Name: 이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜 제자리에서 애벌레 바다 장어의 하이브리드 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 학습하세요 척수 손상 후 축삼 안내 메커니즘을 연구하기 위한 바다 장어의 완전한 척수 절단 및 뇌 해부 기법을. 이 방법은 재생 능력이 있는 척수 투사 뉴런을 분석하여 척수 재생에 대한 통찰을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH 보조금 NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 Michael E. Selzer 박사의 지원; Shriners Research 보조금 SHC-85220을 Michael E Selzer 박사에게 수여합니다. 및 Shriners Research Grant SHC-85310을 Michael I. Shifman 박사에게 수여합니다. 안톤 바레이로-이글레시아스 박사는 Fundación Barrié(스페인)와 Xunta de Galicia(스페인 갈리시아)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜에 사용되는 모든 재료는 표 1을 참조하십시오. 실험은 템플 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1 동물 <ol><li> 야생형 애벌레 바다 칠성 장어 (Petromyzon 스 marinus L.)를 얻어, 10 - 메인에서 델라웨어 강 (펜실베니아) 또는 스트림 지류에서 미시간 호수를 공급 스트림에서 - (7 세 4)의 길이는 14 센티미터. </li><li> 16 ° C에서 50갤런 담수 탱크 (100) 동물 - 실험실에서, 50 그룹의 유충을 유지한다. 선 자갈 인치와 탱크 애벌레에서 굴을하기 위해, 물은 숯 여과하고 그들 칠성 장어하기 전에 염소 및 기타 불순물을 제거하기 위해 최소 48 시간 동안 공기 돌을 조절한다. 사용 일까지, 자신의 암성 재활용 동물, 먹이를 할 필요는 없다. </li></ol> 2 완전 척수코드 절개 <ol><li> 척수 수술하기 전에 다음과 같은 조성으로 심고 링거 용액 제조 : 110 mM의 염화나트륨, 2.1 mM의 KCl을 2.6 mM의 염화칼슘, 1.8 mM의 MgCl2를, 10 mM 트리스 완충액을; pH가 7.4. </li><li> 척수 절개를 수행하려면 작은 용기에 유충을 배치 얼음 차가운 링거 용액 1 % tricaine 메탄으로 마취합니다. </li><li> 마취 대신 일단 반 실 가드 (실리콘) 가득 배양 접시에있는 동물과 하나가 꼬리에, 동물의 주둥이에 하나씩 배치 (수술 위치에있는 동물을 잡아 4 곤충 핀 (0.15 mm 직경)를 사용 그리고이 다섯 번째 아가미의 수준에서). 거의 링거 용액으로 가기까지 배양 접시를 채 웁니다. 실체 현미경을 이용하여 수술을 수행하는 동안 얼음에 유충으로 요리를 넣습니다. </li><li> 척수 절개에게 등쪽을 수행하려면, 정중선, 5 번째의 레벨 메스 (# 11)와 세로 절개아가미는 척수를 시각화합니다. 초기에 피부가 위로 향하게 척수 이상에서 알 수있는 때까지 근육 조직이 매우 부드럽게 절단 메스 블레이드의 선단을 삽입함으로써 개방된다. 패션이 곤충 핀에서 후크와 척수 절개를 수행하는 동안 몸의 벽이 열려 유지하는 데 사용할. </li><li> 완전히 가위 (8 Castroviejo #)를 이용하여 제 5 아가미의 수준에서 척수를 쪼개다 척수에 수직으로 위를 삽입한다. 척수가 완전히 한 깨끗한 잘라 가로로해야합니다. 척수가 완전히 가로로되어 있음을 확인하기 위해 실체 현미경 척수 절단 단부를 시각화. 그리고, 한 쌍의 집게 (# 5)를 사용하여 절개 후 척수의 절단 단부를 재조정. </li><li> 척수 절개 미세 집게 한 쌍의 지느러미 몸 벽에 상처를 닫고 상처 t 수 있도록 1 시간 동안 얼음에 유충을 넣어 수행 한 후오 건조. 얼음 및 유충 사이 필터 종이 조각을 넣고 심고 링거 용액에 담가. 낮은 온도는 건조 따라서 감염을 방지 할 수 있도록 공기에 상처를 허용 동시에 살아있는 동물을 유지한다. </li><li> 그런 다음 24 시간 동안 얼음 냉수 작은 탱크 유충 (1 조 당 한 유충)를 전송합니다. </li><li> 행동면 부상의 사이트에 더 이동 꼬리가 없음을 확인하기 위해 척추 절개 후 병변 애벌레 일일를 검사합니다. 유충 (5 번째 아가미의 수준에서) 부상의 사이트에만 머리의 주동이를 이동할 수 있습니다 경우 척수 절개가 완료된 것으로 간주됩니다. 이 경우는 현재 23 유생 (실온에서 담수와 탱크 (1 조 당 한 유충)으로 전송 될 수있다 ° C)는 그들이 선택한 시점에 복구 할 수 있습니다. </li><li> 회복 기간 중 매일 2-3일 물을 변경합니다. </li></ol> 3 뇌 해부 및 준비현장 하이브리드 화에 대한 뇌 <ol><li> 부상 후 원하는 시점에서 애벌레 바다 칠성 장어와 장소를 다시 마취 상기와 같이 뇌 해부를 수행하기 위해 링거 용액과 페트리 접시에 그들을 핀. </li><li> 뇌를 해부하려면 먼저 콧 구멍과 뇌의 장기 사이의 메스 횡 절개를합니다. 여기에서 한 쌍의 집게로 잡고 Castroviejo 위의 쌍을 이용하여 뇌를 둘러싸고있는 조직을 절단하기 시작한다. </li><li> 뇌가 노출되면, 한 쌍의 집게를 이용하여 맥락총를 제거하고 뇌 신경을 동물의 머리를 확산하고 노출시키는 후크를 사용한다. 이어서, Castroviejo 가위와 척수 횡 절단. 뇌를 해부 두개골 신경을 잘라 집게의 또 다른 쌍을 사용하는 동안 집게 한 쌍의 척수를 잡습니다. </li><li> 절개 후, 실리콘의 작은 조각에 뇌를 넣고이 기능을 삽입하여 위치를 잡고척수 후각 전구 및 하나의 요법 핀입니다. 그런 다음, 후방 및 가위로 지느러미 중간 선을 따라 뇌의 cerebrotectal commissures을 절감하고 측면 날개의 판을 편향과 4 곤충 핀 (그림 2)와 실리콘에 평평하게 고정. </li><li> 회에 3 시간 동안 방 temparature로 고정 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 (산도 7.4)를 포함하는 튜브에 뇌와 실리콘의 조각을 전송합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 고정 후 현장 하이브리드 화에 wholemount을 위해 뇌를 사용 (스웨인 외., 1994). 제어 또는 허위 조작 동물의 뇌 부상 동물의 뇌와 병렬로 항상 실행해야합니다. wholemounted 애벌레 뇌 때문에 평평하고 얇은 모양과 인해 뇌가 상당히 투명하게 수초 (10)의 부재에 현장 하이브리드 화에 의해 연구 될 수있다. </li></ol>

