January 15th, 2015
광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 깨어 있고 자유롭게 움직이는 동물에서 설치류 중추 신경계의 생체 내 광유전학적 자극을 성공적으로 수행하는 것입니다. 이는 먼저 광유전학적 자극을 수행하기 위한 적절한 레이저 시스템을 설정하고 구성함으로써 수행됩니다. 다음으로, 행동 테스트와 호환되는 광섬유는 이식된 광섬유와 관심 있는 뇌 영역을 표현하는 옵신에 레이저 광을 전달하기 위해 설정됩니다.
그런 다음 동물을 광유전학적 자극을 위해 레이저 시스템에 묶고 행동 테스트 장치에 넣습니다. 마지막으로, 동물이 행동 과제를 수행하는 동안 뉴런을 켜거나 끄기 위한 실험자가 정의한 광 자극 매개변수가 전달됩니다. 궁극적으로, 생체 내에서, 광유전학적 자극은 깨어 있고 행동하는 동물의 정의된 뉴런 또는 신경 회로 집단을 실시간으로 제어하여 주어진 관심 행동에서 기능적 역할을 결정할 수 있도록 하는 데 사용됩니다.
기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 신경 활동 패턴을 복잡한 행동 상태와 동맹으로 연결하는 데 필요한 시간적 해상도로 깨어 있고 행동하는 동물에서 유전적으로 및 공간적으로 정의된 뉴런 집단을 실시간으로 제어할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜에는 클래스 3 B 레이저의 사용이 포함되며 적절한 교육 및 안전 지침을 따라야 합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 레이저 장치를 설정한 후 특히 높은 위험을 나타내는 정렬 절차로 레이저를 작동할 때는 항상 안전 고글을 착용해야 하며, 먼저 레이저 뒷면의 스위치를 전류에 대해 cur로 설정하고 TTL을 설정하여 드라이버 전면의 일정한 조명을 위해 트랜지스터 트랜지스터 논리 모드에 대해 내부 청색 레이저의 비접촉 스타일 레이저 커플링을 수행해야 합니다. 전원 노브가 0으로 설정되어 있는지 확인하십시오.
그런 다음 먼저 드라이버를 켠 다음 레이저 키를 켜서 레이저를 켭니다. 눈의 안전을 위해 약 1밀리와트의 레이저 광선이 방출되도록 전원 손잡이를 천천히 조정하십시오. 그런 다음 레이저가 예열될 때까지 10-15분 동안 기다립니다.
그런 다음 광섬유 케이블 테스터를 커플러 패치 코드의 자유단에 직접 연결하고 케이블 테스터를 켭니다. 그런 다음 빨간색 빔이 이색성 미러의 중심을 향해 똑바로 다시 이동하도록 커플러의 각도를 조정합니다. 케이블 테스터에서 방출되는 적색광의 빔 경로는 들어오는 레이저 광이 레이저에 결합되기 위해 따라야 하는 정확한 경로입니다.
코스 정렬을 수행하려면 kinematic mirror의 측면 및 수평 손잡이를 사용하여 레이저 광선을 커플러로 조종합니다. 현재 커플러에 부착된 패치 코드에서 청색광이 방출되지 않더라도 걱정하지 마십시오. 이제 반투명 종이 한 장을 이색성과 커플러 사이의 이색성 거울 바로 앞에 놓습니다.
레이저와 케이블 테스터에서 각각 이 종이의 같은 면에 파란색과 빨간색 점이 모두 있습니다. 빨간색 점의 중심을 파란색 점과 정렬하도록 측면 및 수평 손잡이를 조심스럽게 조정하여 첫 번째 스티어링 미러를 미세 조정합니다. 종이가 커플러 바로 앞에 오도록 종이를 다시 커플러 쪽으로 이동하고 두 번째 이색성 거울의 손잡이를 조정하여 레이저 빔을 빨간색 빔에 맞춥니다.
파란색 빔과 빨간색 빔의 중심이 정확히 정렬될 때까지 두 미러를 계속 미세 조정합니다. Coline, 커플러 코드에서 케이블 테스터를 제거하십시오. 이제 커플러 패치 코드 끝에서 레이저 광이 들어와야 합니다.
커플링 효율을 결정하려면 광 파워 미터를 사용하여 커플러로 들어가는 광 전력을 광섬유 끝에서 방출되는 광 전력과 비교합니다. 80% 이상의 결합 효율은 이색성 거울의 위치를 유지하면서 매우 양호한 것으로 간주됩니다. 외부 노란색 레이저에 대해 두 개의 스티어링 미러를 사용하고 노란색 레이저를 결합하기 위해 방금 설명한 정렬 절차를 따라 단일 마우스를 자극하기 위한 광섬유를 설정합니다.
