Name: 핫 생물 촉매 : 등온 적정 열량 효소 반응의 특성을 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 학습하세요 등온 적정 열량측정법(ITC)을 이용한 효소 반응의 열역학 및 동역학 분석 방법을. 잭빈 우레아제를 사용한 요소 가수분해 반응의 촉매 상수와 미카엘리스 상수를 정량적으로 측정할 수 있습니다.

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1. 준비 샘플 <ol><li> 효소 용액 2 ㎖ 및 각 실험 실행에 대한 기질 용액 0.5 ㎖를 준비합니다. 기판 첨가하는 동안 희석 및 혼합의 열을 최소화하기 위해 동일한 조성물을 갖는 완충 용액에 효소와 기질의 농축 원액을 희석. <ol><li> 실험 기간 동안 pH 변화를 방지하기 위해 적절 버퍼 조건을 선택합니다. 예를 들어, 20 mM의 HEPES 산도 7은 중성 pH의 측정에 적합합니다. NOTE : 양성자 교환이 관여되는 경우 그들이 반응 ΔH 측정에 영향을 줄 수 있기 때문에, 사용 된 버퍼의 양성자 화 엔탈피가 고려되어야한다. 분석중인 시스템의 버퍼 또는 첨가제 분자의 가능한 특정 효과가 고려되어야한다. 유기 용매 (예 : DMSO)가 효소 용액에 포함되는 경우, 기질 용액에 정확히 동일한 농도에 추가. </li><li> M1의 실험 시작nm의 범위에서 효소 농도 (예를 들면 1 NM)와 함께 효소 농도보다와 K M 이상 크기의 적어도 세 순서 높은 기질 농도. </li><li> M2 실험의 경우, PM-nm의 범위에서 효소 농도 (예 : 15시)로 시작합니다. 주사기에서 기질 농도는 mM의 범위 (예를 들면 400 ㎜)이다. 참고 : 단일 주입 M1의 실험에서, 농도는 실험 시간이 지남에 따라 제품에 전체 기판 변환을 달성하기에 적절해야한다. 따라서, 효소의 농도는 효소의 속도에 따라 달라 낮은 K 고양이와 효소 연구 중에있는 경우, 높은 효소 농도 (최대 10 μM)를 사용합니다. 한편, M2의 실험에서 사용 된 효소 농도는 주입 된 기판만을 소폭 (5 % 미만) 소비와 효소 반응이 정상 상태로 진행​​한다 있다는 것을 확신한다. 이 때문에, 높은효소의 효율성, 필요한 효소의 농도가 낮은. 실험의 끝에, 샘플 셀에서 기질 농도는 K M보다 높아야한다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 280 nm의, 색채, BCA 분석 실험 11에서 적절한 분석 절차 (예를 들면 흡수와 효소와 기질 농도를 확인합니다. 이것은 열역학 및 운동 매개 변수의 정확하고 신뢰할 수있는 계산을 얻기 위해 필요합니다. </li><li> 용액의 pH를 측정하고, 효소와 기질 용액 모두의 pH 불일치 (0.05의 pH 단위 ±) 실험 조건 하에서 최소인지 확인. </li></ol> 2. 실험 수행 참고 : 같은 절차가 모두 다른 후 하나를 수행하는 M1과 M2의 실험에 적용해야합니다. <ol><li> 시료 셀 및 주입 주사기 제조업체에 따라 청소되어 있는지 확인지침. 증류수로 기기와 함께 제공되는로드 주사기를 채우기, 부드럽게, 샘플 셀에 바늘을 삽입 할 셀을 채우고 같은 주사기를 사용하여 액체를 제거합니다. 이 방법을 사용하면, 완충액으로 두번 증류수로 두 번 샘플 셀 씻어. </li><li> 정중 기포의 형성을 피하는, 로딩 주사기를 사용하여 효소 용액 2 ㎖와 함께 샘플 셀을로드. 그것이 셀 스템의 상부 밖으로 유출까지 천천히 셀로 용액을 주입. 캘리포니아의 스퍼트를 생성합니다. 용액 0.25 ml의 세포로. 두 번 반복합니다. 이 단계는 샘플 셀에 갇힌 공기 방울을 제거한다. </li><li> 셀 스템 셀 포트 사이의 선반에로드 주사기의 바늘을 놓고 초과 솔루션을 제거합니다. </li><li> VP-뷰어 프로그램을 시작하고, 컴퓨터 인터페이스, 원하는 실험 온도 이하의 온도 3 ° C의 ITC 악기를 평형. 이것은 긴 평형을 방지하기 위해 필요합니다수동적 수단이 냉각 장치에 의한 실험 전 기간. </li><li> 상기 동일한 방법으로 증류수로 레퍼런스 셀을 채운다. 높은 이온 강도 또는 높은 삼투압을 가진 버퍼를 시료 용액에있을 때, 동일한 완충액은 참조 용액으로 사용한다. </li><li> 얇은 실리콘 튜브를 사용하여 주입 주사기 충진 포트에 플라스틱 주사기를 연결한다. 물이 주입 주사기가 가득 차 있음을 나타내는, 최고 충전 포트 나올 때까지 물에 바늘 끝을 배치하고 최대 그리기 주입 주사기를 채우십시오. 그런 다음 물에서 주사기의 끝을 이동하고 공기를 빨아, 주입 주사기를 비 웁니다. 이 절차를 버퍼로 주입 주사기를 씻어 시스템을 통해 공기를 그립니다. 이어서, 튜브의 저부에 용액의 소량 남게 정중 빨아 완전히 주입 주사기를 채우기 기질 용액 0.5 ㎖를 함유 좁은 튜브에 주사 바늘을 배치. </li><li> 에서컴퓨터 인터페이스를 누르십시오 &quot;닫기 채우기 포트&quot;. 실리콘로드 튜브를 제거합니다. 을 눌러 &quot;퍼지 및 리필&quot;주입 주사기가 공기 방울을 제거하고 대량 솔루션에 다시 추방 할 수 있도록 버튼을 클릭합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 모든 방울을 제거하고 시료 셀에 주입 주사기의 바늘을 배치 측면에 닦아 주입 주사기를 이동합니다. </li><li> 컴퓨터에서 적절한 실행 매개 변수를 설정합니다. 