Name: 마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 학습하세요 마우스에서 수력학적 유전자 전달(HGD)을 이용한 단백질의 일시적 발현 방법을. 이 기술은 염증 반응을 최소화하면서 생체 내 유전자 기능과 단백질 구조를 분석할 수 있습니다.

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우리는 처음에 우리에게 기술의 다양한 측면에서 자신의 지속적인 안내 HGD 기술과 러셀 박사 톰슨 (의학의 알버트 아인슈타인 대학)을 가르치는 시아 리우 (Regeneron 제약) 감사합니다. 이 작품은 헌터 칼리지에 의해 투자되었다, CUNY는 기금을 시작하고 NSF 빵 상 IOS-1249166. 우리는 마우스의 간에서 조직학에 대한 NYULMC 조직 병리학 코어 NYUCI 센터 지원 그랜트, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 감사합니다.

여기에 설명 된 모든 실험은 헌터 칼리지의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 뉴욕 시립 대학에 의해 승인되었습니다. 독소가없는 플라스미드 DNA의 1. 준비 <ol><li> 갓 줄무늬 선택적 판에서 포유 동물 발현 벡터에 대한 관심의 유전자를 포함하는 박테리아의 하나의 식민지를 선택합니다. </li><li> 박테리아의 성장과 수확에 대한 시판 독소가없는 플라스미드 정제 키트의 수첩에서 발견 된 권장 사항을 따르십시오. </li><li> 시판 엔도톡신 프리 플라스미드 정제 키트의 프로토콜에 따라 박테리아 세포에서 내 독소가없는 플라스미드 DNA를 정제 하였다. </li><li> 독소가없는 플라스틱 제품을 사용하고 독소가 제거 단계 후 DNA 샘플에 다시 도입되지 않도록주의하십시오 DNA를 처리합니다. </li><li> MICR를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 내 독소가없는 플라스미드 DNA의 농도를 측정O-볼륨 UV의 아래 기술 분광 광도계 또는 표준 큐벳 기반 분광 광도계. <ol><li> 다음 마이크로 분광 광도계 샘플 보유 시스템의 하부 및 상부 광학 표면을 청소한다. 하단 광 시스템에 깨끗한 탈 이온수 피펫 1 μL. 레버 암을 닫고 상단 광학 시스템을 목욕을 할 몇 번을 누른 다음 열기 레버를 티슈로 닦아냅니다. </li><li> 마이크로 분광 광도계의 소프트웨어를 열고 핵산 모듈을 선택합니다. </li><li> 레버 암을 낮추고 프로그램 소프트웨어에서 &quot;초기화&quot;를 선택, 하단 광 시스템에 1 μL 깨끗한 탈 이온수를 놓습니다. 초기화는 조직과 완전 깨끗 모두 광학 표면되면 .. </li><li> 프로그램 소프트웨어에서 &quot;공백&quot;을 선택, 내 독소없는 TE 버퍼 (1 ㎜ EDTA 10 mM 트리스로-C1, 산도 8.0) 1 μl를로드하여 빈 측정을 수행합니다. 빈 측정이 완료되면, 깨끗한 모두 광학 표면조직. </li><li> 프로그램 소프트웨어에서 독소없는 DNA 샘플 및 선택 &quot;측정&quot;의 1 μl를로드하여 시료 측정을 수행합니다. DNA 농도를 기록한다. 화면에 나타나는 흡광도 비 280분의 260 nm의 기록에 의해 DNA의 순도를 평가합니다. HGD 순수한 DNA (1.8 280분의 260 비)의 사용이 매우 바람직하기 때문에, 1.7 이하의 280분의 260 비율로 DNA 샘플을 사용하지 마십시오. 측정이 완료되면, 티슈로 모두 광학 표면을 청소합니다. </li></ol></li></ol> 2. 