<ol><li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li>
<li>Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li>
<li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li>
<li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li>
<li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning%2C+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li>
<li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li>
<li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li>
<li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+myelin+sheaths%3A+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li>
<li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에서 우리는 애벌레 바다 칠성 장어의 완전 척수 절개 후방 뇌 해부를 수행하기 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 원위치 혼성화에 전체 실장 뇌에 의한 척수 손상 후 척수 식별 돌출 뉴런 간의 유전자 발현의 차이를 분석한다. 절차에서 중요한 단계는 부드럽게 한 쌍의 유충의 주둥이를 터치하여 24 시간 후 stereomicrocope 하에서 척수의 절단 단부를 관찰함으로써 제어되고 확인 될 수있는 완전한 척수 절개의 정확한 수행한다 상처 부위에 어떠한 움직임 꼬리가없는 경우 집게 표시한다. 또한, 수술에 사용되는 가위 무딘 아닌 동물의 회복을위한 중요한 한 깨끗한 절단이 완전히 척수 쪼개다 위해 수행된다는 것이다. 부상 후 동물의 생존은 매우 ANIM을 유지하여 개선수술 중 및 제 24 시간 동안 공기 건조한 후 얼음 냉수에 상처를 허용하는 데 사용되는 시간 동안 얼음에 ALS. 이 기간 후에 상처 닫히고 동물은 이미 실온에서 담수와 탱크로 이송 될 수있다. </p...

