Name: 미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 미세 유체 제트를 이용한 인지질 이중층 소포 생성 방법을 통해 막 비대칭성과 단백질 삽입을 정밀하게 제어하는 기술입니다. 이 방법은 세포 내 구획화된 생분자 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 microjetting 매개 변수에 대한 조언 버클리 캘리포니아 대학의 플레처 연구소에서 마이크 Vahey 감사합니다. 이 작품은 NIH 보조금 HL117748 DP2-01가 후원했다.

1. 무한 상공 회의소 제작 <ol><li> 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 (모양의 이름을 딴) 무한대 실을 디자인하고, 레이저 커터와 호환되도록 파일을 저장합니다. 레이저 커터와 투명 아크릴에 1/8- 3 / 16에서 실을 잘라 인치 0.15의 중심 간 거리를이 모양, 직경 0.183의 분리 된 두 개의 원을 만들 수 있습니다. 무한대 모양이 물방울 인터페이스 이중층의 형성과 안정성을 용이하게한다. </li><li> 무한 형 웰에 아크릴 챔버의 에지를 통해 1 / 16에서 구멍을 드릴. 반대편에 반복합니다. 가위로 0.2 mm의 아크릴 시트 또는 우물 바닥 역할을 레이저 커터에서 작은 사각형을 잘라. </li><li> 0.2 mm 아크릴 한쪽 속건성 접착제의 얇은하지만 완전한 층을 적용하고 상기 챔버의 하부에 접착제. 챔버의 바닥에 단단히 자리에 0.2 mm의 아크릴을 잡고 분배접착제는 밀봉을 생성하지만, 가시 영역을 커버하는 방지 할 수 있도록하는 인터페이스에서의 접착제. 가장자리가 챔버 벽의 가장자리에 닿을 때와 완전히 무한대 실 컷 아웃을 덮도록 아크릴을 정렬해야합니다. 이것은 충분한 제트 침투를 허용하고 잘의 누출을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 드릴 구멍을 커버하는 천연 고무의 두 개의 작은 조각을 잘라. 구멍 주위 속건성 접착제를 적용합니다. 고정 집게 한 쌍의 모든 영역에 구멍을 누릅니다에 고무를 배치합니다. 두 드릴 구멍을 반복합니다. 누출을 방지하기 위해 모든 접착 연결이 완료 밀봉되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 바늘 (23) G, 1을 사용하여, 압전 잉크젯 팁의 삽입을 용이하게하기 위해 챔버의 양면에 천연 고무에 구멍을 찌를. </li></ol> 2. 실험 준비 -20 ° C 냉동고에 클로로포름 매장 재고 지질 솔루션입니다. 본 연구의 경우, 1,2 - diphytano 하나일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DPhPC) 1,2-dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DOPC)을 사용 하였다. 2 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 지질 솔루션은 일반적으로이 프로토콜에 준비하고 -20 ℃에서 저장 될 때 두 달 동안 지속됩니다 <ol><li> N-데칸의 지질을 재현 탁하려면 먼저 작은 유리 항아리에 재고 유리 병에서 전송하고, 아르곤, 질소 하에서 부드럽게 건조. 지질 빨리 건조 할 수 있도록 가스 자세히 표면적을 노출하면서 건조 각도 항아리 잡아. </li><li> 약간에 나사 항아리의 뚜껑으로, 건조 된 솔루션은 1 ~ 2 시간 동안 건조기 진공 아래에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음 25 ㎎ / ㎖에서 지질을 resolubilize하려면 n-데칸을 추가합니다. 소용돌이 지질 솔루션 짧게 15 분 동안 목욕 초음파 분쇄기에 초음파 처리. -20 ℃에서 N-데칸의 재구성 지질을 저장 </li><li> 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 1.5 ML microcentrifuge 관에 300 밀리미터 자당의 900 μL, 100 μL를 추가1 % 메틸 셀룰로오스 (MC)의. 메틸 셀룰로오스는 분사에 도움 용액의 점도를 증가 추가됩니다. 선택 단계 : 각각 이미지에 더 많은 대비 또는 형광을 빌려 어두운 색의 식품 염료 또는 형광 구슬의 선택 1 μl를 추가합니다. 이 용액은 세포 삼투압 일치하고 microjetting 중에 콘트라스트를 제공하도록 설계 300 mOsm 자당 용액이다. </li><li> 일회용 1 ㎖ 플라스틱 주사기로 솔루션을 그립니다. 끝이 위쪽으로 향하도록 주사기를 들고 있지만, 끝을 향해 모든 거품을 추방하기 위해 반복적으로 샤프트를 가볍게하고, 갇힌 공기를 배출하는 플런저를 밀어 넣습니다. 이 분사에 대한 책임 적절한 압전 수축을 방해하므로, 진행하기 전에 주사기에서 모든 공기를 대피해야합니다. </li><li> 주사기의 단부에 0.22 ㎛의 필터를 설치. 