일반적인 Z-스택을 완료하는 시간은 1-10 초이다. 각각의 이미지 비행기가 약간 다른 시점에 해당하기 때문에 빠른 속도로 움직이는 물체 (100 ㎚ / 초) 3D 이미지 스택에서 흐리게 나타날 수 있습니다. 또한, 각각의 추가 이미지는 광표백 가능한 광독성 (토론 참조)에 기여한다. 어느 상황이 속하는 경우, 스택 당 적은 수의 이미지를 수집하는 더 큰 Z-단계를 선택합니다. 이미지 보간 소프트웨어 (아래 단계 6.3)를 사용하여 나중에 보정합니다. </li></ol> 4. 시간 경과 프레임 속도를 선택합니다 부드럽게 같은 움직임, 상호 작용 또는 융합 이벤트를 9로 시간 변화를 해결하기 위해 단지 충분 속도를 실험에 의해 선택합니다. 오버 샘플링이 불필요하게 빛에 대한 노출이 증가하면서 샘플링에서 모션 아티팩트 (표본 오차)를 생성 할 수 있습니다. 하나의 긴 시퀀스 나 같은 준비, 상대적으로 작은 총 시간 간격으로 각 (에서 몇 가지 반복되는 시퀀스 중 하나를 수집 <eM&gt; 예를 들어 10 시간의 점 X 30 초 간격 = 5 분). 가능하면, 전체 제제의 드리프트를 포함하여, 대략 추정 동작 속도로 연속적인 표면 형광 조명 제제를 본 경우에. 5. 특정 준비를 위해 모든 라이브 영상을 완료 파충류 준비는 일반적으로 냉각 긴 경우, ~ ~ 2 시간 동안 강력한 남아있다. 6. 원하는 용도에 따라 데이터 분석 <ol><li> 모든 원시 데이터 파일을 유지합니다. 디지털 저장은 일반적으로 문제가되지 않지만, 처리 시간도 빠른 개인용 컴퓨터 나 워크 스테이션과 함께 중요하다. 이러한 이유로,이자 [투자 수익 (ROI)]의 영역에 자르기 이미지. 관심의 전체 영역이 전체 시간의 과정 동안 자른 창에 있음을 확신합니다. </li><li> Deconvolve 콘텐츠 적절한 소프트웨어 및 정확한 점 분포 함수를 사용하여 스택. 그 해상도가 향상 확인하고 아무 유물에 의해 생성되지 않았디컨 볼 루션 알고리즘. 그림 3은 예를 들어 이미지를 보여줍니다. </li><li> z 축 명백한 해상도를 확장 보간 알고리즘을 사용합니다. 명백한 0.25 μm의 분리에 실제 1.5 μm의 이미지 평면 분리에서 배의 확장을 제안한다. 또한, 오버 샘플링의 조합 (단계 3.2) 및 보간을 사용합니다. </li><li> 원하는 경우, 콘트라스트, 밝기, 노이즈 필터링, 광표백 유용한 일반적인 화상 처리의 조정을 수행한다. 이미지 처리 표준은 대부분의 과학적인 작업을 위해, 그것은 동일한 수정을 스택 내의 서로 다른 시점에서 모두, 모든 화상에 적용되는 것이 적절하다는 것을 지시. 특정 조정의 결과는 모든 이미지 9 사이에서 평가되어야한다. </li><li> 데이터의 수출을 위해 특정 표시 모드를 선택합니다. 가장 간단한 디스플레이는 녹색 - 빨강 또는 빨강 - 파랑 입체 사진 (그림 3의 예), 스테레오 쌍, 또는 교대를 사용하여 스테레오 영상입니다 맞 왼쪽 /T 눈은 셔터 안경 프레임. 입체 사진은 단일 색상으로 제한됩니다. Z 축 시각적 해상도를 향상시키기 위해 필요한 경우 겉보기 화상 농도를 향상시킨다. </li><li> 다양한 필터링 및 이미지 향상 기술을 실험. 예를 들어, 라플라스 필터링을 배경 위의 작은 구조의 대비를 증가하는 데 유용합니다. 주변 영역의 밝기가 감소하는 동안 실행되는 윈도우의 중심 화소의 밝기가 향상된다. 몇 가지 필터링 방법은 조합에서 잘 작동하지 않습니다. </li><li> 시간에 따른 제제의 상당한 움직임이있을 경우, 드리프트 보정을 적용한다. 이러한 운동은 약이 활동 전위와 시냅스 전위를 억제하기 위해 추가 심지어, 근육을 생활에 일반적입니다. 픽셀 등록 알고리즘 (예. IMARIS, 어도비 애프터 이펙 츠, ImageJ에 대한 TurboReg 플러그인) 시간 경과 이미지를 정렬 줄일 수 있지만, 일반적으로 완전히 같은 동작을 제거하지. </li></ol>