마우스의 무게 <ol><li> 변형의 방식으로 적절한의 마크 쥐. 참고 : 꼬리의 표시는이 절차를 사용하지 않는 것이 좋습니다. <ol><li> 검은 색 마커 자신의 허리에 흰색 모피 (예 : 스위스 웹스터)가 마크 마우스 종. 필요에 따라 시간이 지남에 마크를 다시 적용합니다. </li><li> 귀에서 검은 모피 (예 : C57BL / 6)이 표시 마우스 종은 사전에 몇 일 펀칭. </li></ol></li><li> 쥐 individua에 무게를베드로 부드럽게 동물 계량 팬 또는 양동이에 배치하여 디지털 실험 실용 저울에 배치. 실험 날에, 실험에 사용 된 각 마우스의 무게를 기록한다. </li></ol> 주사기의 3. 준비 <ol><li> 사출 믹스의 제조 <ol><li> 각 마우스의 주입을위한 50 μg 독소 프리 플라스미드 DNA - 5 가정에 필요한 DNA의 양을 계산한다. <ol><li> 실험적으로 플라스미드 DNA의 최적 량을 결정합니다. </li><li> 요구되는 DNA의 양을 결정할 때, 주사기의 적절한 로딩이 어떤 여분 주입 혼합을 필요로하므로, 그룹 당 하나의 부가적인 마우스의 주입을 가정한다. 계산을하기 위해, 다음 예를 살펴 보겠습니다 : 마우스 당 50 μg 플라스미드 DNA와, 4 실험 및 4 제어 마우스, 각 무게 25g을 주입. 각 그룹에 필요한 5 × 50 = 250 μg μg의 DNA :이 경우에 필요한 DNA의 양을 결정하기 위해, 그룹 당 5 마우스를 산출한다. </li></ol></li><li> 각 마우스의 주입 체중의 10 %를 가정하여 필요한 양의 식염수 (0.9 % 염화 나트륨)을 결정한다. <ol><li> 위의 예에 따르면, 2.5 ㎖의 생리 식염수 (2.5 g 액)에서 플라스미드 DNA 50 μg 각 25g 마우스를 주입. </li><li> 마우스의 전체 그룹에 필요한 염분의 양을 결정할 때, 주사기의 적절한로드를 허용 할 그룹 당 추가 마우스의 주입을 가정합니다. 주어진 실험을 고려하여, 각 그룹의 5 마우스에 필요한 염분의 양을 계산 : 5 × 2.5 ML = 각 그룹에 대해 12.5 ㎖의 생리 식염수 (25 ㎖의 총). 참고 : 동일한 그룹 내에서 마우스는 동일한 중량 (체중의 10 % 이상의 차이)되지 않는 경우에, 분사 별도 혼합 준비. </li></ol></li><li> 10 ㎖, 여러 사용 유리 병에, 인간의 사용이 승인 된 방부제 및 독소 무료, 멸균 식염수를 사용합니다. </li><li> 20 ML의 주사기의 루어 잠금 팁에 부착 된 20 게이지 바늘 (x 25mm 0.9 mm)를 사용하여,식염수 병에서 액체를 철회하고 50 ML 원뿔 관에 주사기를 비 웁니다. DNA-식염수 주입 믹스의 준비 기간 동안 생리 식염수의 정확한 피펫 팅을하기 위해, 실험의 모든 생쥐의 주입에 필요한 것보다 더 많은 염분을 수집합니다. 실험에 필요한 식염수 계산 양이 25 ml의 경우에도 위의 실험을 위해, 3 내지 10 ㎖의 바이알 (약 30 ㎖의 전체)에 식염수를 철회. </li><li> 다른 50 ㎖ 원추형 튜브에 DNA의 양을 계산 피펫. 독소의 도입을 방지하기 위해 피펫 몸 관의 측을 만지지 않도록주의하십시오. 예에 따라, 별도의 원뿔 튜브에 실험 플라스미드 DNA의 250 제어 ㎍의 250 μg을 피펫. </li><li> 혈청 피펫을 사용하여 DNA에 식염수의 필요한 금액을 추가합니다. 고려 샘플 실험 마스터 믹스 (실험 및 제어)의 각각에 피펫 12.5 ml의 식염수. </li><li> 모든 솔루션에 도달 할 수 있도록 허용주사 전에 실내 온도. </li></ol></li><li> 주사기의 준비 <ol><li> 각 마우스를 들어, 멸균, 20 - 게이지 바늘 (0.9 mm × 25 mm)를 사용하여 DNA-식염수 믹스 멸균 3 ㎖, 루어 로크 시린지를 채운다. 