필터에 포집되는 공기를 방지하기 위해 수직으로 주사기를 잡고 물방울이 팁 위에 형성 될 때까지 플런저를 밀어 넣습니다. 참고 :33mm 직경의 주사기 필터 유닛은 가장 잘 작동하는 것으로 확인되었지만, 3mm 직경 주사기 필터의 소형 대체 필터는 데드 볼륨을 줄이기 위해 사용될 수있다. </li><li> 잉크젯의 여성 루어 어댑터를 풉니 다, 안전하게 필터의 말을 통해 장소에 키를 누릅니다. 또, 공기를 포집 방지하기 위해 유체를 꺼냅니다. 잉크젯의 상단에 고정합니다. 그것은 완전히 부착 한 후 유체는 잉크젯의 끝을 이동해야합니다. </li></ol> 3. 장비를 준비하고 <ol><li> V-클램프를 사용하여, 현미경 스테이지 주사기 장착 조립체. 잉크젯 컨트롤러에 잉크젯에서 와이어를 연결합니다. 참고 : 지정 단계는이 프로토콜에 대한 지어진; 스테이지 디자인이 사용자에 의해 결정될 수 있지만, 주사기 및 샘플 홀더의 XY 제어 독립적 XYZ 컨트롤을하는 것이 중요하다. </li><li> 원하는 영상을 달성하기 위해 확대하고 필요한 렌즈의 조합을 결정합니다. 여기에 10 배 목표와 10 배의 접안 렌즈가 사용됩니다. </li&gt; <li> 분사 및 소포 생성을 시각화하기 위해 고속 카메라 (≥ 1,000 fps)를 사용합니다. 이전 영상에 필요한 카메라 보정을 수행합니다. 이미지 캡처를 시작하기 위해 카메라 소프트웨어 내에서 이미지 기반의 자동 트리거를 사용합니다. </li><li> 현미경 무대에 무한 챔버를 탑재합니다. 무대에서 제자리에 테이핑에 의해 챔버를 고정합니다. </li><li> 조심스럽게 천연 고무에 구멍 구멍 (그림 1b 참조) 잉크젯 끝을 맞 춥니 다. 이렇게하려면 챔버에 가까운 잉크젯을 가져와 눈에 의해 위치를 조정하려면 다음 현미경 렌즈를 통해보다 정확한 조정. 거친 움직임 잉크젯 팁을 손상시킬 수 있으므로, 조심스럽게 진행합니다. </li><li> 잉크젯가 정렬되면, 웰의 로딩 중에 잉크젯 손상을 방지하기 위하여 멀리 챔버로부터 주사기 조립체 백. 이 막에있는 구멍과 정렬 유지되도록 잉크젯의 움직임은 단방향 있는지 확인합니다. </li><li> plun에 부드럽게 누르십시오잉크젯 노즐의 작은 액적 형성 될 때까지 주사기 조립체의 GER. 이것은 몇 가지 초기 배압을 제공 할 것입니다. </li><li> 입력 분사 매개 변수를 설정합니다. 사다리꼴 바이폴라 파 들어, 다음과 같은 매개 변수 사용 : 20 kHz의 펄스 주파수 3 마이크로 초 상승 시간, 35 마이크로 초 펄스 지속 시간, 3 μsec는 하강 시간, 65 V의인가 전압 (펄스 진폭) 및 트리거 당 100 분사 펄스 (펄스 수) . 그러나,인가 전압 (펄스 진폭)과 펄스 수 (트리거 당 분사 펄스) 소포 크기를 제어하기 위해 변할 수있다. </li></ol> 4. 소포 세대 <ol><li> 두 우물의 전체 표면을 덮고, 무한대 실에 N-데칸에 현탁 25 ~ 30 ㎕의 지질 솔루션을 추가합니다. </li><li> 잘 하나, 피펫 천천히 부드럽게의 바깥 쪽 가장자리 (자당 솔루션과 같은 삼투압의) 25 μL의 포도당을 추가합니다. 포도당 및 지질 용액을 혼합하지 않기 때문에, 성막시, 글루코오스 방울 형성​​한다. 추가 다른 251, 또 다른 배달을 5 ~ 10 분 이내에 챔버의 중앙에있는 지질 이중층 막을 형성 할 것이다 반대 아니라, 포도당의 L. </li><li> 천연 고무를 통해 잉크젯를 삽입하고 조심스럽게 방울 인터페이스 이중층을 향해 안내합니다. 소개 잉크젯 볼륨을 치환하고 이중층 파열 수, 천천히 이중층 접근. </li><li> 잉크젯 ~ 200 ㎛ 이내 인 경우, 단계 3.8에 설명 된 설정을 사용하여 분사를 적용합니다. 이중층에서의 거리가 다른 매개 변수들 사이의 전압 펄스 수에 따라 주로 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 천천히 설정 (전압 펄스 수)을 증가시키고, 이중층의 변형을 관찰하는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 장비를 청소 <ol><li> 현미경 단계에서 주사기 어셈블리를 분리하고, 1 ㎖의 플라스틱 주사기 필터 처리. </li><li> 잉크젯을 청소하려면 solutio의 끝을 찍기 위해 다음과 같은 솔루션을 대기음N 7 배 각 : 따뜻한 물, 70 % 에탄올 및 DDH 2 O.에서 70 % 에탄올, 2 % Neutrad 솔루션 잉크젯 흡인 피펫에 안전하게 맞지 않으면 어댑터를 형성하기 위해 피펫 팁을 잘라. </li><li> 티슈로 챔버를 건조. 5 ~ 10 분 동안 2 % V / V의 따뜻한 물에 Neutrad 및 초음파 처리와 함께 250 ㎖의 비이커에 무한대 실을 배치합니다. 초음파 후, 철저하게 압축 공기에서 우물을 건조. 웰에있는 습기는 지질 이중층 막 안정성을 손상시킬 수 있으므로, 또한 챔버가 15 분 동안 60 ° C의 오븐에서 배치되는 것이 추천된다. </li></ol>

