Name: 자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 자궁 적출술 검체에서 기계적 긁기와 트립신 소화법을 이용해 1차 자궁 내막 기질 세포를 분리 배양하는 방법을. qPCR과 면역형광법으로 세포 정체성을 검증하여 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 그들의 이미징 및 현미경 장비의 사용을 위해 박사 타오 댕와 그녀의 실험실의 구성원의 공동 노력을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 자궁 조직으로 우리를 제공하기위한 Biorepository 및 조직 연구 시설 (BTRF) 코어, 제프 하퍼, 버지니아 대학에서 주민 감사합니다. 우리는 도식 개요와 도움 카롤 Szlachta 감사합니다.

이 원고에 사용 된 자궁 절제술 표본 IRB-HSR # 14424 번호가 대학 IRB 승인 윤리 프로토콜과 일치에 수집되었다. 임상 자료 1. 샘플 수집 <ol><li> 시작하기 전에 정부와 기관 기반의 윤리 지침 및 승인 문서를 얻습니다. </li><li> 무균 조건의 모든 단계를 실시한다. </li><li> 샘플이 바로 문화에서 처리 할 수​​없는 경우 4 ° C에서 50 ML 튜브 미디어 (RPMI 또는 DMEM / 높은 포도당)의 환자에서 파생 된 조직을 유지. 샘플은 24 시간의 최대이 상태로 저장 될 수있다. </li><li> 1X 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 조직 샘플을 세 번 씻고 세척 사이의 솔루션을 폐기하십시오. </li></ol> 긁는 방법을 사용하여 차 전지 라인 2. 준비 <ol><li> 성장 배지 (RPMI 또는 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - streptomy 보충 DMEM / 높은 포도당의 4-10 ML을 추가CIN) 조직에 30 분 동안 Fungizone (0.25 ㎍ / ㎖의 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 성장 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 1X PBS로 두 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 자궁 근층 및 자궁 내막 층 (그림을 추가로 설명 2A-2C 참조)을 구별하는 6cm 세포 배양 접시에 조직을 놓습니다. 자궁 내막을 분리합니다. </li><li> 6cm 세포 배양 접시에 긁 동안 메스 나 면도날을 사용하여 작은 조각으로 조직을 절개. 이러한 상처는 새로운 기본 자궁 내막 세포의 부착을 용이하게합니다. 트립신 방법에 비해 더 많은 조직은 (근사 그림 2D 참조)이 필요합니다. </li><li> 살짝 긁힌 요리 (조직 파편이 눈에 보이는 이상적으로 긁는 동작에서 고정됩니다)에 성장 배지 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 지정된 세포 배양 인큐베이터에 플레이트 (들)을 이동 (37 ° C와 5 % CO 2). 멀리 OTH에서, 일차 전지 라인을위한 장소를 지정세포 배양 접시 어. 차 문화는 감염과 오염에 더 민감하다. </li><li> 매일 가벼운 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포의 작은 인구 ​​(그림 (b) 참조) 분리 된 조직 주변에서 하루 두 세에 의해 등장한다. </li><li> , 문화를 유지 1X PBS로 가볍게 씻어 3 일에 신선한 성장 미디어 (2 ㎖)을 추가합니다. 증식 속도가 증가는 추가적인 성장 배지 (3-4 ㎖)을 6cm 배양 플레이트 (들)에 첨가 될 수있는 경우. 참고 : 세척 및 미디어 변경하는 동안, 조직의 조각 가능성이 흡입됩니다. 이 자기편 세포의 성장에 영향을 미치지 않습니다. 새로운 식민지 한 주 후에 나올 가능성이 같은 조직의 조각은 다음 단계 (2.10)에 의해 흡입해야한다. </li><li> 0.05 % 트립신을 사용하여 80 %의 합류 (그림 (b) 참조), 통과 - 6cm 판은 약 75 때. 기본 세포는 무한정 계대 배양 할 수 없습니다 - 두 개 또는 세 개의 플레이트 엄마입니다 즉시 세포의 한 판을 아래로 동결intained. 더 많은 통로가 필요한 경우 (참조 3에서 검토) 불멸화 프로토콜을 따릅니다. </li></ol> 트립신 방법을 사용하여 기본 셀 라인 3. 