공기 방울을 피하기 위해주의하십시오. 주입 유량이 매우 잘 제어 될 수없고, 한 손에 큰 주사기를 조작하기 어려운 높은 볼륨으로 주사기를 사용하여 피. 이 재사용 할 수 있으므로 다시 원뿔 튜브에 초과 DNA-식염수 믹스를 꺼냅니다. </li><li> 멸균, 27 게이지 바늘로 바늘을 전환합니다. 완전히 공기 방울을 도입하지 않고 액체로 바늘을 입력합니다. 마우스의 중량을 기준으로 계산 된 DNA-식염수 믹스의 볼륨을 조정한다. </li><li> 캡핑 바늘이 비 멸균 표면을 만지지 않도록하십시오. 다른 손으로 뚜껑을 잡고하지 않고 바늘을 삽입하고 출장 바늘을 누르면, 평평한 표면에 캡을 씌워 : 필요한 경우, 바늘은 한 손 기술을 사용하여 다시 출장 할 수있다바늘에 뚜껑을 확보하기 위해 회사 개체에 대해. 주사기는 이제 꼬리 정맥 주사를위한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 유체 역학 DNA 전달 <ol><li> 마취 마우스 가능성을 줄일 수 있습니다. 이 또한 가능성을 줄일 수로, 너무 추운 방에서 HGD을 수행하지 마십시오. 방은 20 ° C의 주변 온도가 마취를 사용하는 경우, 모든 동물의 손실을 방지하기 위해 37 ° C 포스트 절차로 설정 가열 패드에 마우스를 배치합니다. 마취를 사용하는 경우, 마우스의 입과 주둥이가 열 패드에 방해되지 않는 동안하고 완전히 복구 될 때까지 마우스를 준수하는지 확인하십시오. 이전 HGD에 마우스에서 음식이나 물을 원천 징수하지 마십시오. </li><li> 혈관을 팽창하기 위해 쥐를 따뜻하게. <ol><li> 침구의 온도가 약 38 ~ 39 ° C. 수 있도록 5 분 동안 열 패드에서 마우스 케이지 (침구 포함 가능)를 배치 온도에 대한 열 패드에 생쥐를 유지할만큼 충분히 낮아야기간을 연장했다. </li><li> 또한, 최소한의 규제로 등의 접근 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 부드럽게 따뜻한 물에 적신 거즈로 잡고 1 분 동안 마우스의 꼬리를 따뜻하게. 필요한 경우, 다시 위치에 마우스를 허용합니다. 건조 티슈로 꼬리를 닦아냅니다. </li><li> 또한, 더 이상 2보다 분 동안 가열 램프 아래에 케이지를 배치하여 따뜻한 마우스. 가열 램프를 사용하는 경우, 마우스의 과열을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다. </li></ol></li><li> 대용량 꼬리 정맥 주입 <ol><li> 실험실 테이프를 평평한 표면에 지느러미 액세스 제한 수단을 고정시킨다. </li><li> 꼬리 잡고 천천히 제한 수단에 마우스를 놓고 플러그를 삽입합니다. 고정 꼬리를 유지하기 위해 필요에 따라 적게 억제를 사용합니다. 마우스가 자유롭게 호흡되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스가 절차 중 어느 시점에서 심한 고통에있는 경우, 즉시 제한 기에서 마우스를 제거하고 휴식 할 수 있습니다. </li><li> 마우스의 위치를​​ 이렇게측면 꼬리 정맥 중 하나가 표시됩니다. 꼬리의 양쪽에 블루 라인이 측면 꼬리 정맥 동안 꼬리의 중간에 실행하는 빨간색 선은, 동맥입니다 : 마우스의 뒷면에 똑바로보고 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. </li><li> 철저하게 알코올 면봉으로 마우스의 꼬리를 닦아냅니다. </li><li> 꼬리가 중간과 세 번째 손가락에와 새끼 손가락 아래에서 검지 손가락에서 통과되도록 비 주입 손을 사용하여 색인과 중간 손가락 사이에 단단히 꼬리를 개최합니다. 