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li>
<li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li>
<li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition%2C+asymmetry%2C+and+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Soc.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Phys%22%5BJournal%5D)">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li>
<li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Disc.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li>
<li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments%3A+The+Use+of+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li>
<li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li>
<li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li>
<li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li>
<li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li>
<li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li>
<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li>
<li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

대부분의 기술은 electroformation, 에멀젼, 비말 세대 14-16를 포함, 소포 생성을 위해 개발되었다. 그러나 새로운 실험 기술은 생명체에 성장 유사성 생물학적 시스템의 설계를 허용 할 필요합니다. 특히 미세 유체 방법은 가까운 생물학 소포 모델을 가져, 막 unilamellarity 크기의 단 분산, 내부 내용 (17, 18)을 관리하는 컨트롤의 증가 수준을 제안했다. 또한, 미세 유체 분사를 사용하여 특성과 실험 효과 중심의 막 단백질의 결합, 막 비대칭, 캡슐화 3,13을 보여 주었다. 이 기술은 간단하지만주의가 이동해야합니다 몇 가지 단계가 포함되어 있습니다. 아크릴 시트와 천연 고무는 모두 제조시 무한대 실에 완전한 밀봉을 형성해야합니다. 그렇지 않으면, 무한대 모양의 우물 누출 R 것입니다ISK 이중층 안정성. 실험 준비를하는 동안, 연구원은 초기에 각 구성 요소를 연결 한 후, 전체 공기의 ...