준비 <ol><li> 카나마이신 (0.03 ㎎ / ㎖ 최종 농도)로 보충 0.25 % 트립신 2 ㎖에 자궁 내막 조직의 작은 조각 (근사 그림 2D 참조) 놓습니다. </li><li> 30 분 동안 플랫폼을 회전에 37 ° C에서 조직을 품어. </li><li> 간단히 조직을 소용돌이. </li><li> 2 분 동안 200 ~ 400 XG에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 신선한 트립신 및 카나마이신을 추가합니다. </li><li> 시간 동안 회전하는 동안 37 ° C에서 조직을 품어. </li><li> 5 ~ 10 초 동안 조직을 소용돌이. </li><li> 트립신을 비활성화 (10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충) 성장 배지 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 2 ~ 3 분 동안 200 ~ 400 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 뜨는을 취소하고 성장한다 2 ㎖를 추가펠렛 세포에 일 미디어. </li><li> 6cm 세포 배양 접시에 접시. 긁는 방법을 사용하여 기본 세포 라인을 준비 단계 2.5로 접시를 긁는 것은 필요 없습니다 만, 차 문화의 첨부 파일 및 파생물을 향상시킵니다. </li><li> 매일 광학 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 세포 (그림 3C 참조) 48 시간 후 광학 현미경으로 일반적으로 볼 수 있습니다. </li><li> 문화를 유지하기 위해 세포를 모니터링하고 단계 2.9에서와 같이 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. </li><li> 세포 75-80 % 년 컨 플루 (그림 3C 참조)에 도달 할 때 통과하는 세포는 0.05 % 또는 0.25 % 트립신을 사용합니다. </li></ol> 4. 추가 분석을위한 조직 (스냅 냉동 및 포르말린 고정)를 저장 <ol><li> 1X PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. </li><li> 가능한 한 많은 액체를 대기음. </li><li> 스냅 냉동, (그림 2 층과 2G 참조) 1.7 원심 분리 관에 자궁 내막 조직 샘플을 놓습니다. 1.7에게 배치원심 관 10 초간 액체 질소 나 때까지 조직 아래 냉동되었음을 알 수있다. 참고 : 샘플을 준비 할 때 직접 액체 질소를 건드리지 않도록주의하십시오. 샘플은 추가 처리 또는 분석 할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 포르말린 고정의 경우, 자궁 내막 조직 (그림 2H 참조)의 작은 조각을 잘라, 그리고 10 % 버퍼 아연 포르말린에 잠수함. 24 시간 후, 포르말린을 취소하고 추가 처리 될 때까지 조직 샘플에 70 % 에탄올을 추가합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 (IF) <ol><li> 셀 고정 <ol><li> 문화 슬라이드 나 접시에 세포를 준비합니다. </li><li> 부드럽게, 1X PBS로 세포를 씻어. </li><li> 5 분 (1:1의 비율로 혼합) 미리 냉장 (4 ℃) 메탄올 및 아세톤을 추가합니다. </li><li> 공기는 진행하기 전에 슬라이드를 건조. 필요한 경우 슬라이드 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 처리 IF <ol><li> 10 분 동안 1X PBS로 세포를 재수. FO에 대한llowing는 회전 플랫폼에서 모든 세척 및 배양을 실시, 1-6 단계를 반복합니다. </li><li> 1X PBS를 사용하여 블록은 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)로 보충하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 1 % 종 특정 혈청 (2 차 항체 원). </li><li> (항체 희석에 대한 제조 업체의 권장 사항을 참조하십시오) 차 항체에 품어. 특정 항체에 대한 자료를 참조하십시오. 단계 5.2.2에서와 같이 신선한 블로킹 버퍼에 일차 항체를 희석. 이 배양은 실온에서 또는 밤새 4 ℃에서 최소 2 시간 동안 실시 할 수있다 </li><li> 5 분마다 1X PBS로 3 회 반복한다. </li><li> (항체 희석에 대한 제조 업체의 권장 사항을 참조하십시오) 이차 항체에 품어. 단계 5.2.2에서와 같이 신선한 차단 버퍼에 보조 항체를 희석. 광 표백을 방지하기 위해서는 빛의 부재로이 이후의 단계를 수행하는 것이 중요하다. </li><li> 5 분마다 1X PBS로 3 회 반복한다. </li><li> Thoroughly는 슬라이드를 건조. </li><li> 설치 미디어 및 DAPI의 counterstaining 솔루션을 추가합니다. </li><li> 커버 슬립을 적용하고 실란트 (들)을 사용하여 가장자리를 밀봉. 