엄지 손가락을 자유롭게 움직일 유지 할 수 있습니다. (그림 1A) </li><li> 다른 손을 사용하여, 알콜 면봉으로 다시 주입 할 영역을 닦아. 지역은 건조하도록 허용합니다. </li><li> 주입 - 손에 넣은 주사기를 들고 엄지 손가락과 다른 네 자리 숫자의 배럴를 잡고. 플런저에 잡지 마십시오. </li><li> 마우스의 몸을 향하여 바늘 가리키는 꼬리 주사기 평행하게 놓고위로 향하게 바늘의 경사 (경사 가장자리). </li><li> 꼬리 정맥에 바늘을 삽입합니다. 저항없이있는 슬라이딩 바늘에서 분명 정맥이 제대로있는 경우에만 주사를 진행합니다. 바늘 삽입의 깊이가 있지만, 전체 삽입 인해 정맥의 전단의 위험이 증가하지 않는 것이 좋습니다 개인 취향의 문제라고합니다. 바늘을 이동하지 마십시오. </li><li> 꼬리를 들고 손의 엄지 손가락을 사용하여 위치에 바늘을 잡아 꼬리에 바늘을 누르 허브의 허브에 폐쇄. 극단적 인 압력을 적용하지 않고 이러한 정맥에 액체의 흐름을 방해하므로, 바늘 축에 보유하지 않습니다. 주입 (그림 1A)를 방해하지 않도록 느슨하게이 시점에서 검지 손가락으로 꼬리를 잡아. </li><li> 집게 손가락과 가운데 손가락 플랜지에 들고 엄지는 플런저의 끝 (Figur에되도록 주사기 손을 잡고 다시는 위치전자 1A). </li><li> 하나, 연속 동작으로 플런저를 아래로 눌러 6 ~ 8 초에서 액체의 전체 볼륨을 주입. </li><li> 정맥에서 바늘을 제거하고 티슈로 꼬리에 부드러운 압력을 적용하여 출혈을 중지합니다. </li><li> 가열 패드의 상단에 배치 복구 케이지에 제한 기 및 장소 마우스에서 마우스를 제거 (침구는 37 ~ 38 ° C에서해야한다). 사출 방 감기의 경우,이 단계는 마우스의 생존을 위해 매우 중요합니다. 출혈이 완전히 정지 할 때까지 마우스의 차려라. </li><li> 유체 역학적 DNA 전달 다음 1 시간 동안 마우스를 관찰합니다. 헥헥과 부동의 초기 기간으로 인해 HGD에 의한 일시적인 부정맥에 정상입니다 만, 마우스가 약 5 분에 회복 조짐을 표시해야합니다. 마우스의 호흡이 상당히 얕은되면, 조심스럽게 호흡을 용이하게하기 위해 마우스의 복부를 마사지. 회복의 속도가 약간 사용되는 마우스의 변형에 의해 영향을받을 수도 있습니다. </li><li> 반환 마우스주택 케이지와 마우스가 풍부한 식량과 물의 공급이 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 다른 손 위치를 사용하여 대용량의 꼬리 정맥 주입 <ol><li> 제한 수단에 마우스를 놓고 전술 한 바와 같이, 4.3.5 단계 4.3.1에 ​​따라 분사를 준비하고 있습니다. </li><li> 구십도 각도로 구부려 네 손가락으로 평평한 표면에 비 주입 손을 놓습니다. 손가락 (엄지를 제외한 전부) 플랫폼을 만들어 서로 위에 쉬어야. 엄지와 손가락을 가리키는 (그림 1B) 사이의 마우스의 꼬리를 잡고. </li><li> 다른 손을 사용하여, 알콜 면봉으로 다시 주입 할 영역을 닦아. 지역은 건조하도록 허용합니다. </li><li> 주입 - 손으로 주사기를 잡고 플랜지 및 주입을위한 준비 플런저의 말을 개최합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이, 단계 4.3.17을 통해 단계 4.3.9에서이 프로토콜에 따라 절차를 완료합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