<html> 그것은 세포 생물학은 분자에서 세포에 대한 우리의 이해를 통합 포함하는 멀티 스케일의 문제가 점점 명백 해졌다. 따라서, 분자가 개별적으로 작동하는 방법을 정확하게 아는 것은 복잡한 세포의 행동을 이해하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 이것은 5를 추출 Xenopus의 지질 이중층 소포 4, 유사 분열 스핀들 어셈블리와 액틴 네트워크 상호 작용의 재구성에 의해 예시 된 바와 같이, 부분적으로 다 성분 시스템의 긴급 행동이 존재하는 것이며, 세균 세포 분열 기계 (6)의 공간적 역학. 생명체의 분자 프로세스를 해부의 환원의 접근 방식을 보완하는 방법 중 하나는 생물학적 최소 구성 요소를 사용하여 세포의 행동을 재구성의 반대 접근을하는 것입니다. 이 방법의 중요한 부분은 제한된 양의 생체 분자의 믿을 수있는 캡슐, 세포의 핵심 기능을 포함한다. e_content &quot;&gt; 여러 가지 전략이 생체 모방 시스템을 공부 생체 분자를 캡슐화 존재한다. 가장 생물학적으로 관련 시스템이 세포의 세포막에 의해 부과 된 생화학 적 및 물리적 제약을 모방. electroformation 7로 거대한 단일 층 소포 (GUVs)의 형성 지질 이중층 막이다, 정제 된 단백질 작업에 문제가 될 수 GUV 세대 14에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, 일반적으로 높은 소금 버퍼 (8)과의 비 호환성으로 인해 가난한 캡슐화 수율을 가지고 있습니다. Electroformation 또한 많은 양의 샘플이 필요합니다 (&gt; 100 μL), , 비효율적 근접한 지질 층 사이 확산의 어려움으로 인해 큰 분자를 포함한다. 지질 소포를 생성하기위한 여러 가지 미세 유체 접근 방식. W / O (레이어 물 - 기름 - 물 사이에 두 개의 인터페이스를 통해 구성 요소를 전달하는 이중 에멀젼 방법을 개발 한 / W), 할머니의 증발에 의존지질 이중층 형성 9를 구동 할 latile 용매. 기타 지질 이중층 소포 (10) 또는 두 개의 독립적 인 단계 (11)에서의 연속적인 스트림을 생성 미세 조립 라인을 사용했다. 우리는 빠르게 조절 크기, 조성, 및 캡슐화 GUVs 생산하는 액적 인터페이스 이중층 (12)에 대해 유체 펄스를인가에 기초하여 대안적인 기술을 개발했다. 미세 유체 분사로 알려진 우리의 접근 방식은 생물학적 다양한 문제를 조사하는 기능 생체 분자 시스템을 만들기위한 접근 방식을 제공, 기존의 여러 소포 세대​​ 기술의 결합 된 이점을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>압전 잉크젯</td><td>MicroFab Technologies</td><td>MJ-AL-01-xxx</td><td>xxx는 오리피스 직경(미크론</td></tr>)을 나타냅니다. <tr><td>Jet Drive III 컨트롤러</td><td>MicroFab Technologies</td><td>CT-M3-02</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라</td><td>Vision Research</td><td>MiroEX2</td><td></td></tr><tr><td>DPhPC 클로로포름 지질</td><td>Avanti</td><td>850356C</td> 바이알 33mm PVDF<td>에 담긴 작은 부분 표본으로 주문</td></tr><tr><td> 필터, 0.2 &마이크로; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Acros Organics</td><td>111871000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Acros Organics</td><td>410950010</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9084958</td><td></td></tr><tr><td>1/8 인치 아크릴</td><td>McMaster Carr</td><td>8560K239</td><td>CAD 디자인은 요청에 따라 제공됩니다.</td></tr><tr><td>0.2 mm 아크릴</td><td>Astra 제품</td><td>Clarex clear 001</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 시멘트</td><td>TAP Plastics</td><td>10693</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495 Superglue</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9011323</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 3494 UV 강화 접착제</td><td>스트로벨 공급</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>천연 고무</td><td>McMaster Carr</td><td>85995K14</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 무대</td><td>수제</td><td>N / A</td><td>CAD 디자인은 요청시 제공됩니다</td></tr></tbody></table>.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