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<li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

4D 영상의 가장 중요한 측면은 노광의 지속 시간 및 강도의 관리이다. 광표백은 화상 신호 대 잡음비를 감소 및 형광체의 선택을 포함하는 다양한 요인에 따라 문제 여부 일 수있다. 생체 조직 (광독성)에 비특이적 손상 photobleaching에 관련되어, 때로는 목적 2,12 나 미분 간섭 대비 (DIC)로서 적합한 시야 광학계와 형태의 시험에 의해 설계 형광 프로브를 이용하여 식별 될 수있다. 확실히 광표백 및 광독성과 관련된 이들의 크기 이하 가벼운 수준에서 발생 생리적 효과를 유도하는 것도 가능하다. 예를 들어, 다 제제를 사용하는 초기 실험에서, 각 자극 후 다른 시간에 고정 MES 간단한 자극 후 시간에 따라 소실되는 속도는 6을 측정 하였다. 표준 연습 T는로그들이 볼 때까지 O 퇴색 최소화, 준비는 어둠 속에서 유지되었다. 유사한 실험 4D 라이브 영상을 사용하여 수행되었을 때, 많은 MES 실험 (~ 20 ~ 60 분)에...

조직 생활의 시간 경과 영상은 시간의 한 지점에서 이미지가 고정 또는 생활 준비에 알 수없는 동적 구조 - 기능 관계에 대한 시각에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 종종 시간 정보에 액세스하기위한 트레이드 오프는 광학 해상도의 감소이다. 높은 수치 조리개 기름 침지 목표는 유일한 대안으로 침수 또는 건조 목적을두고 있기 때문에 초점이 자신의 좁은 범위의 조직 생활에 실용적이다. 또한, 공 초점 광학에 의해 제공 증가 된 해상도는 조명의 상대적으로 높은 수준의 1,2 필요한에서 광독성 환경에 따라 약간의 생활 준비에 활용 될 수 없습니다. 여러 실시간 또는 시간 경과 광학 기술이 제공하는 향상된 해상도를 사용할 수있는 동안 마지막으로, 자신의 적용은 그 구조가 목표 1의 몇 백 나노 미터 내에 위치 할 수있는 준비로 제한됩니다. 기재된 방법상대적으로 저가의 장비를 사용한다 다목적, 아직 더 일반적으로 사용되는 시간 경과 기술에 비해 향상된 해상도를 제공합니다. 그것은 개인의 실험실뿐만 아니라 영상 시설에서 사용하기위한 것입니다. 방법은 민감한 디지털 카메라로 급속 약간 다른 초점 평면 (Z-스택)에서의 이미지 세트를 획득하기 위해 설계된 하드웨어와 함께, 종래의 표면 형광 현미경을 이용한다. 각각의 Z-스택은 디지털 해상도를 증가 deconvolved된다. 3D 시간 경과 (4D) 영상의 하나의 기능은 세포 기관 또는 다른 구조물을 이동의 정확한 추적합니다. 제대로 설정하면, 몇 군데 구조는 초점이 이동하지 않고, 세 방향으로의 움직임을 관찰하고 정량화 할 수있다. 스테인드 구조는 단지 좁은 초점 평면 위 또는 아래에 표류하여 하나 이상의 시간 경과 프레임에 사라에 따라서는 불가능하다. 방법은 또한 상호 작용 가능한 푸을 평가하기위한 중요한 툴로서 기능작은 구조의 시온. 기존의 표면 형광 또는 회절 한계 (수백 nm의)에 가까운 구조의 공 촛점 이미지가 병합 된 이미지는 각각의 라벨 3의 중복을 보이고도 융합을 확인하지 않습니다. 융합 제안하지만 개체 회절 한계 이하의 거리에 의해 수평 또는 수직으로 분리되어 남아있을 수있다. 3-4 차원 화상은, 대조적으로, 세 개의 직교하는 방향의 각각에 오브젝트를 볼 수있게. 모두 세 가지보기에서 융합의 모양은 확실성 수준을 증가시킨다. 그리고, 약간의 생활 준비에, 감독 또는 둘 모두 라벨이 시간에 함께 이동할 때 상상 속으로 융합 개체의 브라운 운동은 더 증거를 제공한다. 물론 때 회절 한계 근처에서 배경 엄선한 구조의 확실성 또는 그들이이 염료 (융합)가 포함되어 있음을 보여주는 수준은 절대 아니다. 만약 예컨대 형광 공명 에너지 전달 (FRET)와 같은 적용, 특수 기술4, 더 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGC5</td><td>Biotium, Hayward, CA</td><td>70057</td><td>최종 농도: 10 mM</td></tr><tr><td>FM1-43FX</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>F35335</td><td>최종 농도: 7 mM</td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>L7528</td><td>최종 농도: 0.2 mM</td></tr><tr><td>파충류 Ringers pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>: 145 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td>, <td>2.5 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td> <td>1.0 mM</td></tr><tr><td>Hepes,</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>높은 