포유 동물에서 척수 손상 (SCI)는 부상 축삭은 외상 영역을 통해 재생과 적절한 대상에 다시 연결하지 않기 때문에 부상의 사이트 아래 기능의 영구적 인 손실로 이어지는 치명적인 조건이다. 포유류는 달리, 칠성 장어는 완전한 척수 손상 후 운동력을 복구. 1 흥미롭게 칠성 장어 때문에 그들의 큰 크기 2,3 (도 1)의 뇌 제제 마운트 전체 36 척수에서 개별적으로 식별되어 뉴런 돌출 세트를 가지고 . 이러한 척추-돌출 뉴런은 모두 높은 수준의 완전한 척수 절개하여 axotomized된다. 우리 그룹 등의 이전의 연구는 다른 일반적으로 손상 부위를 통해 자신의 축삭을 재생하는 동안, 심지어 이러한 뉴런의 일부는 매우 낮은 재생 능력을 보여 SCI 후 기능 회복의 존재 (그들이 &quot;나쁜 재생기를&quot;으로 간주된다) 것으로 나타났다 (그들이 간주된다 &quot;g짐 우드 재생기 &quot;). 2,3이 특성은 칠성 장어에게 차례를 시도 뉴런의 고유 재생 능력의 차이로 이어질 것입니다 좋고 나쁜 재생기 척추 - 투사 신경 세포 간의 유전자 발현의 차이를 연구하는 재미있는 척추 동물 모델을 만드는 같은 외부 환경에서 축삭을 재생. 1 우리가 이전에 보여 주었다이 모델을 사용하여 척추 - 투사 각각 netrin와 RGM의 억제 작용을 매개 UNC5 4,5 및 neogenin, 6 등의 축삭지도 분자 수용체의 낮은 재생 능력 쇼 식 뉴런. 또한,이 방법을 사용하여 우리의 그룹은 단지 좋은 재생기가 손상 후 및 재생 공정 동안에 neurofilaments의 표현의 회복을 보여주는 것으로 나타났다. 최근 부시 모건 7은 나쁜 재생기가 increas를 표시하는 면역에 의해 보여 주었다&quot;나쁜 재생기&quot;척추 - 투사 신경 세포가 서서히 완전한 척수 절개의 5,7,8 후 사망 사실을 저자가 관련되어 부상 후 시누 클레인의 에드 표현. 그래서 완전한 척수 손상의 칠성 장어 모델은 척수 투사 신경 세포 axotomy 후 &quot;나쁜 재생기를&quot;무엇이 이해하는 매우 유용한 모델로 등장했다. 우리는 현장 하이브리드 화에 wholemount 수행 손상 후 원하는 시점에서 완전한 척수 절개 수술 프로토콜과 후방 뇌 해부를 수행하는 우리의 연구를 수행합니다. 본 방법론 기사에서 우리는 애벌레 칠성 장어의 완전 척수 손상 수술의 적절한 성능에 대한 자세한 프로토콜을 제시, 동물의 후속 유지 보수 및 현장 하이브리드 화에 wholemount에 대한 최종 뇌의 해부 및 뇌의 준비. 자세한 프로토콜 퍼가기합니다유생 칠성 장어의 뇌에서 원위치 혼성화 wholemount을 rform는 이전에보고 된 바있다. 9는 또한, 척수 손상 및 뇌 해부 본 프로토콜은 또한 다음, 면역 조직 화학 또는 다른 조직 학적 방법에 대한 뇌를 처리하는 데 사용될 수있다.