상향식 합성 생물학은 잠재적 생화학 시스템과, 최소한의 생물을 조사하고 재구성을위한 새로운 접근 방식을 제시한다. 이 새로운 필드는 아래에서 위로 복잡한 작동 시스템에 기본적인 생물학적 구성 요소를 설계하고 조립하는 엔지니어, 화학자, 생물 학자, 물리학을 결합한다. 이러한 상향식 (bottom-up) 시스템은 기본적인 생물학적 문의 및 혁신적인 치료 1,2 인공 세포의 개발로 이어질 수 있습니다. 거대한 단일 층 소포 (GUVs는) 때문에 자신의 세포와 같은 막 구조와 크기로 합성 생물학에 대한 모델의 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 미세 유체 분사 또는 microjetting는 제어 크기, 막 조성, 막 횡단 단백질 내장 한 캡슐 3 GUVs의 생성을 허용하는 기술이다. 이 방법의 기본 원리는 현탁 L 변형하는 압전 구동 잉크젯 장치에 의해 생성 된 다수의 고주파수 유체 펄스를 사용하는 것이다GUV에 IPID 이중층. 이 과정은 비누 필름에서 비누 거품을 불고에 가깝다. 분사 용액 감싸는 용액의 조성, 및 / 또는 구성 요소의 구성을 변화시킴으로써 이중층에 포함 연구자 받아서 소포를 만드는이 기술을 적용 할 수있다. 이 논문은 microjetting에 의해 물방울 인터페이스 이중층에서 간단한 소포를 생성하는 절차를 설명합니다.

우리는 기계 가공 부품 및 수동 마이크로 미터에서 조립 된 사용자 정의 단계 (그림 1)와 기존의 거꾸로 형광 현미경의 미세 유체 분사 설치를 조립했다. 잉크젯의 특성은 소포의 생성 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 잉크젯 노즐 및 지질 이중층 사이의 거리를 변화하는 힘이 멤브레인의 변형을 야기하기 위해 적용에 영향을 미친다. 이중층에 근접는 제트 기류 초점을 맞추고 멀리 소포 세대​​의 관점에서 에너지를 분산에서 막을 수 없습니다. 와류 여행 예상치 (도 2)과 일치 압전 액츄에이터에인가되는 전압이 증가한다. 소포 형성 및 대표 소체는도 3에 도시되어 분사.도 3a는 microjetting 의해 소포 형성을위한 대표적인 이미지 시퀀스를 나타낸다. 형성 후, 소포 안정성 소포 diamete로 변화하는 경향R, 작은 소포는 안정 있었던 곳. <p class="jove_content" fo:keep-to...