슬라이드는 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 6. RNA 추출 <ol><li> 원심 분리하여 1 × 10 7 세포 펠렛. 이 프로토콜의 모든 재료 및 시약은 무료의 RNase해야합니다. </li><li> 1 ㎖의 TRIZOL 시약 및 핵 단백질 복합체의 분리를 완료하기 위해 실온에서 10 분 동안 균질화 된 샘플을 배양에서 세포를 Lyse. </li><li> TRIZOL 1 ㎖ 당 클로로포름 200 μl를 추가합니다. 15 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어 실온에서 2 ~ 3 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 최대 속도 (15,000 XG)에서 원심 분리기 세 가지 레이어가 발생합니다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 상단 수성 단계를 전송합니다. RNA 수율을 높이기 위해 1 μL 글리코겐을 추가; 그러나,이 단계는 필요시 소형RNA의 양이 예상된다. </li><li> 수성 층에 이소 프로필 알콜 0.5 ㎖를 추가하고 샘플을 3-5 번 반전. 10 분 동안 RT에서 샘플을 배양한다. 수율을 높이기 위해 샘플을 30 분 -20 ° C 또는 -80 ° C에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 최대 속도로 원심 분리기 </li><li> 이 시점에서, RNA의 작은 펠릿을 볼 수 있어야합니다. 상층 액을 버린다. </li><li> 75 %의 에탄올 1 ㎖로 RNA를 씻으십시오. </li><li> 5 분 동안 최대 속도로 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 샘플은 한 번 무기 오염 물질을 제거하는 것이 더 세척 할 수 있지만,이 단계가 필요하지 않습니다. </li><li> RNA 펠렛 건조 될 때까지 짧게, (일반적으로 7 ~ 10 분 소요) RNA 펠렛을 건조. 주 : 하나의 추가 단계는 무기 물질을 줄이고, 건조 시간을 단축 할 수있다. 추가 분 대기음 잔류 액의 최대 속도로 에탄올 세척, 스핀 샘플에서 뜨는을 폐기 한 후. 펠렛을 대기음하지 않도록주의하십시오. </li><li> RNA 펠렛의 크기에 따라, RNase가없는 물에 RNA를 용해. 볼륨은 일반적으로 10 ~ 50 ㎕의 범위. </li><li> 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 품어 및 RNA의 농도를 측정한다. </li><li> 추가 처리 될 때까지 -20 ° C에서 보관 샘플. </li></ol> 7. 전사 역 <ol><li> H 2 O와 9 μL의 볼륨에 샘플 RNA (1-3 μg)을 가지고 </li><li> 10 분 동안 70 ° C에 열 RNA. </li><li> 의 dNTP의 5 μL (50 μM의 작업 농도), N6 DNA 올리고의 5 μL (80 μM의 작업 농도), 배 AMV 버퍼의 5 μL 및 AMV의 1 μL : AMV 마스터 믹스를 생성하려면, 다음과 같은 시약을 결합 . 이 마스터 믹스 솔루션은 하나의 샘플 당 설계되었습니다. </li><li> 가열 된 RNA로 마스터 믹스의 16 μl를 추가합니다. 최종 반응 부피가 25 μL 반응 할 것이다. </li><li> (1 단계) 90 분 42 ° C에서, (역 : 역전사에 대해 다음과 PCR 조건을 사용하여5 분, 추가 처리 될 때까지 (3 단계) 4 °의 C에 대한 GE의 2) 95 ° C. </li></ol> 8. 리얼 타임 PCR <ol><li> 표 1에서 발견 프라이머 어닐링 온도, 사이클 수, 및 시약을 사용하여 PCR 반응을 실시한다. 참고 : (재료에 회사 카탈로그 번호 참조) PCR 시약을 사용하는 경우 제조 업체의 지침에 따라 적합합니다. </li></ol> 9. (참조 4와 5에서 파생) 체외 탈락 프로토콜 <ol><li> 자궁 내막 세포를 접시. </li><li> 75-85%의 포화 상태로 성장합니다. </li><li> 세포가 합류하게 한 후, 1X PBS로 한번 세척한다. </li><li> 신속, (페놀 무료 RPMI 5 % 목탄 스트립 FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충) 호르몬이없는 용지를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후, 1 μM 및 8 bromoadenosine 3의 최종 농도 메드 록시 프로게스테론 아세테이트 (MPA)로 보충 호르몬 가능한 미디어 &#39;, 5&#39;를 추가0.5 ㎜의 최종 농도 환식 모노 포스페이트 (캠프). </li><li> 적어도 48 시간 후에 반응을 정지하고 추가 처리를 위해 플레이트 (들)을 저장한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