<table><tbody>희생 메스를 위한 <tr><td>PBS의 트리카인 메탄 설포네이</td>트 <td>스펙트럼</td><td>TR108</td><td>벤조카인 포화 용액</td></tr><tr><td>#3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>메스용 블레이드: #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 가위 #8</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>겸자 #4 & #5</td><td>Dumont, Switzerland</td><td>Roboz RS4955</td><td>#4 척수 해부용; #5 수갑 박리용</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Co.</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>곤충 핀 0.15, 0.20 mm</td><td>Austerlitz</td> <td>뇌 및 척수 고정을위한 카탈로그 # 0.15 mm; 몸 0.20 mm</td><td></td></tr> <tr><td>캡이있는 7 ml HDPE 섬광 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 16 %</td> <td>전자 현미경 과학 (EMS)</td> <td>19210</td><td>PBS에서 4 %로 희석</td></tr></tbody></table>

이후 wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

완전 척수 손상 후 처음 바다 칠성 장어는 절개의 수준 이하로 마비된다. 그러나, 몇 주 후에 운동력을 복구하고,이 propriospinal 축삭 및 뇌간으로부터 돌출-척수 축삭의 재생 단거리 (몇 mm)을 동반한다. 36 대 식별 척추 - 투사 신경 세포 중 일부는 좋은 재생기가 있고 다른 사람은 나쁜 재생기입니다. 이 신경 세포는 쉽게 wholemount CNS 준비에 식별 할 수 있습니다. 선호하는 신경 세포 고유의 메커니즘을 이해하거나 척추 동물의 중추 신경계에 손상 후 축삭 재생을 억제하기 위해, 우리는 좋고 나쁜 재생기 간의 유전자 발현의 차이를 결정하는 방법과 표현은 척수 절개에 의해 영향을 받는다. 이 논문은 미세한 비전 아래 완전 척수 transections을 생산하고, BR을 준비하고, 신선한 물 탱크에서 주택 애벌레에 대한 기술과 최근 변화 성인 바다 칠성 장어를 보여줍니다아인 및 현장 하이브리드에 대한 척수 wholemounts. 간단히, 동물은 16로 유지됩니다 &#160; C를 °와 칠성 장어의 벨소리에 1 %의 벤조 카인에 마취. 척수 등쪽 접근 방식을 통해 홍채 절제술 가위로 가로로하고, 동물은 23 ° C에서 신선한 물 탱크에 복구 할 수 있습니다. 현장 하이브리드의 경우, 동물 reanesthetized하고 뇌와 코드가 지느러미 접근 방식을 통해 제거했다.

이 방법을 사용할 때 얻을 수있는 결과의 예를 들어, 식별 척수-돌출 제어의 신경 세포와 이주의 neogenin 성적 증명서의 발현을 보여주는 wholemounted 뇌의 대표 이미지는 병변 애벌레 바다 칠성 장어는 그림 2에 나타내었다 게시 할 수 있습니다. 독자는 완전한 척수 절개 및 자세한 사항은 바다 칠성 장어의 신경 세포를 돌출 식별 척수의 재생 능력 후 neogenin의 표현 사이의 관계를보고 이전의 연구 (6)라고합니다. 간략하게, 결과는 식별 척수 손상 후 신경 세포 - 돌출 neogenin 수용체의 발현에 변화가 있음을 보여 주었다. neogenin 수용체 우선적 M1, I1, I2, I4, 또는 M의 뉴런 (도 2b 참조)이 결과는 결과를 보여 같은 나쁜 재생기로 표현되는 완전한 척수 절개 후 두 주및 프로토콜의 neogenin 수용체가 이들 세포의 재생의 실패에 관여 할 수 있음을 시사한다. <p class="jove_c...