실험 효소와 기질 농도가 표시 될 수있다. <ol><li> M1 실험에서, 재현성을 확인하기 위해 기판의 적어도 두 개의 추가 (5-30 μL)을 설정. 각 주입 사이의 간격 시간을 보장하기에 충분한 크기 (예 : 1000 초)를 설정 그 다음 또한 이전의 기준에 열 신호로 돌아갑니다. </li><li> M2의 실험에서, (예를 들어 15 X 5-10 μL) 주사를 복수로 설정합니다. 시스템의 허용 주사제 (예를 들면 180 초) 간의 간격을 설정각 주입 후 새로운 기준에 화력을 tabilize. NOTE : M2 실험에서 주사 사이 간격 시간 측정은 정상 상태 조건 하에서 수행 될 수 있도록, 기판의 상당한 양의 전환을 방지하기 위해 충분히 짧아야한다. </li><li> M2의 실험에서, 그 대응하는 값 이후의 데이터 분석에서 삭제되는 첫 번째 주입을위한 작은 볼륨 (예를 들어, 2 μL)를 사용합니다. 실제로, 대개 주사기 팁을 통해 초기 기판 확산으로 인한 아티팩트를 제시하고 주사기 바늘에 갇힌 기포의 존재. </li><li> 기준 전력을 설정, 기준이 반응하기 전에 배치 될 수있는 대략 레벨 20의 값으로 시작합니다. 그런 실험 효소 및 기질 농도를 정의하고 실험의 이름을 선택했다. </li><li> 일반적으로 25 ° C에서, 실험 온도를 정의 ITC는 할 수 있습니다 (2)의 작동 온도<html> ° C와 80 ° C. 실험을 실행하기위한 준비가되어 있습니다. 실험을 시작하여 &quot;시작&quot;버튼을 누릅니다. </li></ol></li><li> 실험이 끝난 후에, 제조자의 지시에 따라 시료 셀 및 주사기를 청소한다. </li><li> 적어도 하나 또는 두 번 이상 데이터의 재현성을 확인하는 실험을 반복합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 분석 프로그램에서 &quot;데이터 읽기&quot;버튼을 클릭하고 수행 M2 실험. ITC 파일이있는 폴더로 이동합니다. &quot;파일 형식&quot;의 아래로 스크롤 화살표를 클릭하고 &quot;효소 분석 (그것을?)&quot;를 선택합니다. 그 후, 클릭하고 M2 실험. ITC 파일을 엽니 다. </li><li> 수학 식 5에 따라 M1 실험 곡선을 적분에서 반응 ΔH를 얻었다. &quot;폭 =&quot;126 &quot;/&gt; (5) <ol><li> &quot;데이터 읽기&quot;버튼을 클릭하고 수행 M1 실험의 파일. ITC를 선택합니다. 원산지를 사용하여, 하나의 피크를 각각 포함하는 다른 부분에서 추적을 나누고. OPJ 파일로 각각의 피크를 저장합니다. 단일 사출 M1 실험 해 통합하고, 얻어진 면적 값을 분할의 열상의 기준선 어긋남으로 인해, 첫번째 피크에 대응하는 파일을 열고 μcal 표현, 샘플 셀의 최종 기질 농도에 의해, μM 표현 및 셀의 용량에 식 5, 반응 ΔH에 따라 결정 리터 표현. </li><li> M1 실험의 두 번째 피크에 대한 동일한 절차를 반복하고이 ΔH 측정 평균값을 얻었다. </li></ol></li><li> 각 주입 다음 원래 기준과 새로운 기준의 차이를 측정 M2 실험에서 dQ를 / DT를 결정합니다. 전자 변환수학 식 4에 따른 반응 속도로 xperimental 데이터 M1 실험에서 얻어진 엔탈피 값을 이용하여 미카엘리스 - 멘텐 방정식에 데이터 피트. <ol><li> 분석 프로그램에서 &quot;데이터 읽기&quot;버튼을 클릭하고 수행 M2 실험의 파일. ITC를 선택합니다. &quot;파일 형식&quot;의 아래로 스크롤 화살표를 클릭하고 &quot;효소 분석 (그것을?)&quot;를 선택합니다. </li><li> 효소 분석 대화 상자가 4 가지 모델 중 하나를 선택 수 있도록 열립니다. 창에서 - &quot;만 기질 방법 2&quot;를 선택합니다. </li><li> ΔH 창에서 4.2 단계에서 얻은 ΔH의 값을 나타냅니다. </li><li> 피팅 절차에 사용되는 농도 값을 확인 &quot;집중&quot;버튼을 클릭. &quot;평균 시간 (P)&quot;버튼을 클릭합니다. 대화 상자의 기본값을 변경하거나 받아 들일 수있는 기회를 제공 열립니다. 이 값은 각각의 분사 전에 시간을 나타낸다이온있는 악기의 평균 각 기질 농도에서 전력 레벨을 결정하는 전력 신호. 기본 값을 확인하기 위해 확인을 클릭합니다. </li><li> &quot;제로 Y 축&quot;버튼을 클릭합니다. 커서는 Y = 0에 배치 할 점을 두 번 클릭 할 수 있도록 크로스 헤어로 변합니다. 단지 첫 번째 주입 지점 전에 두 번 클릭합니다. </li><li> 계산 속도 버튼을 클릭합니다. 환율 (계정 희석 효과를 고려하여) 샘플 셀 볼륨에 대한 적정 중에 추가 기판을 분할함으로써 유도 기질 농도, 대 플롯. 이 작업은 K M과 K 고양이를 얻기 위해 장착 할 수있는 일반적인 미카엘 - 멘텐 플롯을 제공합니다. </li><li> 몇 가지 포인트가 삭제해야하는 경우, &quot;자르기 데이터&quot;버튼을 선택합니다. 잘못된 데이터 점을 입력 마커를 누르거나 중 하나를 두 번 클릭을 제외 할 데이터 마커를 이동합니다. </li><li> 곡선에 맞게하고하는 &quot;모델에 맞춤&quot;기능을 사용하여운동 상수를 구하십시오. </li></ol></li></ol>