다른 그룹은 콜라게나 4,12,13,15-18를 활용 대부분의 자궁 내막 기질 문화의 제조 방법을 설명하고 적응. 이 논문에서, 우리는 경제적 인 이유와 트립신 및 / 또는 면도날의 편리한 이용 가능 여부 연구실로 활용 둘 중 두 가지 간단한 기본 자궁 내막 배양 방법에 대한 방법론과 증거를 제공했다. 우리의 두 가지 방법을 비교했을 때, 모두가 성공적으로 실행 가능한 차 문화를 생성합니다. 작은 샘플 크기 요구 사항과 높은 수익률은 일반적으로 존재하는 한 우리의 기본 방법은 트립신 방법입니다. 준비 시간이 한정되어있는 경우 트립신 방법을 사용하여 세포를 도금하는 것은 시간 반 이상을 소요하는 반면, 연삭 법은 30 분을 필요로한다. 또한 주목할만한 자궁 내막 생검 반대로 우리가 자궁 적출술의 샘플이 방법을 보여 것입니다. 자궁 내막 바이오psies 상당한 침입하지 않고 찍은 작은 표본을 생산하는 경향이있...

인간의 자궁 체부는 세 개의 층, perimetrium (또는 장막), 자궁 근층 및 자궁 내막으로 구성되어 있습니다. 이들 층의 각각을 구별하는 것은 내막 세포주를 확립하는 중요한 단계이다. perimetrium은 자궁의 가장 바깥 층과 얇은 장액 세포로 구성. 근육층은 두꺼운 중간 자궁의 층과 평활근 세포로 구성된다. 자궁 내막은 자궁의 내부 층으로 식별하고 상피 및 간질 세포 집단을 포함한다. 자궁 내막은 또한 그 줄기 세포 인구는 약 28 일마다 1 functionalis 층을 다시 채울 가설 basalis 층으로 구분된다. 인간의 자궁 내막의 functionalis 층 호르몬 순환에 대한 응답으로 중요한 생화학 적 및 형태 학적 변화를 겪는다. 이 호르몬은 뇌하수체와 난소에서 파생됩니다. 생식주기의 조정 생산 및 호르몬 결과의 릴리스. 생식주기는 잠재적 인 배아 주입 이벤트에 대한 내막을 준비하도록 설계되었습니다. 인간의 생식주기는 &quot;월경주기&quot;라고하며 다음과 같은 세 가지 단계로 구분 - 증식, 분비, 월경. 분비 단계가 functionalis 성숙에 의해 표시되는 반면 증식 단계는 functionalis 자궁 내막 층의 확산을 포함한다. 특히, 세포 변화, 분비물, 그리고 세포 분화는 잠재적 인 주입 신호. 주입이 분비 단계의 끝 이전에 발생하지 않는 경우, functionalis의 자궁 내막 층은 생리 단계 흘렸다. 생리 및 functionalis 층의 흘리기를 트리거하는 이벤트의 중요성은 여전히​​ 논의되고있다. 인간에서는, 생리 알려진 특정 미드 분비 기 감별 이벤트의 결과라고 제기되었다&quot;자연 탈락&quot;2 등. 이 논문에서는, 양쪽 자궁 내막 세포 분리 방법에 대한 상세한 방법을 제공하며, 이러한 방법의 효능을 입증하기 위하여 면역 형광 및 디지털 이미지의 조합을 사용한다. 또, 일반적으로 적용 자궁 내막 세포 격리을 확인하기 위하여 자발 탈락의 시험 관내 모델에서 사용.