KCl 파충류 링거 pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>86 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>60 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8 mM</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Dibasic)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td>5.0mM</td></tr><tr><td>고당류 링거 pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>145mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>2.5mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>3.6mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td>1.8mM</td></tr><tr><td>KH2PO4(이염성)</td><td></td><td></td><td>1.0 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>5.0 mM</td></tr><tr><td>설탕</td><td></td><td></td><td>0.5 M (17.1 g / 50 ml)</td></tr> <tr><td>Axioplan 200 도립 현미경</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href = http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com< / a ></td></tr> <tr><td>N-Achroplan 63X 물 목표; na = 0.9; 작동 거리=2.4 mm&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr><tr><td>DG4 조합 광원/여기 필터 휠 스위처</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>175W 크세논 아크 램프</td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Lambda 10-2&nbsp; 방출 필터 휠 스위처</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td></td><td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td></tr><tr><td>Sensicam CCD 카메라</td><td>Cooke Instruments, Tonawanda, NY</td><td></td><<td>a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td></tr><tr><td>Cascade 512 CCD 카메라</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td></td><<td>a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td></tr><tr><td>이미징 접시 - 사내에서 제작 - 직경 11cm; 직경 25mm #1 커버슬립 내장형; 마그네틱 핀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, CO</td><td>Deconvolution; 드리프트 보정; 3D 및 4D 데이터 프리젠 테이션</td> <td><a href = "http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td></tr><tr><td>IMARIS 7.5.2</td><td>Bitplane, South Windsor, CT</td><td>드리프트 보정; 3D 및 4D 데이터 프리젠 테이션</td> <td><a href = "http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com< / a></td></tr><tr><td>AfterEffects CS6</td><td>Adobe, San Jose, CA</td><td>드리프트 보정</td><td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td></tr><tr><td>ImageJ 1.46</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td>여러 플러그인 사용 가능; 스테레오 페어 구성</td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>LSM Carl Zeiss, Thornwood, NY</td><td>스테레오 페어 구성</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td></tr></tbody></table>