물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

이 절차의 전반적인 목표는 막, 루멘, 몰 농도, 단분산성 및 내부 함량에 대한 제어력을 높인 인지질 이중층 소포를 생성하는 것입니다. CAD를 사용하여 아크릴 시트와 천연 고무로 챔버를 제작합니다. 챔버에 지질과 용액을 채워 부유 지질 이중층을 생성합니다.다음으로, 캡슐화할 용액이 담긴 잉크젯을 분사 장치에 설치합니다. 적절한 설정이 완료되면, 분사된 유체 펄스가 지질 이중층 소포를 형성하게 됩니다. 결과적으로, 미세유체 분사법을 통해 반복 가능한 단분산 이중층 소포를 얻을 수 있습니다.전기 형성, 에멀젼 또는 액적 생성과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 막, 단방향 몰 농도, 단분산성 및 내부 함량을 제어하는 수준이 높아졌다는 점입니다. 실험 절차는 대학원생 Johanna Harrow가 시연하고, 학부생 Kara Patel이 보조하겠습니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 레이저 커터로 아크릴을 통해 제작할 수 있는 챔버 모양을 그리십시오. 먼저 조립된 아크릴 챔버 양쪽에 1/16인치 관통 구멍을 하나씩 뚫습니다. 이 구멍을 통해 무한대 모양의 웰로 배출됩니다.둘째, 0.2 millimeter 아크릴 시트를 가위로 작게 직사각형 모양으로 잘라 무한대 모양의 바닥면으로 사용합니다. 관찰 영역에 접착제가 묻지 않도록 주의하며, 속건성 접착제를 사용하여 이를 제자리에 고정합니다. 아크릴 시트는 챔버 벽면에 밀착되어 챔버 바닥에 단단히 고정되어야 합니다.셋째, 속건성 접착제를 사용하여 드릴로 뚫은 구멍 위에 얇은 천연 고무 시트 조각을 붙입니다. 핀셋으로 눌러 고정합니다. 접착된 모든 이음새에 누설이 있는지 테스트합니다.없어야 합니다. 마지막으로, 23 gauge 바늘을 사용하여 드릴로 뚫은 구멍을 통해 고무에 구멍을 냅니다. 이 구멍들을 통해 압전 잉크젯 팁이 삽입될 것입니다. 시판 인지질은 chloroform에 녹여 -20 °C에서 보관해야 합니다.D-P-H-P-C 또는 DOPC 지질이 이 시연에 사용됩니다. 클로로포름에 용해된 지질을 바이알을 기울인 상태에서 유리 바이알로 옮긴 후, 아르곤 또는 질소 가스 하에서 지질을 천천히 건조시킵니다.그다음, 잔류 용매를 제거하기 위해 캡을 약간 느슨하게 닫은 바이알을 1~2시간 동안 진공 상태에 둡니다. 이 단계에서 데시케이터를 사용할 수도 있습니다. 이제 지질을 엔드 데킹(end decking)에 용해하여 최종 지질 농도를 25 mg/mL로 맞춥니다.용액을 볼텍싱합니다. 캡을 파라필름으로 짧게 밀봉한 다음 15분 동안 초음파 처리합니다. 이 용액을 -20 °C에서 보관하십시오.다음으로, 생체 내와 유사한 삼투압을 가진 자당(sucrose) 표준 용액을 준비합니다. 이것이 제팅 용액(jetting solution)이 됩니다. 대비를 높이거나 형광을 나타내기 위해 용액에 진한 색의 식용 색소 한 방울이나 형광 비드를 추가하는 것을 고려하십시오.포획된 공기를 제거하기 위해 1 mL 주사기에 자당 용액을 채웁니다. 주사기를 톡톡 쳐서 기포가 주사기 입구 쪽으로 올라오게 하여 배출합니다. 다음으로, 33 mm 0.22 µm 필터를 주사기에 장착하고 필터를 통해 한 방울을 밀어냅니다.이제 잉크젯의 암형 루어 어댑터를 풀고 필터 끝부분에 눌러 끼웁니다. 액체를 약간 밀어내어 갇혀 있는 공기를 제거합니다. 마지막으로, 잉크젯 액체 상단에 주사기를 부착합니다.주사기가 올바르게 장착되었다면 잉크젯 팁까지 도달해야 합니다. 먼저, 주사기 어셈블리를 현미경 스테이지에 장착하고 이번 실험을 위한 잉크젯 컨트롤러를 연결하십시오. 시각화를 위해 스테이지와 주사기가 모두 3차원으로 이동해야 하므로, 스테이지와 주사기는 각각 독립적으로 제어되어야 합니다.초당 최소 1000프레임 촬영이 가능한 고속 카메라를 설치하십시오. 녹화를 시작하기 위해 이미지 기반 자동 트리거링을 사용하도록 설정하십시오. 이제 테이프로 챔버를 스테이지에 고정하고, 잉크젯 팁을 챔버 측면 고무 시트에 뚫린 구멍에 조심스럽게 맞추십시오.