칠성 장어는 완전 척수 손상 후 운동을 복구 할 수 있습니다. 그러나 일부 척추 - 투사 뉴런 좋은 재생기하고 다른 사람은 없습니다. 이 문서는 완전한 척수 transections 생산 및 현장 하이브리드에 대한 wholemount 뇌와 척수를 준비, 주택 바다 칠성 장어 유생 (최근 변화 성인)에 대한 기술을 보여줍니다.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜<em&gt; 제자리에서</em&gt; 애벌레 바다 장어의 하이브리드

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 손상 후 축삭 유도를 연구하기 위해 척수의 완전 절단 및 뇌 해부를 수행하는 것입니다. 이는 먼저 칠성장어 척수의 다섯 번째 아가미 높이에서 절단을 수행함으로써 이루어집니다. 그 후 뇌를 해부하여 Sylgard 위에 핀으로 고정합니다.뇌를 고정한 후에는 메탄올에 보관하거나 즉시 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)에 사용할 수 있으며, 궁극적으로 척수 손상 후 재생되는 척추에서 축삭 유도 수용체의 발현 변화를 확인할 수 있습니다. 오늘 시연할 기술이 기존의 일반적인 파라핀 섹셔닝이나 크라이오스탯 섹셔닝보다 유리한 점은, 척수로 투사하는 크고 식별 가능한 뉴런을 포함하여 뇌 전체를 관찰할 수 있다는 것입니다.실험 절차를 시연하는 분은 본 연구실의 연구원인 Kathy Zang 박사입니다. 미시간 호수로 유입되는 지류부터 펜실베이니아주의 델라웨어강, 또는 메인주의 하천에서 야생형 *Petromyzon marinus* 종의 바다칠성장어 유생을 수집하였습니다.4~7년생 유충은 길이가 10~14 cm이며, 손상 유도 및 해부 실험을 하기에 충분한 크기입니다. 이들을 16 °C의 50갤런 담수 수조에 50~100마리씩 그룹으로 나누어 사육하십시오.칠어(lamprey)가 굴을 팔 수 있도록 수조에는 1인치 크기의 자갈 바닥재가 필요합니다. 수조에 추가하는 모든 물은 사용 전 최소 48시간 동안 활성탄 여과 및 폭기를 통해 컨디셔닝 과정을 거쳐야 합니다. 동물을 1년 이내에 사용하는 경우, 본 실험 절차를 위해 별도로 먹이를 줄 필요는 없습니다. 갓 준비한 링거액(ringer solution)을 즉시 사용할 수 있도록 준비하십시오.먼저 lampe를 포화 벤조카인 수용액으로 옮깁니다. 마취가 되면, sil guard가 절반 정도 채워진 접시로 옮깁니다. 접시를 얼음 위에 올리고 접시의 나머지 부분을 얼음으로 채웁니다.냉각 링거액을 처리합니다. 코 부분에 하나, 다섯 번째 아가미 쪽에 두 개씩 총 세 개의 직경 0.15 곤충 핀으로 동물을 고정합니다. 그런 다음 수술을 위해 실체 현미경 아래에 배치합니다.11번 메스를 사용하여 다섯 번째 아가미 높이의 등쪽 정중선을 따라 세로로 절개하십시오. 절개 과정에서 척수가 드러나게 됩니다. 곤충 핀으로 만든 후크 2개와 Castro reveal 8번 가위를 사용하여 체벽을 고정하십시오.노출된 척수를 가로질러 수직으로 절단합니다. 척수의 절단단을 검사하여 횡단이 완전히 이루어졌는지 확인합니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 절단단을 다시 정렬하고 상처 부위를 봉합합니다.링거 용액에 적신 여과지 위에 칠성장어 유생을 옮깁니다. 상처가 마를 수 있도록 준비된 시료를 얼음 위에 1시간 동안 둡니다. 