<table><tbody><tr><td>0.25 트립신 또는 0.05% 트립신&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 또는 SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1.7 마이크로 원심분리기 튜브&nbsp; &nbsp;</td><td>제네시 사이언티픽</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &마이크로; l, 20 &마이크로; L, 200 ml 및 1,000 &micro; l 피펫&nbsp; &nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6cm 세포 배양 접시&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 웰 챔버&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>아세테이트&nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT 효소/완충액&nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>완충 아연 포르말린&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>차콜 스트립 FBS&nbsp;</td><td>피셔</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립&nbsp;</td><td>피셔 브랜드</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>사이클릭 AMP(cAMP)&nbsp;</td><td>시그마</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/고혈당&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 -TRITC&nbsp;</td><td>산타</td>크루즈 <td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 세럼&nbsp;</td><td>잭슨' s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Cadherin 항체&nbsp; &nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>소태아 혈청 (FBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotericin B&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 프로브&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>글리코겐&nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 - FITC&nbsp;</td><td>잭슨' s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신&nbsp; &nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (메탄올)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어 (w/DAPI)&nbsp;</td><td>벡터 Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA 올리고&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Number 15 스크래퍼&nbsp; &nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>팬 사이토케라틴&nbsp; 마우스 mAB&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (인산염 완충 식염수)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 글루타민 용액 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML 안티 염소 안티 바디&nbsp;</td><td>산타크루즈</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>프라이머&nbsp;</td><td>유로핀</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (페놀 프리)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr 그린&nbsp; &nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&nbsp;</td><td>써모</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>트리졸&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin 항체&nbsp;</td><td>에피토믹스</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

많은 노력이 체외 세포 배양 시스템의 구축에 전념하고 있습니다. 이러한 시스템은 생체 내 프로세스의 광대 한 번호를 모델로 설계되어 있습니다. 인간의 자궁 내막 샘플에서 발생하는 세포 배양 시스템도 예외는 아니다. 응용 프로그램은 정상적인 생리주기 프로세스에서 같은 부인과 암, 감염성 질환, 생식 결함으로 자궁 내막 병변의 범위. 여기, 우리는 수술 절제 자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포를 확립하기위한 두 가지 방법을 제공합니다. 첫 번째 방법은 &quot;스크래핑 방법&quot;이라하고 두 번째 방법은 칭했다 반면 수술 또는 면도날을 사용하여 기계적 스크래핑 통합되는 &quot;트립신 방법.&quot;이 후자의 방법은 세포의 분리 및 일차 홍보 트립신 효소 활성을 사용 세포 가지. 우리는 디지털 이미지와 현미경을 통해 단계별 방법을 설명한다. 우리는 또한 제공하기양적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 및 면역 (IF)를 통해 자궁 내막 기질 세포 라인의 유효성을 검사하는 전자의 예입니다.

프로토콜 섹션에 강조으로, 인간의 조직을 처리하고 준비 할 때 모든 기관 정부에서 방법, 윤리적 지침을 수행해야합니다. &quot;긁는 방법&quot;의 일반적인 워크 플로의 그림 (그림 1A) 및 기본 자궁 내막 문화를 설정하는 데 사용 &quot;트립신 방법&quot;(그림 1B)은이 원고에 포함되어 있습니다. 이들 방법은 프로토콜 섹션에서 상세히 설명된다 (파트 1 참조 -. 3.). 두 가지 방법은 기본 자궁 내막 문화의 성장에 성공적으로 증명한다. 장점은 &quot;긁기 방법은&quot;준비 시간이 단축되는; 에 비해 4 배 이상 - 그러나, 생존 세포를 관찰하는 데 걸리는 시간은 통상 2 &quot;트립신 방법.&quot; 티슈 조달로부터 수신 된 초기 인체 조직의 디지털 이미지가 개시된다. 자...

자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포 배양 시스템을 구축하는 것은 이전의 연구 목표의 광대 한 배열을 추구하는 귀중한 생물 기술과 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 인간의 환자의 수술 적 절제술 자궁 내막 조직에서 기질 문화를 설정하는 데 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다.