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기존의 방법과 관련하여 효소 활성을 연구하는 ITC의 의의 결합 평형을 연구의 고전 어플리케이션 이외에, 등온 적정 열량 측정 시스템 수정 또는 라벨링을 요구하지 않고, 프로브로서, 반응의 열을 사용하여 용액의 효소 반응의 특성을 안정적이고 빠른 방법을 제공한다. 운동 파라미터는 고양이 K와 K M은 보통 제품의 형성 (또는 기판 소비) 연속 또는 불연속 분석법에서 모니터링되는 시간 경과 실험의 집합을 통해 얻어진다. 통상적으로, 기판 또는 제품 농도 특성 파장에서 흡광도 또는 형광에 의해 측정된다. 그러나, 대부분의 기판들 및 / 또는 제품은 광학적으로 활성이 아니므로 발색단 또는 형광 반응을 수행하기 위해 포함되어야한다. 다른 방법으로, 분석을 결합측정 된 제품 또 다른 반응을위한 기질 인 촉매의 상품은, 사용될 수있다. 이러한 방법은, 그러나, K M과 K <...

생화학 반응의 정량은 삶의 기초에서 생물학적 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 열량은 양적 솔루션의 거의 모든 화학 반응의 특성에 레이블이없는 방법을 제공합니다. 이러한 기술은 열을 방출 또는 시간에 걸쳐 흡수 계측하고, 따라서 보편적 검출 시스템과 반응 분자 (즉, 결합 열역학)뿐만 아니라, 반응 속도 (즉, 반응 속도)을 측정하기위한 양을 정량화하는 매우 편리한 방법이다. 특히, 등온 적정 열량계 (ITC)는 단백질 - 리간드, 단백질 - 단백질, 단백질 - 금속 이온과 단백질-DNA 상호 작용 1-6을 포함, 생명 평형의 열역학 특성에 선택의 방법으로 채택하고있다. 본 출원의 전위가있을지라도 또, 운동 정보를 제공하기 위해 ITC의 능력은 그것의 효소 촉매 작용을 측정하는 매우 강력한 시스템 만든다7-9을 과소 평가. 미카엘리스 상수 (K M) 및 촉매 속도 상수 (k 고양이)는이 운동 매개 변수에 따라, 반응 속도와 기질의 농도 간의 관계를 제공하는 등 미카엘 - 멘텐 방정식 (10)은 효소 반응의 정량적 인 설명이다 . K 고양이는 / K M 비율은 효소의 촉매 효율로 언급된다. 실제로, 특정 반응에 대한 K M의 의지와 K 고양이는 촉매에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 전형적인 효소 반응 (도 1)에서, 기판 (S)을 연속적으로 전이 상태로 활성화되는 효소 - 기질 (ES) 복합체를 형성하는 효소 (E), (ES *)와 상호 작용한다. 후자는 결국 해리 효소 제품 (EP) 단지로 변환됩니다. 이 단계(S)는 다음과 같은 반응에 의해 설명된다. <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq1.jpg" width="197" /> (1) K 1은 ES 단지, K -1의 형성 속도 상수입니다 K 고양이 촉매 속도 상수 또는 회전율 수있는 동안, ES 복합체의 해리에 대한 속도 상수이다. : 미카엘리스 - 멘텐 방정식 10에 따르면, 반응의 속도는 다음과 같이 계산 될 수있다 <img fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq2.jpg" width="144" /> (2) 하는 K M = (K -1 + K 고양이) / K 1과 K 고양이 = V 최대 / [E], V 최대 모든 효소가 기판에 ​​바인딩 될 때 도달 최대 속도 인과. 등온 적정 열량계는 우레아의 가수 분해 효소의 특성을 본 연구에서 사용 된 수단이다. 이 기기는 두 개의 만들어 낸 모양의 세포 (그림 1)를 포함하는 단열 차폐 만든다. 이러한 좁은 프리 튜브와 외부에 접속된다. 기준 셀은 일반적으로 물 또는 분석을 위해 사용 된 용매로 충진되는 동안 샘플 셀 (약 1.4 ml)을, 효소 용액과 함께로드된다. 일반적으로 기질 용액 캘리포니아. 0.3 ML를 포함하는 긴 바늘과 연결된 교반 패들과 회전 주사기, 시료 셀에 장착된다. 열전 장치가 &quot;셀 피드백 네트워크&quot;를 사용하여, 시료 및 참조 셀 사이의 온도차를 측정하고, 그 열을 추가하거나 감산함으로써 제로의 차이를 유지한다. 실험하는 동안, 기판은 일정한 온도에서 선택된 효소 용액에 주입된다. 