먼저 육안으로 조정하고, 그 다음 현미경을 사용하여 미세 조정하십시오. 정렬이 완료되면, 주사기를 한 방향으로 뒤로 빼서 무한대 모양으로 로딩합니다. 그런 다음 플런저에 부드럽게 압력을 가하여 노즐에 액적(droplet)이 형성되도록 합니다.이는 초기 배압을 일부 제공합니다. 제팅 파라미터를 설정해야 합니다. 다음으로, 화면에 표시된 사다리꼴 양극성 파형의 특정 값들이 제시되며, 인가 전압과 트리거당 제트 펄스 횟수가 소포의 크기를 조절합니다.이제 챔버에 지질 용액 25~30 µL를 넣어 무한대 모양의 전체 표면을 덮습니다. 그런 다음 각 웰의 가장 바깥쪽 가장자리에 포도당 용액 25 µL를 천천히 그리고 부드럽게 피펫팅하여 추가하며, 이때 포도당이 지질 용액과 섞이지 않도록 주의하십시오. 10분 이내에 챔버 중앙에 지질 이중층이 형성됩니다.이중층은 불안정하며 준비 과정에 따라 파괴될 수 있으므로, 이중층을 설정하는 것이 가장 중요한 단계입니다. 인내심을 가지십시오. 챔버를 채우는 연습을 몇 번 반복하면 성공적으로 수행할 수 있을 것입니다.이제 잉크젯 팁이 액적 계면에서 200 microns 이내에 위치했을 때, 팁을 챔버 안으로 조심스럽게 다시 삽입하십시오. 지질 이중층(Bilayer) 상태에서 분사 공정을 시작하고 잉크젯을 사용하여 데이터를 기록하면 소포 생성 과정에 대한 통찰을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 잉크젯 노즐과 지질 이중층 사이의 거리를 조절하면 막을 변형시키는 힘에 영향을 줍니다.종료.이중층과의 근접성은 제트 스트림을 집중시켰으며, 소포 생성 지점에서 막의 에너지가 분산되는 것을 방지했습니다. 또한, 압전 액추에이터에 인가된 전압이 높아질수록 와류의 이동 거리가 증가했습니다. 소포 형성은 생성 이후의 일련의 사건으로 시각화되었습니다.소포의 안정성은 소포의 직경에 따라 달라지는 경향이 있으며, 크기가 작은 소포일수록 더 안정적이었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 미세유체 제팅을 이용하여 지질 바이올레이터 소포를 생성하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

lipid-bilayer-vesicle-generation-using-microfluidic-jetting

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질...

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

본 프로토콜은 생체적합성 리포솜을 생성하기 위한 미세유체 기술인 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리(OLA)를 설명합니다. OLA는 효율적인 캡슐화를 통해 단분산 미크론 크기의 리포솜을 생산하여 즉각적인 온칩 실험이 가능합니다. 이 프로토콜은 합성 생물학 및 합성 세포 연구에 특히 적합할 것으로 예상됩니다.

생명공학을 위한 온칩 옥탄올 보조 리포솜 어셈블리

여기에서는 수중수(water-in-oil) 에멀젼(플러그)의 조합 라이브러리를 생산하기 위한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 이중층 장치의 제조를 소개합니다. 플러그 생산을 자동화하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어는 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 형광 플러그의 정량적 라이브러리 생산도 시연됩니다.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

배우세요 미세 유체 제트를 이용한 인지질 이중층 소포 생성 방법을 통해 막 비대칭성과 단백질 삽입을 정밀하게 제어하는 기술입니다. 이 방법은 세포 내 구획화된 생분자 연구에 활용됩니다.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

더 많은 동영상 탐색