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

본 절차의 전반적인 목표는 절제된 자궁 적출물로부터 일차 자궁내막 기질 세포 배양물을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 자궁 층을 구분하고 분리하여 자궁내막 조직의 일부를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 긁어내기(scraping) 방법과 트립신(trypsin) 방법 중 세포 분리 기술을 선택하는 것이며, 여기서는 긁어내기 방법을 이용합니다.내막 기질 세포를 분리하고 해리하기 위해 기계적 힘과 스크래핑 방식이 사용됩니다. 또는 트립신 방법을 사용할 경우, 트립신의 효소 활성을 이용하여 내막 기질 세포를 분리하고 해리합니다. 최종적으로, 현미경을 통해 세포의 성장과 형태를 관찰하며, 원고에서 논의된 다른 기술들을 사용하여 내막 기질 배양을 검증합니다.이 방법은 생식 주기 및 월경과 같은 생식 분야의 주요 생리학적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 원고에 사용된 자궁 절제술 표본은 대학 IRB 승인 윤리 프로토콜 번호 I-R-B-H-S-R number 1 4 4 2 4에 따라 수집되었습니다. 환자 유래 조직은 샘플 처리 전까지 4 °C에서 high glucose가 포함된 RPMI 또는 DMEM이 담긴 50 mL 튜브에 24시간 이내로 보관하십시오. 시작 준비가 되면, 조직 샘플을 1X PBS로 3회 세척하고 각 세척 단계 사이에 용액을 제거하십시오.그런 다음 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 첨가된 성장 배지 4~10 mL를 조직 샘플에 추가합니다. 또한, fungi zone을 최종 농도 0.25 µg/mL가 되도록 첨가하고 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 성장 배지를 제거하고 1x PBS로 조직을 두 번 세척합니다.조직을 6cm 세포 배양 플레이트에 놓고 제공된 이미지를 가이드로 삼아 자궁내막층을 확인합니다. 그런 다음 자궁내막을 분리하고 나머지 조직층은 추후 사용을 위해 보관합니다. 메스나 면도날을 사용하여 조직을 작은 조각으로 절단하면서 세포 배양 접시 바닥에 긁어냅니다.스크래치는 생성되는 일차 자궁내막 기질 세포의 부착을 용이하게 합니다. 다음으로, 스크래치가 처리된 배양 접시에 2 mL의 성장 배지를 조심스럽게 첨가합니다. 이 단계에서는 조직 파편들이 보이며, 스크래치 동작으로 인해 고정된 상태가 됩니다.오염을 방지하기 위해 다른 세포주와 분리된 전용 세포 배양 인큐베이터에 디쉬를 넣으십시오. 광학 현미경을 사용하여 매일 세포를 관찰하십시오. 2~3일째부터 3일마다 절편 조직에서 나오는 소규모의 세포 집단이 있는지 확인하십시오.XPBS로 기존 배지 세척 배양물을 조심스럽게 제거한 후, 신선한 성장 배지 2 mL를 첨가합니다. 성장 배지 4 mL를 추가하기 시작하십시오. 세척 단계 동안 증식률이 증가하면 남은 조직 조각들을 흡입하여 제거합니다.조직에서 새로운 콜로니가 형성될 가능성은 낮습니다. 1주간의 계대 배양 후, 0.05% trypsin을 사용하여 세포를 처리합니다. 세포의 합쳐짐 정도(confluency)가 75~80%에 도달하면 세포 한 플레이트를 동결 보관합니다.두 개 또는 세 개의 플레이트가 유지되면, 일차 세포를 무한히 계대 배양할 수는 없습니다. 트립신 매개 분리를 시작하려면, 0.03 mg/mL의 Can mycin이 첨가된 0.25% Trypsin 2 mL가 들어있는 원뿔형 튜브에 자궁내막 조직 조각을 넣습니다. 그런 다음 조직을 37 °C의 회전 플랫폼에서 30분 동안 배양합니다.다음으로, 조직을 짧게 볼텍싱한 후 200 ~ 400 $\times$g에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 뒤 신선한 trypsin과 gentamicin을 추가합니다. 그 후 조직을 37 °C에서 1시간 동안 회전시키며 배양합니다. 배양이 끝나면 조직을 5 ~ 10초 동안 볼텍싱합니다.그런 다음 10% FBS와 1% penicillin streptomycin이 포함된 성장 배지 2 mL를 추가합니다. trypsin을 불활성화하기 위해 세포를 200~400 ×g에서 2~3분 동안 원심 분리합니다. 그 후 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 재현탁합니다.2 mL의 성장 배지가 담긴 6 cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 분주하고, 일차 세포의 부착을 촉진하기 위해 접시를 긁어줍니다. 광학 현미경으로 세포 성장을 매일 관찰하고, 2~3일마다 성장 배지를 교체합니다. 세포의 밀집도가 75~80%에 도달하면, 0.05% 또는 0.25% trypsin을 사용하여 세포를 계대 배양하여 자궁내막 기질 세포를 분리합니다.긁어내기(scraping) 방법을 사용하면 초기 출현 세포들의 군집이 형성됩니다. 메스로 유도된 긁힘 부위를 따라 섬유아세포 형태를 보이는 자궁내막 기질세포를 확인할 수 있습니다. 트립신 방법은 긁어내기 방법보다 준비 시간이 더 길지만, 생존 세포가 더 빨리 관찰됩니다.트라이인(tryin) 방법 또한 군집형 및 분산형 성장 패턴을 모두 가진 세포들을 생성합니다. 자궁내막 기질 세포에 대한 조직 특이적 마커는 아직 발견되지 않았습니다. 자궁내막 기질 세포를 식별하는 한 가지 방법은 특정 마커의 소실을 측정하는 것입니다.cytokeratin과 같은 상피 세포의 경우, cytokeratin이 검출되지 않는 것은 자궁내막 상피 세포가 없음을 나타냅니다. 계대 2회차와 비교하여 계대 5회차에서 관찰된 cytokeratin 염색의 소실은 상피 세포가 없음을 확인시켜 줍니다.탈세포화 분석법을 통해 자궁내막 기질 세포의 존재에 대한 기능적 근거를 제시할 수 있습니다. CAMP 및 hydroxy progesterone acetate 처리에 반응하여 프로락틴과 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 1이 증가하는 것은 자궁내막 기질 배양이 성공적으로 확립되었음을 나타냅니다. 이 영상을 시청하고 나면, 절제된 자궁 적출물로부터 일차 자궁내막 기질 세포 배양을 확립하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오는 인간 망막 표본에서 일차 인간 중피 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 중피 세포는 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하기 위한 체외 난소암 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다.