때 엔zymatic 반응물 방출 또는 흡수되는 열량이 상품 분자로 변환된다 기질 분자의 수에 비례하여, 일어난다. 또, 열 흐름의 속도를 직접 반응의 속도에 관한 것이다. 측정 된 데이터는, 초기 기준선에서 열 트레이스의 편차 (도 1)으로 나타나는 (μcal / 초) 샘플 셀에서 발생하는 열 유량에 비례하는 샘플 셀에 기기에 의해 공급 화력을 나타낸다 시간이 지남에. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 효소 반응을 연구 등온 적정 열량계의 개략도. (샘플 셀에서) 거기의 변화의 결과로 효소 용액 (주입 주사기) 기판의 적정시 발생하는 효소 반응시료 셀과 기준 셀 상수 사이의 온도 차이를 유지하는 데 필요한 칼로리, 발표 한 말의 힘. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51487/51487fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 전반적으로, 열 변화 (Q)을 반응 (ΔH)와 교대로 합계 양 배 농도 주어진다 (N), 생성 된 생성물의 몰수의 몰 엔탈피에 비례한다 : <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq3.jpg" width="200" /> (3) 생성물 형성은 시간이 지남에 따라 반응 속도에 대응한다 (DP / DT)는, 이와 관련하여 통해 동시에 (dQ를 / DT) 위에 발열량 관련 될 수있다 : <img fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq4.jpg" width="150" /> (4) 이 식에 따르면, 미카엘리스 - 멘텐를 얻기 위해는) 전체 몰 엔탈피 ΔH를 I를 측정하는 것이 필요하다 플롯 상이한 기질 농도에서 ⅱ) 열 흐름 dQ를 / DT. 일반적으로이 두 개의 상이한 실험에서 수행된다 : 첫 번째 실험 (방법 1, M1)에서, 기판이 효소 용액에 주입하고 완전한 기판 변환 용 히트가 측정된다; 두 번째 실험 (방법 2, M2)에서, 기판의 체류 주사가 수행되고, 열 생성 속도가 상이한 기질 농도에서 측정된다. 2 개의 데이터 세트는 운동 매개 변수 K M과 K 고양이를 유도하기에 충분하다. 본 기사에서는 ITC를 사용하여 수행 효소 반응에 대한 운동 매개 변수를 결정하는 일반적인 프로토콜이 설명되어 있습니다. 우리는 Canavalia ensiformis 요소에 의해 요소의 가수 분해 방법을 적용SE, 참조 시스템과 같은. 이 방법을 사용하여 얻은 결과와 문헌에보고 된 데이터와 잘 일치하는이 방법의 신뢰성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>물에 용해 및 NaOH</td></tr><tr><td>TRIZMA-Base</td>로 pH 조정 <td>Sigma</td><td>T1503</td><td>물에 용해 및 HCl로 pH 조정</td></tr><tr><td>인산이수소</td>나트륨 <td>Riedel-de-Haen</td><td>4270</td><td>물에 용해</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Riedel-de-Haen</td><td>30427</td><td>물에</td></tr> <tr><td></td><td>용해 요소Sigma</td><td>U4128</td>은 <td>40°C에서 물에 용해됩니다. C</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis urease (type C-3)</td><td>Sigma</td><td>U0251</td><td>20 mM HEPES pH 7에 용해하고 -80°C에서 보관; </td></tr><tr><td>Origin 7.0</td><td>MicroCal(GE Healthcare)</td><td>SYS13901</td> 기기의 C VP-ITC<td>&NBSP;</td></tr><tr><td>기기와 함께 제공되는</td> Origin 7.0 <td>MicroCal (GE Healthcare)</td><td></td> 데이터 수집 소프트웨어의 <td>VPViewer2000 1.30.00</td></tr></tbody></table>

