자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

이 절차의 전반적인 목표는 절제된 자궁절제술로부터 원발성 자궁내막 기질 세포 배양을 확립하는 것입니다. 이는 먼저 자궁층을 구별하고 분리하여 자궁내막 조직의 일부를 분리함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 스크래핑 방법을 사용할 때 스크래핑 방법과 시도 방법 사이에서 세포 분리 기술을 선택하는 것입니다.

기계적 힘과 긁어내기는 자궁내막 기질 세포를 분리하고 해리하는 데 사용됩니다. 대안적으로, 트립신 방법을 사용할 때, 트립신의 효소 활성은 자궁 내막 기질 세포를 분리하고 해리하는 데 사용됩니다. 궁극적으로 현미경은 세포 성장과 형태를 관찰하는 데 사용되며, 원고에서 논의된 다른 기술은 자궁내막 기질 배양을 확인하는 데 사용됩니다.

이 방법은 생식 주기 및 월경과 같은 생식 분야의 주요 생리학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 이 원고에 사용된 자궁절제술 표본은 대학 IRB에서 승인한 윤리 프로토콜(번호 1, 4, 4, 4, 2, 4)에 따라 수집되었습니다. 샘플을 처리하기 전에 섭씨 4도에서 고포도당이 포함된 RPMI 또는 DMEM이 포함된 50ml 튜브에 환자 유래 조직을 24시간 이상 유지하지 마십시오. 시작할 준비가 되면 하나의 XPBS로 조직 샘플을 세 번 세척하고 세척할 때마다 용액을 폐기합니다.

그런 다음 10% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 4-10ml의 성장 배지를 조직 샘플에 추가합니다. 또한 곰팡이 구역을 최종 농도인 밀리리터당 0.25마이크로그램으로 추가하고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 성장 배지를 버리고 하나의 XPBS로 조직을 두 번 씻습니다.

조직을 6cm 세포 배양 플레이트에 놓고 이 이미지를 가이드로 사용하여 자궁내막층을 식별합니다. 그런 다음 자궁내막을 분리하고 나중에 사용할 수 있도록 다른 조직층을 저장합니다. 메스나 면도날을 사용하여 세포 배양 접시를 긁으면서 조직을 작은 조각으로 절단합니다.

긁힌 자국은 새로운 원발성 자궁내막 기질 세포의 부착을 용이하게 합니다. 다음으로, 긁힌 접시에 2ml의 성장 배지를 부드럽게 추가합니다. 이 단계에서 조직 조각이 보이고 긁는 동작으로 인해 움직이

오염을 방지하기 위해 다른 세포주와 분리된 지정된 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 광학 현미경을 사용하여 매일 세포를 모니터링하십시오. 3일에 2일 또는 3일까지 얇게 썬 조직에서 나오는 세포의 작은 집단을 찾으십시오.

하나의 XPBS로 오래된 배지 세척 배양물을 부드럽게 제거한 다음 2ml의 신선한 성장 배지를 추가합니다. 4ml의 성장 배지를 추가하기 시작합니다. 세척 단계에서 증식 속도가 증가하면 나머지 조직 조각을 흡인합니다.

조직에서 새로운 군체가 나타날 가능성은 거의 없습니다. 성장 통로의 1 주일 후에, 0.05%trypsin를 사용하는 세포. 세포가 75에서 80% co 유창성 사이로 도달할 때, 세포의 1개의 판을 아래로 얼립니다.

일단 2개 또는 3개의 플레이트가 유지되면, 일차 세포는 무한정 계대형성될 수 없습니다. 트립신 매개 격리를 시작하려면 자궁내막 조직의 작은 조각을 원뿔형 튜브에 넣고 2밀리리터의 0.25%트립신에 밀리리터당 0.03밀리그램을 보충합니다. 그런 다음 마이신이 섭씨 37도의 회전 플랫폼에서 30분 동안 조직을 배양할 수 있습니다.

다음으로 조직을 간단히 와류시킨 다음 200-400배 G에서 2분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 새로운 트립신을 첨가합니다. 그리고 mycin는 그 때 자전하는 동안 1 시간 동안 37 섭씨 온도에 조직을 배양할 수 있습니다. 배양 후 5-10초 동안 조직을 와류로 회전시킵니다.

그런 다음 10% FBS와 1% 페니실린 스트렙토마이신을 함유한 성장 배지 2ml를 추가합니다. 트립신을 비활성화하려면 200-400회 G로 2-3분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 버리고 세포 펠렛을 다시 현탁시킵니다.

2ml의 성장 배지에서 세포 현탁액을 6cm 세포 배양 접시에 플레이트화하고 플레이트를 긁어 일차 세포의 부착을 향상시킵니다. 광학 현미경으로 매일 세포 성장을 모니터링하고 2-3일마다 성장 배지를 교체하십시오. 세포가 75-80%의 유창성에 도달하면 0.05% 또는 0.25%트립신을 사용하여 자궁내막 기질 세포를 분리하여 배양합니다.

스크래핑 방법을 사용하면 초기 출현 세포의 클러스터가 생성됩니다. 메스로 인한 긁힘을 따라, 자궁내막 기질 세포는 섬유아세포 형태(fibroblast morphology)로 확인할 수 있습니다. 트립신 방법은 스크래핑 방법보다 준비 시간이 더 길지만 생존 가능한 세포가 더 일찍 관찰됩니다.

tryin 방법은 또한 클러스터 및 분산 성장 패턴을 모두 가진 세포를 생성합니다. 자궁내막 기질 세포에 대한 조직 특이적 마커는 아직 발견되지 않았습니다. 자궁내막 기질 세포를 식별하는 한 가지 방법은 마커의 손실을 측정하는 것입니다.

사이토케라틴(cytokeratin)과 같은 상피 세포의 경우. 사이토케라틴의 결핍은 자궁내막 상피 세포의 부재를 보여줍니다. 2번 통로와 비교하여 5번 통로에서 관찰된 시토케라틴 염색의 손실은 상피 세포의 부재를 확인시켜줍니다.

자궁내막 기질 세포의 존재에 대한 기능적 증거는 탈세포화 분석을 사용하여 제공할 수 있습니다. CAMP와 하이드록시 프로게스테론 아세테이트 치료에 대한 반응으로 프로락틴과 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 ONE의 증가는 자궁내막 기질 배양의 성공적인 확립을 나타냅니다. 이 동영상을 시청한 후에는 절제된 자궁절제술에서 원발성 자궁내막 기질 세포 배양을 확립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.