올바르게 수행 할 경우, HGD는 유전자 전달의 매우 안전하고 효과적인 방법입니다. 성공적인 HGD에 중요한 단계는 1)보다 8 초에 마우스 3)의 꼬리 정맥에) 생리 식염수 차량 2의 큰 볼륨에서 DNA의 정확한 양을 제공. 주입 과정 자체가 대단한 약간의 손재주가 필요하지만,이 여섯 번째 절차의 성공은 종종 실험주의 준비에있다. 최대한의 유전자 발현을 달성하기 위해 필요한의 pDNA의 양이 사용될 플라스미드 따라서 발현되는 유전자에 따라 크게 달라질 수 있으며, 주입되는 DNA의 최적 량은 각 응용에 대한 실험적으로 결정되어야한다. 마우스의 경우, 일반적으로 권장되는 DNA의 범위는 유전자 발현이 고원에 도달 할 수있는 이상으로 5 ~ 50 μg이다. 우리 손에, APOL-I 또는 HPR 유전자 하나를 들고 50 μg pRG977의 주입은 circulatin 높은 수준에 이르게처음 두 일 G 단백질 수준은 HGD을 게시 할 수 있습니다. 두...

에 의해 처음으로 설명하기 때문에 류 등. 및 장 등., 유체 유전자 전달 (HGD)는 설치류 모델 시스템 1, 2 유전자의 기능을 연구하는데 매우 중요한 도구가되고있다. 기술은 표적 기관 1, 2의 세포에 의해 플라스미드 DNA의 흡수를 촉진하기 위하여 마우스의 꼬리 정맥에 용액의 대량 (8~12% 체중)의 급속 주입 (5-7 초)을 포함한다. 이러한 조건은 신장, 비장, 폐와 심장에 간 적은 유전자 발현의 강력한 유전자 발현을 초래할. 10 μg을 pCMV-LacZ를 플라스미드 주입 HGD 날짜 1에 가장 효율적인 비 바이러스 성, 생체 내 유전자 전달 방법을 만드는 간세포의 많은 40 %가 감염 될 수 있습니다. 바이러스 성 항공사와는 달리, pDNA를 준비하기 쉽고, 설치류 호스트 3 면역 반응을 유도하지 않고 끝이 재결합하여 건강 위험하지 않습니다ogenous 바이러스. HGD에 의해 전달 된 DNA 분자가 포장을 필요로하지 않기 때문에 또한,이 방법은 150킬로바이트 4만큼 많은 세균 인공 염색체 (BAC)의 전달에 적합하다. 유체 역학적 방법에 의해 전달 된 분자의 다른 종류의 RNA 5-10, morpholinos와 11, 단백질 12, 13 및 다른 작은 분자 (12, 14)이 (가) 있습니다. 다른 전달 방법에 HGD의 장점과 단점은 문학 15 ~ 20 우수 리뷰에서 논의되었고, 저자의 수는 21-23 절차에 대한 자세한 설명을 제공하고 있습니다. HGD에 의해 마우스에 형질 전환 유전자를 도입하면 안전하고 1-3, 24 효과적이 방법은 비교 성공 (25)와 쥐에 사용되어왔다. 특정의 수정, 개념 증명 실험은 닭 26, RAB에서 실시 된큰 동물이 기술의 생체 내 응용 프로그램이 과제로 남아,하지만, (27)와 돼지 28 비트. 이 방법을 사용할 때, 또 다른 일반적인 제한은 가능한 포유류 발현 벡터의 많은 유전자 발현의 지속성, 높은 수준을 달성하기 성분이 부족하다는 것이다. 대상 기관에서을 pCMV 룩 플라스미드 유전자 발현을 사용하지만, 초기의 높은 발현 수준이 주입 한 후 첫 주에 급격히 인하, HGD 후 십분 빠르면 분명하다. 장기간의 형질 전환 유전자의 발현은 플라스미드 디자인 3, 24 그러나, 높은 수준의 유전자 발현의 유지가 종종 필요 반복 주사에 사용되는 프로모터와 인트론에 따라 가능하다. 이러한 이유로, HGD가 손상 단백질이나 단백질 제품에 장기간 노출의 결과 만성 질환을 연구 덜 적합 할 수 있습니다. 