먼저 F-C-F-C-L 브래킷 어댑터를 브레드보드에 직접 연결하여 커플러 패치 코드를 두꺼운 재킷 패치 코드에 연결합니다. 정류자 로터리 조인트를 두꺼운 재킷 패치 코드의 자유 끝에 부착합니다. 그런 다음 동물 패치 코드를 정류자에 연결하십시오.
슬리브를 끝까지 올리지 않고 동물 패치 코드의 자유 금속 야생 끝에 연결 분할 슬리브를 부착합니다. 야생은 약 0.5cm의 슬리브를 노출시켜 BNC 케이블로 동물에 부착 된 광섬유에 연결합니다. 청색 레이저 드라이버를 펄스 발생기에 연결하고 펄스 발생기를 켭니다.
이제 적절한 보안경을 착용하십시오. 그런 다음 드라이버 전면의 전원 손잡이가 0으로 설정되어 있는지 확인한 후 먼저 드라이버를 켜서 레이저를 켠 다음 레이저가 TT L 포지티브 모드로 설정된 레이저 키를 켭니다. 레이저 전면의 손잡이를 천천히 조정하고 광 파워 미터를 사용하여 동물 패치 코드 끝에서 5-10밀리와트의 광 방출을 설정합니다.
이 설정에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 생체 내 자극을 위해 블루 레이저를 아날로그 모드로 전환하고 레이저가 예열될 때까지 10-15분 동안 기다립니다. 다음으로, 마우스를 부드럽게 제지하고 동물 패치 코드의 분할 슬리브를 만성 이식 가능한 섬유에 연결합니다.
두 섬유의 끝이 서로 물리적으로 접촉하는지 확인하십시오: 연결 슬리브의 분할을 창으로 사용하여 둘 사이의 직접적인 접촉을 시각화하십시오. 동작 테스트를 시작하기 전에 몇 분 동안 마우스가 회복할 때까지 기다립니다. 그런 다음 동물을 행동 테스트 장치에 넣고 커넥터 코드에 걸림이 없는지 확인합니다.
펄스 발생기를 사용하여 선택한 옵션을 활성화할 미리 결정된 주파수에서 청색 레이저를 펄스합니다. 실험을 완료한 후 행동 결과의 정확한 해석을 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 바이러스 및 섬유 배치를 조직학적으로 확인합니다. 현미경으로 옵신 발현 부위와 섬유 임플란트 부위를 확인하고 선택한 좌표에 따라 바이러스 주사 및 임플란트의 적절한 배치를 육안으로 확인합니다.
생체 내 광유전학적 자극을 통해 얻은 행동 결과의 본 예에서, 티로신 하이드록실라제 크림 마우스의 복부 영역의 도파민 뉴런 또는 VTA를 안정적인 단계 기능 OPSIN 또는 EYFP로 제어 바이러스로 형질전환하고 섬유 임플란트를 만성적으로 이식했습니다. 생쥐 그룹을 동시에 자극하고 여기에서 입증된 바와 같이 1시간 동안 기관차 행동을 기록했습니다. ops와 왼쪽의 transducted mouse에 대한 반복적인 자극은 자극 전반에 걸쳐 지속되는 과잉 활동 표현형을 초래했습니다.
행동 검사 후 오른쪽의 대조 마우스에서는 기관차 행동의 변화가 나타나지 않았지만, VTA 도파민 뉴런에 대한 정확한 바이러스 표적화를 확인하기 위해 면역조직화학을 수행했으며 이 그림과 같이 섬유 배치를 육안으로 확인했습니다. 이 기술은 신경 회로 변조의 기능적 판독으로 다양한 행동 테스트와 함께 주어진 관심 뇌 영역의 신경 활동을 조작하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 깨어 있고 자유롭게 움직이는 설치류에 대한 체내 옵토유전학적 자극 수행에 대한 포괄적인 가이드를 제공합니다. 행동 과제 중에 뉴런 활동을 조작하기 위해 특정 뇌 영역에 빛을 전달하는 레이저 시스템 설정의 세부 사항을 설명합니다.
In vivo optogenetic stimulation enables precise, real-time interrogation of neural circuits in awake, freely moving rodents, providing unparalleled temporal and spatial control over neuronal activity. This capability is critical for de-risking mechanistic hypotheses in neuropsychiatric and neurodegenerative disease models, supporting target validation and functional pathway mapping. The approach strengthens predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points, informing portfolio decisions in CNS drug development.
This optogenetic stimulation protocol integrates from early discovery through preclinical research, bridging target validation, mechanistic de-risking, and translational model development.