네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 또는 4차원에서 3차원 공간에서 엔도솜을 정확하게 이미지화하는 것입니다. 이것은 먼저 뱀 근육을 절개하고 이미징 접시에 조직을 배열하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 엔도솜 형성을 자극하기 위해 활성 염료로 조직을 염색하는 것입니다.

다음으로, 제제는 하나 이상의 신경근 접합부에 대해 4차원으로 이미지화됩니다. 마지막 단계는 거대 엔도솜의 거동을 특성화하기 위한 신중한 데이터 분석입니다. 궁극적으로, 시냅스전 공간 내에서 시간이 지남에 따라 엔도솜의 존재와 움직임은 4차원 형광 이미징으로 입증될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 뱀 복부 근육이 단일 섬유 두께에 불과하여 표준 에피 형광 현미경 검사를 사용하여 고품질 이미지를 생성할 수 있다는 것입니다. 가터뱀의 조직 제제가 이 프로토콜에 사용됩니다. 파충류 조직은 낮은 온도에서 보관해야 하므로 더 오랜 시간 동안 생리적으로 유지되고 박테리아 오염이 적습니다. 리소좀 생명 염료 염색을 위해, 염료는 찬 파충류 ringers 해결책에서 1개에서 5, 000 녹습니다.

0.2 마이크로몰의 최종 농도를 얻으려면 염료를 조직에 첨가하고 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 모든 FM 1 43 염색을 위해 콜드 링거로 조직을 여러 번 씻습니다. 염색하기 전에 마그네틱 핀이 있는 이미징 접시에 샘플을 미리 장착합니다.

이 비디오의 목적을 위해 염화칼륨 자극을 사용한 FM 1 43 염색만 시연합니다. 7 마이크로 몰의 최종 농도를 얻기 위해 고 염화칼륨 링거에 1-500으로 희석 한 염료를 조직에 첨가 한 다음 조직을 섭씨 4도에서 최대 30-60 초 동안 배양합니다. 그 후, 헹굼 당 약 1 분 동안 차가운 벨소리로 3 번 빠르게 씻으십시오.

모든 조직은 염색하고 콜드 링거 용액으로 세척한 후 가능한 한 빨리 이미지를 촬영해야 합니다. 도립 현미경을 사용하는 경우 바닥에 얇은 원형 커버 슬립이 있는 이미징 챔버를 사용하십시오. 일반적으로 이미징 챔버의 바닥은 직경이 25mm인 얇은 스테인리스강이어야 합니다.

이미징 준비를 구성하기 위해 중앙에 있는 최고의 두께 유리 커버 슬립. 근육이 이미징 접시 내에서 가능한 한 가장 중앙에 있고 가능한 한 평평하게 놓이도록 자기 핀을 사용하여 방향을 잡습니다. 소량의 링거 용액으로 준비물을 덮으십시오.

접시를 장착하여 무대 중앙에 최대한 가깝게 놓습니다. 가능한 최고의 3D 해상도를 얻기 위해 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 이 데모의 모든 실험에는 63 x 물 대물렌즈가 사용됩니다.

이 절차를 시작하려면 슬라이드 북 5.0에서 이미징 창을 엽니다. 여기 탭에 여러 메뉴가 포함되어 있습니다. 두 번째 탭 Z를 사용하여 63 x 물 목표를 선택합니다. Z 스택 간격을 설정합니다.

이 예에서는 1.5미크론의 Z 단계가 라이브 이미징에 사용됩니다. 타임랩스 프레임 속도를 선택합니다. 최적 속도는 이동 상호 작용 또는 융합 이벤트와 같은 시간에 따른 변화를 원활하게 해결하기에 적합한 속도입니다.

예를 들어, 총 5분 동안 32번째 간격으로 10개의 시간 지점이 있습니다. 다음으로, 관심 초점의 맨 위에 수동으로 초점을 맞춘 터미널을 표시하는 동안 총 피사계 심도를 선택한 다음 약간 위로 이동합니다. 셋탑을 선택합니다.

모든 것이 초점에서 벗어날 때까지 샘플을 통해 천천히 초점을 맞춥니다. 다시 말하지만, 표시되는 비행기 수와 총 이동 값은 캡처 창에서 선택한 피사계 심도를 나타냅니다. 사용된 상단 및 하단 위치 라디오 버튼을 선택하여 방금 선택한 매개변수를 전송합니다.이미지 캡처를 위해 이미지 획득을 시작합니다.

특정 준비에 대한 모든 라이브 이미징을 완료합니다. 모든 원시 데이터 파일을 유지하는 동안 디지털 스토리지는 일반적으로 문제가 되지 않습니다. 처리 시간은 속도가 빠른 개인용 컴퓨터나 워크스테이션에서도 중요합니다.

이러한 이유로 관심 영역으로 이미지를 자르면 전체 관심 영역이 전체 시간 동안 잘린 창에 있는지 확인할 수 있습니다. 과정 D는 적절한 소프트웨어와 올바른 포인트 스프레드 기능을 사용하여 이미지 스택을 포함하고, 해상도가 향상되었으며, 디콘볼루션 알고리즘에 의해 아티팩트가 생성되지 않았는지 확인할 수 있습니다. 보간 알고리즘을 사용하여 Z축을 확장합니다.