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

가터 뱀의 근육을 abdominis 사차원 (4D) 빛의 영상은 얇은 transversus의 모터 신경 터미널에서 작은 구조의 행동을 연구하는 데 사용되었습니다. 원시 데이터는 3D의 Z-스택의 시간 경과 시퀀스를 포함한다. 각 스택은 400-1,500 nm의로 구분 초점 평면에서 표면 형광 광학으로 획득 한 4-20 이미지가 포함되어 있습니다. 이러한 포커스의 조정 등의 화상 스택의 입수 단계는, 여기 파장의 스위칭, 및 디지털 카메라의 동작은, 화상 비율을 최대화하고, 노광에서의 조직 손상을 최소화하기 위해 가능한 한 자동화된다. 인수 후, 이미지 스택의 세트가 공간 해상도를 향상시킬 수 deconvolved되어, 원하는 3D 형식으로 변환하고, 4D &quot;영화&quot;그 노력 실험 데이터에 따라, 컴퓨터 기반 분석의 다양한 적합을 만드는 데 사용됩니다. 하나의 응용 프로그램은 신경 터미널 - macroendosomes에서 발견 엔도 좀의 두 클래스 (MES)의 동적 거동의 연구이다및 (AES) - 누구의 크기 (두 가지 유형 200 ~ 800 nm의) 산성 엔도 좀은 회절 한계에 또는 근처에 있습니다. 각 시점에서의 3D 정보에 대한 액세스는 종래의 시간 경과 이미징에 비해 여러 장점을 제공한다. 특히, 크기 및 구조의 이동 속도는 날카로운 초점의 손실없이 시간을 통해 정량화 할 수있다. 4D 촬상 데이터의 예로는 그들이 exocytosed보다는 단순히 수직 거리에 초점이 하나의 평면에서 이동하는 것을 제안, MES는 원형질막 접근 사라지는 것으로 나타났다. 또한 각 3 직교 전망에서 볼 때 두 염료를 포함하는 구조에 대한 중복 시각화하여 MES 및 AES의 추정 융합입니다 밝혔다.

표시 데이터 (그림 3에서 낮은 고배율 뷰를 볼 수 있으며, 세포 내 이입 염료 (FM1-43) 흡수는 각 부통을 채우는 안개를 만듭니다) 뱀 신경 근육 터미널에서이고, 특히, macroendosomes (MES) 및 산성 엔도 좀 (AES) 이 터미널 5 이내. MES는 신경 활동 10시 대량 엔도 시토 시스에 의해 만들어지고 활동이 6을 중단 한 후 자신의 수는 시간이 기하 급수적으로 감소된다. 4D 라이브 영상의 사용은 그들 중 일부는 exocytose 때문에 그들의 숫자가 감소한다는 것을 제안, MES는 세포막으로 이동하는 경우를 확인하고 신속하게 사라했다. 그러한 모든 행은 하나의 시점에서 본 (및 전과) 완전히 옆 시점 간 (및 그 이후)되었습니다. 따라서 소멸에 요하는 시간은 우리의 프레임 간격 (30 초만큼 짧게) 및 세포 외 유출에 부합 미만이었다. 4D 데이터가 지원하지 않는 다른 이론은, MES 천천히 V의 신진 통해 ...