핫 생물 촉매 : 등온 적정 열량 효소 반응의 특성을

Hot Biological Catalysis: Isothermal Titration Calorimetry to Characterize Enzymatic Reactions

등온 적정 열량 측정 (ITC)는 열이 거의 모든 화학적 프로세스를 특성화하기 위해 극한 프로브로서 사용하여, 화학 반응 동안 방출 또는 흡수 측정 잘 설명 된 기술이다. 현재에는,이 기술은 광범위 생체 분자 결합 평형의 열역학적 파라미터를 결정하기 위해 적용된다. 또한, ITC가 직접 응용 프로그램이 여전히 underexploited에도 불구하고, 효소 ​​반응의 역학 및 열역학 매개 변수 (K 고양이, K M, ΔH)을 측정 할 수 있도록 입증되었습니다. 열 변화가 자발적 효소 촉매 반응 중에 발생하는 바와 같이, ITC는 분석중인 시스템의 변경이나 표시를 필요로하지 않고, 용액에서 수행 될 수있다. 또한,이 방법은 재료의 작은 금액을 필요로한다. 이러한 속성은 ITC로 다음과 같은 다양한 응용 프로그램, 예를 들어, 약물 발견에 효소 반응 속도를 연구하는, 귀중한 강력하고 독특한 도구합니다. K 고양이를 결정하기 위해 적용되는 Canavalia의 ensiformis (잭 콩) 요소 분해 효소에 의한 요소의 효소 가수 분해의 K M. 반응의 고유 몰 엔탈피 (ΔH의 INT)의 계산이 수행된다. 얻어진 값은 방법론의 신뢰성을 보여주는, 문헌에보고 이전의 데이터와 일치한다.

요소 분해 효소 (EC 3.5.1.5, 요소 amidohydrolase는) archea, 박테리아, 단세포 진핵 생물과 식물에서 발견 multisubunit 니켈 함유 효소이다. 자발적으로 암모니아 및 수소 나트륨 (식 6) (12)의 두 번째 분자를 제공하기 위해 분해 암모니아, 카르 바 메이트에 요소의 가수 분해를 촉매 유기 질소 광물의 마지막 단계에있는이 단백질의 역할,,. <img fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51487/51487eq6.jpg" width="450" /> (6) 이 반응은 인간의 건강과 농업 13 부정적인 영향의 책임이있는 환경의 pH의 전반적인 증가의 원인이됩니다. 식물, 요소 분해 효소의 주요 역할은 아르 기나 파생 요소 (14)로부터 영양소 질소를 재활용하는...

등온 적정 열량 측정 열 흐름이 방출 또는 화학 반응에 흡수. 이 방법은 효소 - 촉매 반응을 정량화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 악기 설정을위한 프로토콜, 실험 실행 및 데이터 분석은 일반적으로 기술되고, 잭 콩 요소 분해 효소에 의해 가수 분해 효소 요소의 특성에 적용.

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a well-described technique that measures the heat released or absorbed during a chemical reaction, using it as ...