그 후 유생을 얼음처럼 차가운 물이 담긴 개별 소형 수조로 옮깁니다.그 상태로 24시간 동안 치유되도록 둡니다. 24시간 후, 절단 부위에 수직인 방향으로 움직임이 있는지 확인합니다. 움직임이 관찰된다면, 절단이 불완전하게 이루어진 것입니다.이상 징후가 없다면 절단술이 성공적으로 이루어진 것이며, 동물이 회복되는 동안 실온 수조로 옮겨 회복시킬 수 있습니다. 물은 2~3일마다 교체하십시오. 절단술을 받은 동물이 충분히 회복되면, 앞서 설명한 대로 마취 후 해부를 준비합니다.뇌를 해부하려면 콧구멍과 송과선 사이를 횡단 절개하는 것으로 시작하십시오. 그다음 핀셋으로 동물을 고정한 상태에서 Castro-Veal 가위로 뇌 주변 조직을 절개하십시오.뇌줄기 양쪽에 위치한 흰색 타원형 구조물은 이낭(otic capsules)입니다. 뇌가 노출되면 핀셋을 사용하여 맥락총(choroid plexus)을 제거하십시오. 다음으로, 변형된 핀 훅(pin hooks)을 사용하여 동물의 머리 부분을 벌리고 뇌신경을 노출시킵니다.그런 다음 핀셋으로 척수를 고정한 상태에서 가위로 척수를 횡단면으로 절단합니다. 뇌를 적출하기 위해 뇌신경을 절단합니다. 그 후 뇌를 작은 실리콘 조각 위로 옮겨 고정합니다.곤충 핀 하나를 척수에, 다른 핀 하나를 후각구 중 하나에 꽂습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 배측 정중선을 따라 후각구 교차, 대뇌교차 및 뇌간의 oex를 절단합니다. 교차부와 oex가 절단되면, A LR 판을 측면으로 젖혀 총 7개의 곤충 핀(후각구에 2개, 절단된 대뇌교차 가장자리에 2개, 확장된 oex에 2개, 척수 정중선에 1개)을 사용하여 실리콘 위에 평평하게 고정합니다.이제 RNA 분해효소 제거 시약(RNase-free reagents)을 사용하여, 실온에서 3시간 동안 완만하게 흔들어주며 4% paraformaldehyde로 시료를 고정합니다. 이후 기술된 방법에 따라 in situ hybridization을 통해 뇌를 분석할 수 있습니다. 대조군 동물과 손상 후 2주가 지난 동물의 척수 및 투사 뉴런에서 neogen 전사체의 발현이 확인되었습니다. 여기에 제시된 것은 대표적인 비손상 대조군입니다.완전 척수 절단 후, neogen 수용체의 발현에 변화가 있었습니다. 2주 후, 비대조군에서의 neogen 수용체는 M1 I one I two I four 또는 MTH 뉴런과 같은 재생 능력이 낮은 세포에서 우선적으로 발현되었습니다. 이 기술의 개발은 동일한 뇌 내에서 가이드 수용체, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 수용체의 발현 및 cast base의 활성화를 탐색할 수 있는 기반을 마련하였습니다.

complete-spinal-cord-injury-brain-dissection-protocol-for-subsequent

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 주사 전자 현미경(SEM)과 투과 전자 현미경(TEM)의 요소를 결합하여 고해상도 이미지를 생성하는 기술인 대규모 주사 투과 전자 현미경(STEM)을 사용하여 제브라피시 유충의 뇌 손상을 조사하는 방법을 보여줍니다. 뇌 손상을 식별하기 위해 샘플을 준비하고 고해상도 STEM 이미지를 획득하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