이러한 한계로, HGD는 PO 공부를위한 매우 강력한 도구입니다유전자 및 그것의 효과 tential 역할 (검토를 위해, 15 참조) 생체 내뿐만 아니라 치료 효과와 단백질의 조절에 질병의 동물 모델을 확립하는 돌연변이. 예를 들어, HGD 개별적으로 각각의 유전자가 녹아웃 한 마우스에 다양한 유전자 구성체를 도입하여 도메인 및 단백질의 아미노산에 기능을 할당하는 데 사용될 수있다. 또한,이 기법은 임의의 마우스 균주에서 사용될 수있다. 배달의 정맥 주입 볼륨과 속도에 정확한 바늘 삽입 :이 프로토콜은 성공적으로 형질 전환을 달성하기 위해 필요한 기술적 인 측면에 초점을 생쥐에 HGD에 대해 설명합니다. 이 방법의 적용은 아프리카 트리파노소마, 인간의 치명적인 질병과 가축 (29, 30)의 마우스 모델에서 입증된다. trypanosomes의 몇몇 종 가축에 질병을 일으키는 원인이 있지만, 대부분은 B의 면역 복합체를 타고난에 의한 인간의 질병을 일으킬 수CTRL 키를 누른라고 trypanosome 세포 용해 인자 (TLFs) 29, 31, 32. 이러한 기공 형성, 고밀도 지단백질 (HDL)의 두 가지 고유, 영장류 특정 단백질이 들어 있습니다. trypanosomes에 TLFs의 흡수를 용이하게 HPR, 리간드, 및 APOL-I, 용해성 구성 요소 31, 33 ~ 38을 Trypanosoma을 brucei의 rhodesiense 인해 바인딩과 인간 APOL-I (34), (39)을 중화 혈청 내성 관련 단백질 (SRA)의 표현으로 인간을 감염시킬 수 있습니다. 비비 TLF는 인해 발산 APOL-I 단백질 40 SRA에 의해 중화되지 않습니다. 포유 동물 발현 벡터 (pRG977), 쥐 원숭이 TLF 구성 요소의 형질 전환 식을 사용하여, 이전에보고 된 인간 감염 trypanosomes (40)에 대한 보호 기능을 부여한다. 여기에 제시된 대표적인 데이터는 유체 역학적 유전자 전달이 단백질의 치료 효과를 연구에 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>알코올 준비 닦음</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST 키트, Amplite 비색 AAT</td><td>Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>마우스 테일 일루미네이터</td><td>Braintree Scientific</td><td>MTI RST</td><td>또는 동등한</td></tr><tr><td>바늘, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>바늘, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>pRG977 (포유류 발현 벡터)</td><td>Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td><td>재료 이전 계약 필요</td></tr><tr><td>염화나트륨, 0.9% INJ USP 10 ml, 호스피라&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 3ml, HGD</td><td>의 압력을 견디는 데 필요한 Luer-Lok</td> Tip <td>BD</td><td>309657</td> Luer Lock</tr></tbody></table>

