이후 Wholemount을위한 완벽한 척수 손상 및 뇌 해부 프로토콜 제자리에서 애벌레 바다 장어의 하이브리드

이 절차의 전반적인 목표는 부상 후 Axon 안내 연구를 위해 완전한 척수, 절개 및 뇌 절개를 수행하는 것입니다. 이것은 다섯 번째 아가미 수준의 lampre 척수인 첫 번째 transecting에 의해 수행됩니다. 그런 다음 뇌를 해부하여 실 가드에 고정합니다.

뇌를 고정한 후 메탄올에 저장하거나 즉시 제자리 혼성화에 사용할 수 있으며 궁극적으로 축삭 발현의 변화를 일으킵니다. 안내 수용체(guidance receptor)는 척수 손상 후 재생하는 척추뼈에서 볼 수 있습니다. 기존의 파라핀 절편 또는 저온 유지 절편에 비해 오늘 시연할 기술의 장점은 척수에 돌출된 뉴런을 포함하여 크고 식별된 뇌 전체를 볼 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 연구 과학자인 Kathy Zang 박사입니다.미시간 호수 지류에 물을 공급하는 개울에서 펜실베이니아의 델라웨어 강 또는 메인의 개울로 이동합니다. 야생형 애벌레 바다 lampre 종의. 마루스의 애완용 마이즈를 획득했습니다.

4-7 세의 유충은 길이가 10-14cm이며 부상과 해부에 충분히 큽니다. 52명, 100명씩 무리를 지어 관리하십시오. 섭씨 50도의 담수 탱크에서 16갤런

탱크에는 1인치 자갈 기질이 필요하므로 lamprey는 탱크에 추가되는 모든 물을 탱크에 추가하기 전에 최소 48시간 동안 숯 여과 및 폭기로 컨디셔닝해야 합니다. 1년 이내에 동물을 사용하는 경우 이 절차를 위해 동물에게 먹이를 줄 필요가 없습니다. 갓 준비한 링거 용액을 준비하십시오.

첫째로 램프를 포화된 수성 benzocaine 해결책에 옮기십시오. 마취가 끝나면 실 가드로 반쯤 채워진 접시에 옮깁니다. 접시를 얼음에 올리고 얼음을 얹습니다.

콜드 링거. 0.15 직경의 곤충 핀 3개(주둥이에 하나, 다섯 번째 아가미에 두 개)로 동물을 고정합니다. 그런 다음 수술을 위해 실체 현미경 아래에 놓습니다.

숫자 11 메스를 사용하여 5번째 아가미 수준에서 등쪽 정중선을 따라 세로로 절개하는 것으로 시작합니다. 이렇게 하면 절개를 하는 동안 척수가 드러납니다. 곤충 핀으로 만든 두 개의 고리를 사용하여 카스트로 공개 8 번 가위를 사용하여 신체 벽을 고정합니다.

노출된 척수를 수직으로 자릅니다. 척수의 절단된 끝을 검사하여 절개가 완료되었는지 확인합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 절단 끝을 다시 정렬하고 상처를 봉합합니다.

lampre 용암을 링거 용액에 적신 여과지 조각에 옮깁니다. 한 시간 후에 상처가 마를 수 있도록 준비물을 얼음 바닥에 한 시간 동안 옮깁니다. 용암을 얼음처럼 차가운 물이 담긴 작은 탱크로 옮깁니다.

24시간 동안 치유되도록 하십시오. 24시간 후 횡단면으로의 움직임을 확인하십시오. 움직임이 있으면 횡단이 불완전한 것입니다.

그렇지 않은 경우 transect가 양호한 것이며 동물이 회복하는 동안 회복을 위해 동물을 실온 탱크로 옮길 수 있습니다. 2-3일에 한 번씩 물을 갈아주세요. 전이된 동물이 충분히 회복되면 마취하고 앞서 설명한 대로 해부할 준비를 합니다.

뇌를 절개하려면 콧구멍과 송과체 기관 사이의 횡방향 절개부터 시작합니다. 그런 다음 카스트로 송아지 고기를 가위로 뇌를 둘러싼 조직을 자르고 동물을 고정시킵니다. 겸자 포함.

뇌간의 양쪽에 있는 흰색 타원형 구조는 이낭입니다. 뇌가 노출되면 집게를 사용하여 맥락막신경총을 제거합니다. 다음으로, 변형 된 핀 고리를 사용하여 동물의 머리를 펴고 뇌 신경을 노출시킵니다.

그런 다음 가위로 척수를 가로로 자르고 집게로 척수를 고정합니다. 뇌신경을 잘라 뇌를 해부한다. 그런 다음 뇌를 작은 실리콘 조각으로 옮기고 거기에 고정시킨다.

척수에 있는 곤충 핀 하나와 후각 전구 중 하나를 통한 핀 하나를 사용합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 등쪽 정중선을 따라 대뇌 보호구 commissure 및 뇌간의 oex를 자릅니다. commissures와 oex가 절단되면 A LR 플레이트를 측면으로 편향시키고 총 7개의 곤충 핀(후각 전구에 2개, 절단 가장자리에 2개, 확장된 oex에 2개, 척수 정중선에 1개)으로 실리콘에 평평하게 고정합니다.

이제 RNA free 시약을 사용하여 실온에서 3시간 동안 부드러운 교반으로 4%para 포름알데히드로 제제를 고정합니다. 그런 다음 뇌는 척수에서 확인된 전사체에서 네오겐의 발현을 기술한 방법을 사용하여 현장 2 교잡에 의해 분석할 수 있으며, 대조군, 동물 및 동물의 돌출 뉴런이 확인되었습니다. 여기에서 볼 수 있는 병변 후 2주가 지난 것은 대표적인 부상이 없는 대조군입니다.

완전한 척수 절제 후 신생 수용체의 발현에 변화가 있었습니다. 2주 후, 비대조군의 네오젠 수용체는 M1 I one I two I four 또는 MTH 뉴런과 같은 나쁜 재생기에서 우선적으로 발현되었습니다. 이 기술의 개발은 안내 수용체의 발현, 콘드로이틴 설페이트, 프로티오, 글리칸에 대한 수용체 및 캐스트 염기의 활성화를 모두 동일한 뇌에서 탐구할 수 있는 능력을 위한 길을 열었습니다.