다음 실험은 등온 적정 열량계를 이용하여 시간에 따라 방출 및 흡수되는 열을 내부 프로브로 활용함으로써, 용액 내 효소 반응의 열역학 및 반응 속도론을 정량적으로 결정하는 신뢰성 높고 빠른 무표지법을 설명합니다. 이는 기기의 시료 셀 내에서 일정한 온도로 효소 반응이 일어나게 하고, 열 추적선이 초기 기선에서 벗어나는 정도를 모니터링함으로써 이루어집니다. 방법 1 또는 M1이라 불리는 첫 번째 실험에서는, 기질을 효소 용액에 주입하고 기질이 완전히 전환될 때까지의 열을 측정하여 반응의 총 몰 엔탈피를 결정합니다.방법 2 또는 M2라고 불리는 두 번째 실험에서는 기질을 여러 번 주입하여, 서로 다른 기질 농도에서 시간에 따른 열 생산 속도를 측정합니다. 두 가지 열량 측정 실험에서 도출된 결과는 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 효소 촉매 작용을 가정하여 속도론적 파라미터인 kcat 및 km를 결정할 수 있게 해주었습니다. 생성물의 형성 과정을 시간에 따라 모니터링하는 분광광도법 분석과 같은 다른 방법들에 비해 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하는 주요 장점은, 분석 대상 시스템의 수정이나 표지가 필요 없으며 반응 고유의 열을 내부 프로브로 사용하므로 매우 적은 양의 물질만으로도 절차를 수행할 수 있다는 점입니다.저희 실험실의 박사 과정 학생이 먼저 M1 실험을 위해 농축된 효소 용액을 2 mL의 완충액으로 희석하여 최종 효소 농도를 나노몰(nM) 범위로 맞춥니다. 그런 다음, 농축된 기질 용액에 0.5 mL의 완충액을 첨가하여 기질 농도가 효소 농도보다 최소 3배수(orders of magnitude) 이상 높고 km 값보다 높게 설정합니다. M2 실험을 위해서는 최종 농도가 피코몰(pM)에서 나노몰(nM) 범위인 2 mL의 효소 용액을 준비합니다.기질을 버퍼 0.5 milliliters로 희석하여 밀리몰(millimolar) 범위의 기질 농도로 맞춥니다. 제조사의 지침에 따라 샘플 셀과 주입용 시린지가 세척되었는지 확인한 후, 로딩 시린지를 증류수로 채웁니다. 그다음 바늘을 샘플 셀에 조심스럽게 삽입하여 셀을 채우고 앞서 설명한 방법으로 액체를 제거하며, 샘플 셀을 증류수로 2회, 버퍼로 2회 세척합니다.효소 용액을 셀 스템 상단으로 흘러넘칠 때까지 셀 내부로 천천히 주입합니다. 샘플 셀 내부에 갇힌 기포를 제거하기 위해, 약 0.25 milliliters의 용액을 셀 내부로 강하게 분사합니다. 이 분사 과정을 두 번 더 반복합니다.로딩 시린지의 바늘을 셀 스템과 셀 포트 사이의 턱에 놓은 다음, 과잉 용액을 제거하십시오. VP 뷰어 프로그램을 시작하고 ITC 장비를 원하는 실험 온도보다 3 °C 낮은 온도로 평형화하십시오. 이전과 동일한 방식으로 참조 셀을 증류수로 채운 후, 얇은 실리콘 튜브를 사용하여 주입 시린지의 충전 포트에 플라스틱 시린지를 연결하고, 주입 시린지 팁을 물에 넣은 다음 상단 충전 포트로 물이 나올 때까지 시린지를 채워 주입 시린지가 가득 찼음을 확인하십시오.그런 다음 주사기 팁을 물에서 꺼내 공기를 흡입하여 주입 주사기를 비웁니다. 동일한 절차를 사용하여 주입 주사기를 버퍼로 세척하고 시스템 전체에 공기를 통과시킵니다. 다음으로, 깨끗하고 좁은 튜브에 기질 용액을 담습니다.이를 주사기 아래에 배치하고, 주입용 주사기의 바늘을 완전히 삽입합니다. 컴퓨터 인터페이스를 통해 튜브 바닥에 소량의 용액이 남도록 주입용 주사기를 채웁니다. 충전 포트 닫기(close fill port)를 누릅니다.실리콘 로딩 튜브를 제거한 후, 퍼지 및 리필(purge and refill) 버튼을 눌러 주입 시린지 내의 기포를 제거하고 이를 벌크 용액으로 다시 배출하십시오. 그 다음, 종이 타월로 주입 시린지의 측면을 닦아 잔류 용액을 제거하고 이를 샘플 셀에 넣으십시오. M1 실험에서는 재현성을 검증하기 위해 5~30 µL의 기질을 최소 2회 이상 추가하도록 설정하십시오.그 다음, 다음 주입 전까지 열 신호가 기저선으로 복귀할 수 있도록 각 주입 사이의 간격을 충분히 설정하십시오. M 두 실험에서는 5~10 µL씩 여러 번 주입하도록 설정하십시오. 각 주입 후 시스템이 새로운 기저선으로 열 출력을 안정화할 수 있도록 주입 간격을 설정하십시오.이 단계에서 기준 전력을 20으로 설정하십시오. 그런 다음 실험에 사용할 효소 및 기질 농도를 정의하고 실험 이름을 지정하십시오. 온도를 25 °C로 설정하고 실험을 시작하십시오.