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

생체 내에서 형질 전환 유전자를 효율적으로 발현은 유전자 기능을 연구하고 질병에 대한 치료법 개발에 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안, 유체 유전자 전달 (HGD)이 설치류에 형질 전환 유전자를 전달하기위한, 간단하고, 빠르고, 안전하고 효과적인 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 관류 기관의 세포막의 투과성을 증가시키는 생리 용액의 대량의 급속한 주입에 의해 생성되는 힘에 의존하고, 따라서 세포로 DNA를 전달한다. HGD의 주요 장점 중 하나는 알몸 플라스미드 DNA (pDNA를)를 사용하여 포유류 세포로 형질 전환 유전자를 도입 할 수있는 기능입니다. 플라스미드를 사용하여 외래 유전자를 도입하는 방법은 매우 안전하고, 최소한의 고효율, 힘들고, 바이러스 사업자에 반대합니다. HGD가 처음 생쥐에 유전자를 전달하기 위해 사용 된, 그것은 이제 올리고 뉴클레오티드, 인공 염색체, RNA, 단백질 및 마우스에 작은 분자를 포함한 물질의 넓은 범위, 래트를 전달하는 데 사용와, 제한된 정도, 다른 동물. 이 프로토콜은 생쥐의 HGD에 대해 설명하고 프로 시저를 성공적으로 수행하는 중요한 방법의 세 가지 주요 측면에 초점을 맞추고 : 정맥에 바늘의 정확한 삽입, 분사의 볼륨 및 배달의 속도. 예를 분비, 영장류 특정 단백질을 인코딩하는 두 유전자의 일시적 발현이 방법의 응용 프로그램을 보여 주어, 아포 지단백 LI (APOL-I)과 합 토글 로빈 관련 단백질 (HPR).

마우스의 꼬리 정맥에 바늘의 정확한 위치는 (도 1에 도시 된 바와 같이)을 성공적으로 유체 역학 기반하여 형질 도입 유전자 전달을위한 필수 조건이다. 주입의 전체 볼륨은 6-8의 기간 내에 전달 될 수 있도록 종종 기술의 가장 어려운 부분은, 그러나, 움직임이없는 꼬리 정맥 내 바늘의 유지이다. 사출 과정에서 사소한 오류가 크게 감소 된 형질 전환 효율 및 단백질 발현의 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 각각의 실험 HGD의 성공을 모니터링하는 것이 필수적이다. 또한 형질 전환 단백질이 때문에 민감한 항체의 부족으로 웨스턴 블롯에 의해 검출하기 어려운 경우, 원숭이 APOL-I의 경우에서와 같이, 주입 효율이 단백질에 대한 유전자를 운반하는 플라스미드의 공동 주입에 의해 모니터링 될 수 검출이 용이하다. 도 2에 도시 된 실험에서, 마우스는 50 주사했다세 차등 6XHIS 중 하나를 운반하는 플라스미드 ㎍의는 비비 APOL-I 유전자와 원숭이 <em...

유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다.