겉보기 해상도, 실제 1.5 미크론 이미지 평면 분리에서 겉보기 0.25 미크론 분리로 6배 확장이 제안됩니다. 대비 밝기, 노이즈 필터링, 사진 표백 및 기타 일반적인 이미지 처리 조정을 수행합니다. 원하는 경우.

이미지 조작 표준은 대부분의 과학 작업의 경우 스택 내와 다른 시점의 모든 이미지에 동일한 보정을 적용하는 것이 적절하다고 규정합니다. 특정 조정의 결과는 모든 이미지에서 평가되어야 합니다. 다양한 필터링 및 이미지 향상 기법을 실험해 보십시오.

예를 들어, lelos와 필터링은 배경 위에 있는 작은 구조체의 대비를 높이는 데 유용합니다. 실행 중인 창의 중앙에 있는 픽셀의 밝기는 향상되는 반면 주변 영역의 밝기는 감소합니다. 일부 필터링 방법은 조합하여 제대로 작동하지 않습니다.

시간이 지남에 따라 준비물의 상당한 움직임이 있는 경우 드리프트 보정을 적용합니다. 이러한 움직임은 활동 전위와 시냅스 전위를 억제하기 위해 약물을 첨가하더라도 살아있는 근육에서 일반적입니다. 픽셀 등록 알고리즘은 타임랩스 이미지를 정렬하고 줄일 수 있지만 일반적으로 이러한 움직임을 완전히 제거하지는 않습니다.

이 연구에서는 뱀 신경근 말단에 대한 4개의 D 라이브 이미징을 사용하여 거대 엔도솜 또는 내가 원형질막을 향해 이동하고 빠르게 사라지는지 확인했으며, 그 중 일부가 세포에 접근하기 때문에 그 수가 감소하는 것을 시사했습니다. 데이터는 60초의 프레임 간격으로 6개의 시점에서 3D 볼륨 보기로 표시됩니다. 단일 부톤의 Z 깊이를 설명하기 위해, 5번과 6번 시점 사이에서 사라지기 전에 여러 프레임에 걸쳐 빨간색 점선으로 표시된 Y축에서 me가 멀어지는 것을 관찰할 수 있으며, 소멸에 필요한 시간이 프레임 간격보다 짧다는 것은 소멸 직전의 엑소사이토시스와 일치합니다.

ME는 배턴(batons) 원형질막에 위치한 것으로 보인다. 동일한 원시 데이터 세트가 더 낮은 배율의 영화로 다음에 표시됩니다. 시퀀스는 Y축을 중심으로 한 24개의 3D 회전 단계가 시작될 때마다 잠시 멈춰 곧 사라질 나에게 주의를 환기시키며, 이는 빨간색 화살표로 표시됩니다.

ME가 보이고, 부톤의 가장자리에 접근하면 사라지고, 모든 보기 투시에서 돌아오지 않습니다. XY 해상도에 비해 Z축 해상도가 낮기 때문에 ME의 모양은 보는 관점에 따라 길어지거나 짧아지는 것처럼 보입니다. 전자 현미경 연구에 따르면 모터 말단의 엔도솜은 빛의 회절 한계 근처에서 크기가 작다는 것을 보여주었습니다.

따라서 이러한 엔도솜의 융합은 가벼운 수준에서의 밀접한 공간 연관과 절대적으로 구별될 수 없습니다. 이 연구에서 Mees는 녹색으로 표시된 FM 1 43으로 표시되었으며 산성 엔도솜 또는 AE는 리소좀으로 표시되었습니다. 4D 영화의 한 시점에서 빨간색으로 표시된 바이탈 염료는 3 방향의 3D 볼륨 뷰로 표시됩니다.

상단 패널 1부터 3까지는 XY 평면 위에서 본 일반적인 뷰를 보여줍니다. 4번에서 6번까지의 중간 패널은 XY 평면에 수직이고 큰 빨간색 화살표 방향의 뷰를 보여줍니다. 아래쪽 패널 7에서 9까지는 큰 파란색 화살표 방향으로 위의 두 보기에 서로 수직인 보기를 보여줍니다.

me는 녹색 화살표로 표시되고 두 개의 AE는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 두 가지 색상으로 형광을 발하고 노란색으로 나타나는 구조는 때때로 4개의 D 이미지 레코드에서 관찰되었습니다. 이 예에서 두 염료를 모두 포함하는 엔도솜은 패널 3, 6 및 9에서 노란색 화살표로 표시됩니다.

빨간색과 녹색의 겹침은 추정 융합 em me ae를 나타내는 세 개의 직교 투영 모두에서 동일하게 완료됩니다. 이 동영상은 초당 한 프레임으로 Y축을 따라 회전하도록 구성된 동일한 데이터셋을 보여줍니다. 추정 융합 MEAE는 모든 관점에서 노란색으로 유지됩니다.

디지털 디콘볼루션은 3D 및 4D 이미지의 해상도를 향상시키는 데 유용한 도구입니다. 원시 데이터와 양도된 데이터 간의 비교가 여기에 나와 있습니다. FM 1 43으로 자극하는 동안 얼룩진 전형적인 뱀 신경 말단의 경우, 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행하면 30-60분 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차에 따라 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 다른 방법을 수행하여 시냅스전 마커가 있는 거대 엔도솜의 공동 국소화(colocalization)와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.