실험이 완료되면 제조업체의 지침에 따라 샘플 셀과 시린지를 세척하십시오. Origin 7.0 소프트웨어를 실행한 후, 열기 버튼을 클릭하고 M1 실험의 열 추적(heat trace)에서 첫 번째 주입에 해당하는 파일을 선택하십시오. 반응의 delta H를 결정하려면, 단일 주입의 서모그램(thermogram)에서 기선 편차로 인해 나타나는 첫 번째 피크를 적분하십시오.M1 실험을 수행합니다. 그런 다음 마이크로 칼로리로 표시된 총 반응열에 해당하는 얻어진 면적 값을 샘플 셀 내의 최종 기질 농도(마이크로몰로 표시)와 샘플 셀 부피(리터로 표시)로 나눕니다. M1 실험의 두 번째 피크에 대해 동일한 절차를 반복하고, 두 번의 delta H 측정에서 얻은 값들을 평균합니다. 이어서 각 주입 후 원래의 기선(baseline)과 새로운 기선 사이의 차이를 측정함으로써 M2 실험으로부터 DQ over DT를 결정합니다.이는 다음 식에 따라 실험 데이터를 반응 속도로 변환함으로써 수행할 수 있습니다. M1 실험에서 얻은 엔탈피 값을 사용하십시오. 그런 다음 분석 프로그램을 사용하여 특히 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식에 데이터를 피팅하십시오.데이터 읽기 버튼을 클릭하고 M two 실험 데이터가 저장된 폴더로 이동하십시오. 그런 다음 파일 형식의 드롭다운 화살표를 클릭하여 enzyme assay를 선택하십시오. 이어서 해당 파일을 클릭하여 엽니다.M2 실험의 ITC를 수행하십시오. 효소 분석 대화 상자가 열리면 창에서 'method two substrate only'를 선택하고, delta H 창에 M1 실험에서 얻은 delta H 값을 입력하십시오. 다음으로 y축 0점 조정 버튼을 클릭하고 첫 번째 주입 지점 바로 직전 부분을 더블 클릭하십시오.속도 계산 버튼을 클릭하여 기질 농도에 따른 속도 그래프를 작성하십시오. 마지막으로, 모델 적합 기능을 사용하여 곡선을 적합시키고 속도 상수를 구하십시오. 효소 촉매 작용의 정량적 결정에 있어 ITC의 적용 가능성을 입증하기 위해 cannavale 및 CMIS 또는 JAK bean URIs의 용해 활성을 대표 반응으로 선정하였습니다.M1 실험에서 요소 기질을 우레아제 용액에 주입하여 발생하는 열량을 적분하고 반응이 완료될 때까지 진행함으로써, -10.5 kcal/mol의 ΔH 값을 측정하였습니다. M2 실험에서 기록된 열량은 다음 방정식을 사용하여 반응 속도로 변환되었습니다. 얻어진 데이터를 Michaelis-Menten 방정식에 적합시켜 20 mM HEPES 조건에서 잭빈 우레아제의 반응 속도론적 파라미터를 산출하였습니다.pH 7에서 kcat은 30,200 per second이고 KM은 3.45 millimolar이며, 이는 이전에 보고된 데이터와 일치합니다. M1 실험에서 측정된 총 열 변화는 분석 중인 반응 동안 발생하는 모든 사건의 합을 나타내며, 기질의 생성물 전환뿐만 아니라 관련된 모든 과정의 몰 엔탈피에 따라 달라집니다. 반응 시스템이 완충 용액에서 양성자를 획득하는 일반적인 과정에서, 완충제는 양성자를 방출하여 반응 셀 내에 추가적인 열을 발생시킵니다.따라서 측정된 delta H는 겉보기 값이며, 강조된 식에 따라 반응의 고유 delta H뿐만 아니라 완충액의 이온화 엔탈피와 교환되는 양성자의 수를 포함합니다. M1 실험에서 이 식을 사용하면, 서로 다른 이온화 엔탈피를 가진 완충액에서 동일한 실험을 수행함으로써 교환되는 양성자의 수와 고유 delta H를 결정할 수 있습니다. 전체 urea 가수분해 반응은 완충액으로부터 양성자를 얻는 결과를 낳습니다.따라서 위에서 설명한 바와 같이, 반응열에는 완충액의 양성자화 기여분이 포함됩니다. 가수분해 반응의 고유한 delta age를 계산하기 위해, 서로 다른 세 가지 이온화 엔탈피 값을 가진 서로 다른 완충액에서 세 번의 M1 실험을 수행하였습니다. 고유 엔탈피와 완충액에서 방출된 양성자 수는 실험 데이터의 선형 피팅에서 얻은 y절편과 기울기를 통해 계산할 수 있습니다.이 값들은 각각 -14.7 kcal/mol 및 0.98로 나타났으며, 이는 이전에 보고된 데이터와 완전히 일치했습니다. 이 절차의 응용 분야는 기초 연구부터 응용 연구 및 약물 스크리닝까지 확장 가능하며, 일단 효소 반응의 반응 속도론이 결정되면 서로 다른 종류와 농도의 효소 억제제 존재 하에 실험을 반복하여 억제 상수를 모니터링할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

