애벌레 Zebrafish의 척수 절개

이 절차의 전반적인 목표는 생존율을 최대화하면서, 비교적 높은 처리량과 재현 가능한 방법을 통해 제브라피쉬 치어의 척수를 완전히 절단하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 유전자형의 성체를 교배하고 필요에 따라 스크리닝함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 수정 후 5일까지 배아를 사육하는 것입니다.

다음으로, 경사형 미세주입 피펫을 사용하여 절단술을 수행합니다. 마지막으로, 부상을 입은 물고기를 실험 종료 시까지 항생제 처리된 배지에서 회복시킵니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 부상에 대한 신경 전구세포의 반응을 확인합니다.

Becker 및 fetcher 연구실에서 개척한 기존 방법들과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 연구 가능한 동물의 수가 더 많고, 회복 시간이 짧으며, 성체 제브라피시에서는 일반적으로 사용할 수 없는 유전적 도구들을 사용할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 손상에 대한 신경 전구세포의 반응과 같이 재생 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 60 millimeter 페트리 접시와 to cell guard 180 4 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하여 수술 플레이트를 제작함으로써 준비 과정을 시작하십시오.

제조사의 지침에 따라 디쉬의 절반 이하로 채운 후 중합되도록 둡니다. 그 다음 덮개를 덮어 실온에서 보관하십시오.

다음으로, 해부 현미경 하에서 미세주입 바늘을 제작할 때와 동일한 설정을 사용하여, 마이크로 피펫 풀러(micro pipette puller)로 박벽 붕규산 유리 모세관을 가열 및 인발하여 마이크로 피펫을 제작합니다. 핀셋을 사용하여 마이크로 피펫의 끝부분을 지름 약 200 microns가 되도록 부러뜨려 절단합니다. 그런 다음 마이크로 그라인더를 사용하여 부러진 단면을 처음에는 35도로, 연마 소음이 멈추면 다시 25도로 2차 베벨링(beveling) 처리합니다.

해부 현미경으로 팁이 날카롭고 매끄러운지 확인하십시오. 팁이 너무 넓으면 등쪽 대동맥을 손상시킬 가능성이 높아져 치사율이 높아지는 경향이 있습니다. 반면, 팁이 너무 좁으면 조직을 절개하지 못하고 피부에서 미끄러지는 경향이 있습니다. 적절하게 베벨 처리된 마이크로 피펫은 수술 7일 전에 소량의 점토를 넣은 페트리 접시에 보관하십시오.

수컷과 암컷 spr. Fish의 교배 수조를 준비합니다. 조명이 켜진 후 3시간이 지난 다음 날 아침에 수정란을 수집합니다. 이는 최대 수율을 확보하기 위함입니다.

혼합 유전자형을 가진 형질전환 리포터 라인을 사용하는 경우, 플레이트당 배아 100개를 넣고 28.5 °C에서 배양하십시오. 리포터 라인을 사용하는 경우, 수정 후 48시간에 배아의 형광 발현 여부를 스크리닝하십시오.

형광 배아를 28.5 °C에서 유생이 되거나 수정 후 5일이 될 때까지 성숙시킵니다. Cell guard를 E2 및 10 mg/L gentamicin sulfate와 trica로 덮어 수술 플레이트를 준비합니다. 또한, 100 mm Petri dish에 25 mL의 E2와 Gentamycin sulfate를 추가하여 회복 접시를 준비합니다.

다음 단계는 면봉 세 개를 테이프로 함께 붙여 메스 핸들을 준비하는 것입니다. 이렇게 하면 세 개의 홈이 있는 삼각형 도구가 만들어집니다. 그다음, 준비된 마이크로 피펫을 홈 중 하나에 테이프로 고정하여 면봉에 장착함으로써 메스를 완성하고, 마이크로 피펫은 필요할 때까지 옆에 둡니다.

한 번에 25마리의 유충이 담긴 플레이트 하나를 마취하며 수술을 시작합니다. trica를 사용할 경우, 유충이 더 이상 접촉 반응을 보이지 않으면 충분히 마취된 것입니다. 유충을 수술용 플레이트로 옮긴 후, 플레이트를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

최대 배율에서 유충 한 마리를 회전시켜, 메스를 잡은 손과 유충의 등이 가장 가깝게 닿도록 옆으로 눕힙니다. 핀셋이 셀 가드(cell guard) 위에 놓이도록 배치합니다. 유충의 너비에 맞춰 각도를 조절하고, 유리 메스를 핀셋의 한쪽 암(arm)에 지지시킵니다.

항문공 높이에서 유충의 등외측면을 절개합니다. 이때 척색의 복측 가장자리를 넘어서 절개하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 메스를 비틀어 척수를 절단합니다.

필요한 회전 각도는 보통 90도보다 훨씬 작습니다. 나머지 유충들을 대상으로 척수 절단술을 반복하십시오. 해당 유충 집단에 대한 수술이 완료되면, 후방 피펫과 피펫 펌프를 사용하여 손상된 개체들을 회복 플레이트로 옮기십시오.

마취 상태를 해소하기 위해, 옮기는 과정에서 유충의 머리나 꼬리를 먼저 잡도록 하십시오. 마취가 풀린 후에는 유충을 구부려 손상 부위에 자극을 주지 마십시오. 회복 플레이트에서 손상된 유충을 25 mL의 E2 및 gentamycin sulfate가 채워진 100 mm 플레이트로 플레이트당 25마리의 밀도로 옮깁니다.

그런 다음 상처가 치유되는 동안 28.5 °C 인큐베이터에 넣습니다. 플레이트를 매일 확인하여 병들거나 죽은 동물은 제거합니다.

배지 내에 담수 원생동물 coop이 보일 때까지 배지를 교체하지 마십시오. 배지를 교체할 때 물고기를 새 플레이트로 옮기지 마십시오. 대신, 가능한 한 많은 배지를 제거한 후 동일한 플레이트에 새 배지를 가득 채우십시오.

코옵스(coops) 개체수를 줄이기 위해 필요에 따라 배지 교체를 반복합니다. 치어용 가루 사료를 소량씩 매일 유생에게 공급합니다. 여기 척수가 완전히 절단된 지 1일이 경과한 제브라피시가 제시되어 있습니다.

손상 후 모든 뉴런에서 GFP가 발현되며, 노란색 화살표는 손상 부위를 나타냅니다. 여기에는 척수가 완전히 절단된 제브라피쉬의 손상 후 3일째 모습이 제시되어 있습니다. 고정된 UCD 표지 제브라피쉬의 모습에서 척수가 완전히 절단된 것을 확인할 수 있습니다.

노란색 화살표는 다시 한번 손상 부위를 나타냅니다. 이와 대조적으로, 척수의 복측 가장자리를 따라 신경세포 라벨링이 연속적으로 나타납니다. 손상 후 3일이 지난 고정된 제브라피시의 이 모습은 불완전 절단을 나타냅니다.

이 기술을 숙달하면 시간당 300마리의 유충을 처리할 수 있습니다.