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 3차원 공간에서의 시간 경과에 따른 엔도솜을, 즉 4차원으로 정확하게 이미징하는 것입니다. 이를 위해 먼저 뱀의 근육을 절개하여 이미징 디쉬에 조직을 배치합니다. 두 번째 단계는 생체 염색약을 사용하여 조직을 염색함으로써 엔도솜 형성을 자극하는 것입니다.다음으로, 하나 이상의 신경근 접합부에 대해 4차원 이미징을 수행합니다. 마지막 단계는 거대 엔도좀의 거동을 특성화하기 위한 정밀한 데이터 분석입니다. 결과적으로, 시냅스 전 공간 내에서 시간에 따른 엔도좀의 존재와 이동을 4차원 형광 이미징을 통해 입증할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 뱀의 복근이 단일 섬유 두께라는 점이며, 이를 통해 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 고품질의 이미지를 생성할 수 있다는 것입니다. 본 프로토콜에서는 가터뱀의 조직 준비물을 사용합니다. 파충류 조직은 낮은 온도로 유지하여 생리학적 상태를 더 오래 유지하고 박테리아 오염을 줄여야 합니다. 리소좀 생체 염색을 위해, 염료를 차가운 파충류 링거 용액에 1:5,000 비율로 용해합니다.최종 농도가 0.2 µM이 되도록 염료를 조직에 첨가하고 4 °C에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후, 모든 FM 1-43 염색 과정에서 냉각된 링거액으로 조직을 여러 번 세척합니다. 염색 전, 자석 핀이 있는 이미징 디쉬에 샘플을 미리 마운트합니다.본 영상에서는 염화칼륨 자극을 이용한 FM 1 43 염색법만을 시연합니다. 고농도 염화칼륨 링거액으로 1:500 희석하여 최종 농도가 7 µM이 되도록 조제한 염료를 조직에 첨가한 후, 조직을 4 °C에서 최대 30~60초 동안 배양합니다. 이어서 차가운 링거액으로 회당 약 1분씩 빠르게 3회 세척합니다.모든 조직은 염색 및 차가운 링거액(ringer solution)으로 세척한 후 가능한 한 빨리 이미징해야 합니다. 도립 현미경을 사용하는 경우, 바닥에 얇고 둥근 커버 슬립이 포함된 이미징 챔버를 사용하십시오. 일반적으로 이미징 챔버는 직경 25 millimeter의 얇은 스테인리스 스틸 바닥을 가져야 합니다.이미징 준비를 위해 1번 두께의 유리 커버슬립을 중앙에 배치합니다. 자석 핀을 사용하여 근육이 이미징 디쉬 내에 최대한 중앙에 위치하고 가능한 한 평평하게 놓이도록 조정합니다. 준비된 시료를 소량의 링거액(ringer solution)으로 덮습니다.디쉬를 스테이지 중앙에 최대한 가깝게 배치하여 고정합니다. 가능한

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은의 라이브 절개를...

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

출처: Boyer, N. P. et. al., 절제된 마우스 경골 신경에서 신경필라멘트 수송의 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2020)  이 비디오는 분석을 위한 형광 광활성화 방법을 보여줍니다. 말초 신경의 수초화된 축삭돌기에서 neurofilament 수송. 광활성화 녹색 형광단이 부착된 신경필라멘트를 추적함으로써 이 기술은 신경퇴행성 질환의 축삭 수송에 대한 통찰력을 제공합니다.

Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons(수초화된 마우스 축삭돌기에서 신경필라멘트 수송의 형광 광활성화 이미징) 

출처: Zhilyakov, N. V. et. al., 공초점 현미경을 사용한 높은 시간 해상도의 마우스 신경근 접합부에서 칼슘 과도 상태 등록. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 신경 말단에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 이미징 기술을 보여줍니다. 신경을 자극하고 칼슘 결합 염료의 형광 변화를 포착함으로써 신경 말단의 동적 칼슘 유입 및 제거를 시각화하여 시냅스 활동 및 신경근 신호 전달에 대한 정확한 통찰력을 제공합니다.

공초점 현미경을 사용한 마우스 신경 말단의 빠른 칼슘 과도 현상 이미징

동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

이 논문은 synaptobrevin2-pHluorin 구조체 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 신경모세포종 세포의 신경전달물질 소포 역학을 조사하는 방법을 제공합니다. 이미지 처리 및 데이터 분석을 위해 개발된 전략도 보고됩니다.

TIRFM과 pH 민감성 GFP - 프로브는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 신경 전달 물질 소포 역학을 평가하기 : 세포 이미징 및 데이터 분석

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.

효모의 4D 현미경 검사법

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

학습하세요 뱀 근육을 이용한 4차원 형광 이미징으로 신경 말단의 엔도좀 역학을 시각화하는 방법을. 이 기술은 시냅스 기능 연구에 필수적인 생세포 내 소포 운동을 실시간 관찰합니다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

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