ITC는 호스트에 리간드의 바인딩을 연구를위한 강력한 도구입니다. 복잡한 시스템에서 그러나, 몇 가지 모델은 동일하게 데이터를 맞을 수 있습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 복잡한 시스템에 적합한 바인딩 모델을 명료하게하다와 해당 열역학적 파라미터를 추출하는 수단을 제공합니다.

바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집

적당한 바인딩 동질성과 생물 학적 시스템에 대한 바인딩을 열역학을 모니터하는 등온 적정의 열량의 사용에 대한 일반적인 프로토콜이 제공됩니다.

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량

박테리아 배양액을 연속적으로 희석하여 성장 배지가 들어 있는 열량 측정 바이알에 분취량을 추가합니다.밀봉된 바이알을 등온 미세열량계의 멀티웰 플레이트에 넣어 대사열 생성을 측정합니다.이 장치는 감지된 열이 박테리아 대사에서만 발생하도록 일정한 온도로 유지됩니다.박테리아는 영양분을 대사하고 증식하면서 센서가 실시간으로 감지하는 열을 방출합니다.동시에 인큐베이터에서 동일한 바이알을 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정하여 박테리아 성장을 모니터링합니다.희석액의 열량 측정 신호를 사용하여 열 활성 곡선을 구성하고 이를 OD 값과 연관시킵니다.날카로운 첫 번째 피크는 기하급수적인 성장 중 유산소 호흡을 나타냅니다.산소가 제한되면 세포는 혐기성 발효로 전환하여 두 번째 날카로운 피크를 생성합니다.정지기에 들어가면 박테리아는 효소를 분비하여 세포외 단백질을 분해하고 신진대사를 유지하여 넓은 피크를 생성합니다.

박테리아의 대사 활동을 모니터링하기 위한 등온 미세 열량계

효소에있는 물 분자의 수송 채널은 활성 부위 매화 및 촉매 작용에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 실리 컴퓨터 모델링 및 실험에 기초하여 다음과 같은 추가 촉매 주제의 엔지니어링을위한 프로토콜을 제시한다. 이 효소의 촉매 작용에 용매 역학의 영향에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것입니다.

막 효소 용매 역학에 의해 유도 탈피 엔트 속도 가속

효소 활동의 열 안정성은 쉽게 등온선 적정 열 량 (ITC)에 의해 측정 됩니다. 대부분 단백질 안정성 분석 실험은 현재 측정 단백질 전개, 사용 하지만 효소 활동에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. ITC의 효소 활동의 안정성에 효소 수정 효과의 직접 측정을 수 있습니다.

등온선 적정 열 량 효소 안정성 측정

본 프로토콜은 샘플 준비, 실행 표준 및 샘플을 포함하여 DNA 압타머와 테트라사이클린 간의 결합의 연관성 및 해리 역학을 분석하고 결과 데이터를 해석하기 위한 등온 적정 열량측정법(ITC)의 사용을 설명합니다.

등온 적정 열량계를 사용하여 DNA 압타머와 테트라사이클린의 열역학적 및 동역학적 연관성 결정

이 논문에서는 신열대성 아누란 종의 바이오마커 평가를 위한 표준화된 생태독성학적 방법을 제시합니다. 특히, 이 논문은 유전적, 세포-조직학적, 생화학적, 형태학적 및 개별 수준과 같은 다양한 규모의 생태독성학적 평가에서 여러 방법론을 자세히 설명합니다.

신열대성 아누란에서 다양한 규모의 바이오마커를 평가하기 위한 생태독성학적 방법론

이 문서에서는 자기 조립 블록 공중 합체 기반 초분자에서 얻은 나노 다공성 템플릿 상에 무전 해 금속 증착을 통해 잘 정돈 니켈 nanofoams의 준비에 대해 설명합니다.

디 블록 공중 합체의 초분자에서 Gyroid 니켈 나노 구조

실리카 나노 입자는 실록산 전구체의 산 촉매 작용과 마이크로파 보조 합성 기술을 사용하여 제조되어 직경 30-250 nm 범위의 나노 물질의 성장을 제어했습니다. 성장 역학은 초기 규산 농도, 반응 시간 및 반응 온도를 변화시켜 제어할 수 있습니다.

전자 레인지를 이용한 산 - 촉매 반응을 통해 실리카 나노 입자의 제조

retropinacol / 크로스 피나 결합 메커니즘을 기반으로 비대칭 1,2 - 디올의 합성을위한 신규 계좌 설명한다. 때문에 기존의 크로스 피나 커플 링에 비해 반응 상당한 개선의 촉매 실행에 달성된다.

Retropinacol / 크로스 피나 커플 링 반응 - 1,2 - 비대칭 디올에 촉매 액세스

학습하세요 등온 적정 열량측정법(ITC)을 이용한 효소 반응의 열역학 및 동역학 분석 방법을. 잭빈 우레아제를 사용한 요소 가수분해 반응의 촉매 상수와 미카엘리스 상수를 정량적으로 측정할 수 있습니다.

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