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

이 절차의 전반적인 목적은 하이드로다이내믹 유전자 전달법(hydrodynamic gene delivery, HGD)을 사용하여 마우스에서 유전자를 일시적으로 발현시키는 것입니다. 마우스의 체중을 측정한 후, 플라스미드 DNA가 포함된 적절한 부피의 식염수를 준비하여 주사기에 충전합니다.그 다음 마우스의 꼬리를 가온하여 혈관을 확장시킨 후, 등쪽 동맥을 이용하여 보정기에 고정합니다. 기준점으로 외측 미정맥의 위치를 확인하고, DNA 식염수 혼합액을 미정맥 중 하나에 주입합니다. 마지막으로, 마우스를 보정기에서 꺼내어 회복을 위해 온열 매트 위에 놓습니다.최종적으로, Western blot을 통한 혈액 단백질 수치 모니터링으로 트랜스진 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 바이러스 수혈 발현과 같은 다른 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 하이드로다이나믹 유전자 전달법을 통해 생산이 쉽고 사용이 안전하며 크기 제한이 적은 naked plasmid DNA를 사용할 수 있다는 점입니다. 저는 Daniela Kovacic입니다.저는 Jane Raper 박사님 연구실의 박사후 연구원이며, 이번 방법의 시연을 맡았습니다. 먼저 Sharpie 마커를 사용하여 흰색 마우스의 등 쪽에 실험 그룹을 표시하는 것으로 절차를 시작하며, 필요에 따라 시간이 지나면 표시를 다시 합니다. 실험 당일, 디지털 실험용 저울 위에 놓인 동물용 계량 팬 또는 버킷을 사용하여 각 마우스의 무게를 측정합니다.첨부 문서의 지침에 따라 각 마우스의 체중을 기록하십시오. 주사기 충전 시 손실되는 양을 고려하여, 주사 대상인 각 마우스분과 추가로 1마리분 이상의 충분한 주사 혼합액을 준비하십시오. 인체 사용 승인을 받은 보존제 및 엔도톡신 제거 멸균 식염수를 사용하십시오.모든 용액이 상온에 도달하도록 둔 후, 3 mL 루어 락(luer lock) 주사기에 멸균된 20게이지 바늘을 장착하고 DNA 식염수 혼합물 x를 흡입합니다. 주사 횟수당 하나씩 주사기를 준비합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.주입량이 너무 많을 경우 제어가 어렵고 한 손으로 큰 주사기를 조작하기 힘들므로, 용량이 큰 주사기의 사용은 피하십시오. 다음으로, 멸균된 27 gauge 바늘로 교체하십시오. 계산된 값에 따라 DNA 식염수 혼합액의 부피를 조절하십시오.남은 용액을 나중에 사용하기 위해 원뿔형 튜브로 다시 배출합니다. 이렇게 하면 공기 방울이 유입되지

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 핵산 transfection을 위해 마우스 신장의 신장 골반에 플라스미드를 유체역학적으로 주입하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 조직 손상을 일으키지 않고 플라스미드를 특정 부위로 강제로 구동하는 높은 정수압의 원리를 활용하여 플라스미드의 장기 특이적 전달을 가능하게 합니다.

유체역학적 신장 골반 주사: 쥐 모델의 신장 세포에 DNA를 직접 전달하는 기술

이 비디오는 유체역학적 꼬리 정맥 주입에 의한 쥐 간세포의 유전적 생체 내 형질 주입 기술을 설명합니다. 이 transfection system은 간세포에서 transgene의 장기 발현을 생성합니다.

유체역학적 유전자 전달: 꼬리 정맥 주입을 통한 쥐 간세포에서 외인성 DNA의 생체 내 형질 주입 기술

형질 전환 마우스 또는 바이러스 성 벡터는 폐 내의 단백질 발현을 증가하는 데 사용되었습니다. 그러나이 기술은 기술적으로 도전적인 시간이 소요하고 결과를 혼동 할 수 있습니다 떨어져 표적 장기에 주요 영향이있다. 우리의 단백질 형질 프로토콜은 지질 기반의 transfection 시약 및 균일 폐 세포에 활성 단백질을 제공하는 초 미세 microsprayer을 사용합니다.

마우스 폐의 단백질 형질

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

이 원고에서는 마우스 심장에서 유전자 발현을 조작하기 위해 재조합 아데노 관련 바이러스 9(rAAV9) 벡터를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 프로토콜에는 신장에 특히 transgene 식 생산 하 신 골반을 통해 마우스 신장에 플라스 미드 DNA를 주입 하는 방법을 설명 합니다.

유체역학 신장 골반 주입은 신장에서 단백질의 비 바이러스 성 표현에 대 한

유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

이 프로토콜은 발달 중인 마우스 심장에서 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환(transgenesis)을 위한 상세한 방법론적 프레임워크를 제시합니다. 여기에 제공된 비디오 자산은 이 다재다능한 기술을 쉽게 배울 수 있습니다.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

학습하세요 마우스에서 수력학적 유전자 전달(HGD)을 이용한 단백질의 일시적 발현 방법을. 이 기술은 염증 반응을 최소화하면서 생체 내 유전자 기능과 단백질 구조를 분석할 수 있습니다.

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

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