Mesothelial Cell Isolation: A Technique to Isolate Primary Mesothelial Cells From Human Omentum Tissue Specimen

여기에서는 난소암 세포의 부착, 침습 및 증식을 조사하기 위한 도구로서 일차 인간 중피 세포와 세포외 기질로 층을 이룬 섬유아세포로 구성된 복막강 내막의 3차원 체외 모델을 구성하는 프로토콜을 제시합니다.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

본 연구는 체외 탈락에서 공부하는 공 배양 시스템에서 사용할 수있는 기본 마우스 자궁 내막 기질과 상피 세포의 분리 및 문화에 대한 표준화 및 검증 방법을 제시한다.

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

이 프로토콜은 응용 프로그램 (예: immunocytochemistry, cytometry, 등)의 다양 한 사용 될 수 있는 기간 placentae의 태아 세포 막에서 수집한 기본 인간 decidual 세포의 고립에 대 한 메서드를 보여 줍니다 목표로 임신 합병증에 다른 세포 인구의 역할...

기간 Placentae의 태아 세포 막에서 기본 인간 Decidual 세포의 고립

이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

이 방법론의 목적은 유세포분석및 서양세포분석과 서양계의 기능성 분석및 현상형 특성화를 사용하여, 구형 프로토콜을 사용하여 암 세포주 및 원발성 인간 종양 샘플에서 암 줄기세포(CSC)를 식별하는 것입니다. 얼룩.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

이 프로토콜은 유전자 발현 및 조직학적 분석을 위한 마우스 자궁내막 상피 오가노이드를 확립하는 방법론을 설명합니다.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

이 프로토콜은 폐경 전 또는 폐경 후 인간 질 조직에서 일차 섬유아세포를 분리하는 신뢰할 수 있고 효과적인 기술을 보여줍니다. 질 섬유아세포 분리를 위한 기존 프로토콜은 노화 조직에서 세포 분리의 문제를 고려하지 않습니다. 질 조직은 골반 장기 탈출증 수술 후 여성으로부터 얻었다.

Tissue Processing and Isolation of primary Fibroblasts from the Human Vagina(인간 질에서 일차 섬유아세포의 조직 처리 및 분리)

이 프로토콜은 3차원(3D) 프린팅 골격으로 두 종류의 부착 세포주의 생물학을 재현할 수 있는 새로운 체외 실험 모델을 보여줍니다. 이 모델의 구성과 세포 준비 및 세포 배양에서 분석 및 평가에 이르는 운영 절차에 대해 설명합니다.

두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

배우세요 자궁 적출술 검체에서 기계적 긁기와 트립신 소화법을 이용해 1차 자궁 내막 기질 세포를 분리 배양하는 방법을. qPCR과 면역형광법으로 세포 정체성을 검증하여 생식 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

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