Investigating a a Zebrafish Larval Brain Injury Using Large-Scale Scanning Transmission Electron Microscopy(대규모 주사 투과 전자 현미경을 사용한 제브라피시 유충 뇌 손상 조사)

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

시냅스 전 방출 안면막에서 Ca2+ 전류를 기록하는 것은 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 정확하게 이해하는 데 중요합니다. 우리는 기능적으로 고립된 망상척수 축삭돌기를 생성하는 lamprey 척수의 급성 해리를 제시하여 개별 시냅스전 말단의 방출면 막에서 직접 기록할 수 있습니다.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

우리는 축삭돌기 및 미엘린 손상의 역학을 실시간으로 동시에 시각화하기 위해 이광자 여기 타임 랩스 현미경을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 제안된 프로토콜은 손상 후 중심 수초화된 축삭돌기의 운명에 영향을 미치고 영구적인 임상적 장애에 기여할 수 있는 내적 및 외적 요인에 대한 연구를 가능하게 합니다.

전의 VIVO 레이저에 의한 척수 손상 모델은 실시간으로 축삭 변성의 메커니즘을 평가하기 위해

탈수초 질환은 리솔레시틴을 중추신경계에 국소적으로 적용하여 동물에서 모델링할 수 있습니다. 쥐의 척수에 리솔레시틴을 한 번 주입하면 시간이 지남에 따라 자발적으로 복구되는 병변이 생성됩니다. 목표는 탈수초화 및 재수초화와 관련된 요인을 연구하고 수리를 강화하기 위한 에이전트를 테스트하는 것입니다.

리소 레시틴의 초점 주사 실험 탈수 초화 및 설치류 척수의 재유 수화

대규모 2D 전자 현미경(EM) 또는 나노토미는 나노 단위 해상도 EM의 조직 전체 응용 분야입니다. 여기에서는 제브라피시 유충의 뇌의 건강과 비침습적 뇌 손상을 조사하기 위해 적용되는 보편적인 나노절개술 방법을 설명합니다.

건강 및 부상 Zebrafish의 두뇌의 대규모 스캐닝 투과 전자 현미경 (Nanotomy)

이 원고는 제브라 피쉬 배아 및 유충의 척수 신경 세포에서 전기 생리 녹음하는 방법을 설명합니다. 준비는 현장에서 뉴런을 유지하고 자주 최소 절개를 포함한다. 이 방법은 초기 애벌레 단계를 통해 초기 전기 흥분의 인수, 척추 신경의 다양한 전기 생리학 연구 할 수 있습니다.

Zebrafish의<em&gt; 시츄</em&gt; 척수 척추 감각과 운동 뉴런 전기 생리 녹음 준비

우리는 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (TBI) 및 후속 신경 재생의 기초 메커니즘에 따라 병리학의 폭을 검사하기 위해 성인 얼룩말 물고기에 대한 Marmarou 체중 드롭 모델을 수정했습니다. 이 무딘 힘 TBI 모델은 확장 가능, 온화한 유도, 보통, 또는 심한 TBI, 인간의 TBI에서 관찰 부상 이질성을 다시 수상.

성인 얼룩말 피시의 무딘 힘 부상의 효과를 연구하는 확장 가능한 모델

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

Xenopus laevis 올챙이 척수 transection은 흉부 수준에서 척수를 완전히 절단하는 횡단 절단을 만들어 척수 손상 및 재생을 연구하는 관련 손상 방법입니다.

Xenopus laevis Tadpoles의 척수 Transection

학습하세요 척수 손상 후 축삼 안내 메커니즘을 연구하기 위한 바다 장어의 완전한 척수 절단 및 뇌 해부 기법을. 이 방법은 재생 능력이 있는 척수 투사 뉴런을 분석하여 척수 재생에 대한 통찰을 제공합니다.

이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜

더 많은 동영상 탐색