형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

다음 실험의 전반적인 목표는 고아 G 단백질 결합 수용체 또는 G PCR의 기능적으로 활성화되는 리간드를 확인하는 것입니다. 이는 두 단백질의 일시적인 이종 발현을 얻기 위해 세포 발현 시스템에서 관심 A-G-P-C-R 및 cot transection을 통해 이루어집니다. 두 번째 단계로, 형질주입된 세포에는 칼슘에 민감한 염료인 flu oh four가 주입되어 칼슘 상호 작용에 따른 형광 신호의 증가를 통해 세포 내 저장소에서 칼슘이 방출되는 것을 감지합니다.

다음으로, 형광 기반 칼슘 동원 분석법은 이종 발현 수용체에 후보 리간드의 화합물 라이브러리를 시험하여 수용체를 활성화하고 세포 내 신호 전달 연쇄 반응을 유도하여 소포체에서 칼슘을 방출하는 화합물을 결정함으로써 수행되며, 이는 형광 신호로 측정할 수 있습니다. 활성화 리간드의 절반 최대 유효 농도를 가진 농도 반응 곡선을 보여주는 결과가 얻어졌으며, 이는 세포 발현 시스템에 투여된 리간드 농도에 따라 다른 형광 신호의 검출을 기반으로 합니다. 안정적인 클론 세포주를 사용하는 것에 비해 GPCR의 일시적인 발현을 얻기 위해 일시적인 transfection을 수행하는 것의 주요 이점은 안정적으로 transfection된 cell line cot의 시간 소모적인 확립이 필요하지 않다는 것입니다.

promiscuous G alpha 16 subunit의 transfection은 내인성 환경에서 native 신호 경로에 관계없이 대부분의 GPCR의 세포 내 신호 전달 경로를 칼슘 방출로 리디렉션할 수 있습니다. 따라서 이 설정을 통해 짧은 시간 내에 관심 GPCR에서 수백 가지 화합물의 중간 처리량 스크리닝을 수행할 수 있으며, 절차가 황색 가스, 박사 과정 학생과 당사 실험실의 기술자인 Nick Su가 실제 칼슘 동원 분석이 이루어지기 3일 전에 T 75 플라스크에서 HEK 2 93 T 세포를 성장시킵니다. 80%의 합류점이 도달했을 때 세포를 통과합니다. 수용체 구조체를 사용한 transfection을 위한 T 75 플라스크 1개와 empty expression vector를 negative control로 사용하여 transfection을 위한 플라스크 1개를 준비합니다.

여기에 표시된 것처럼 세포 배양이 50-70% 합류점에 도달할 때까지 섭씨 37도의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 20-24시간 동안 플라스크를 배양합니다. 다음으로, 3.9 마이크로그램의 수용체 구조체 또는 빈 벡터와 3.9 마이크로그램의 G alpha 16 발현 구조체를 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 첨가합니다. 500마이크로리터의 제트 프라임 버퍼를 추가합니다.

튜브를 볼텍싱한 다음 짧게 회전시켜 잘 섞습니다. 그런 다음 37.5 마이크로 리터의 제트 프라임 시약 와류를 추가하고 최대 속도로 1 분 동안 스핀 다운합니다. 트랜스펙션 믹스를 10분 동안 배양합니다.

실온에서 하나의 세포 집단을 발현 벡터로 transfection된 것으로 라벨링하고, 관심 GPCR 및 G alpha 16 구조체를 인코딩하고, 두 번째 플라스크를 빈 벡터와 G alpha 16 구조체로 인코딩합니다. 배양 후 transfection mix를 세포 배양 배지에 적가하여 배지에 직접 피펫팅하고 배양 플라스크의 벽과 접촉하지 않도록 합니다. 칼슘 동원 분석을 위해 섭씨 37도의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 20-24시간 동안 플라스크

형질주입된 세포를 모아 96에 파종합니다. 글쎄, 검은 색 벽, 투명한 바닥 판. 먼저 실온의 웰당 60마이크로리터로 플레이트를 코팅합니다.

피브로넥틴으로 인산염 완충 식염수. 뚜껑을 덮은 상태에서 실온에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 웰에서 용액을 제거하고 실온에서 뚜껑 없이 1시간 동안 플레이트를 다시 배양합니다.

한편, 세포에서 오래된 성장 매체를 제거하십시오. PBS 3ml로 죽은 세포를 헹구고 PBS를 제거합니다. 그런 다음 용액을 제거하기 전에 3 ml의 실온 PBS tryin EDTA 배양을 1 분 동안 추가합니다.

이 시점에서 세포의 형태는 별 모양에서 구 모양으로 바뀝니다. 플라스크 바닥에서 세포를 부드럽게 두드려 풀고 10ml의 실온으로 여러 번 헹궈 세포를 모읍니다. DM 전송 매체.

세포를 50ml 매 튜브로 옮깁니다. 밀리리터당 세포 수를 계산하려면 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 100마이크로리터의 세포 배양액을 추가합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 튜브를 두드려 혼합합니다.

마지막으로 100마이크로리터의 안정화 버퍼를 추가하고 탭하여 혼합합니다. nucleo cassette에 cell suspension을 채우고 카운터로 세포를 계수합니다. nucleo view 소프트웨어는 세포가 3배 희석됨에 따라 세포 수에 자동으로 3을 곱합니다.

용해 및 안정화 완충액을 추가할 때, 600, 밀리리터 당 000 세포의 최종 농도로 세포를 묽게 하고 코팅된 플레이트의 웰 당 세포 150 마이크로리터를 파종합니다. 대략 90의 세포 조밀도를 얻기 위하여는, 좋은 당 000의 세포는 기포를 피하고 세포를 균등하게 퍼지기 위하여 판을 두드리십시오. 인접한 세포층을 얻으려면 섭씨 37도의 5% CO2 가습 인큐베이터에서 16-24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

세포에서 배지를 버립니다. 웰당 200마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 PBS를 제거합니다. 세포에 대한 작업을 포함하는 다음 모든 단계는 이 시점부터 세포에 fluoro four가 로드되기 때문에 어두운 곳에서 수행해야 합니다.

웰당 55마이크로리터의 로딩 버퍼를 추가하고, 플레이트가 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세척 버퍼를 사용하여 건조된 펩타이드를 실리콘화된 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 용해시킵니다. 농도 반응 분석을 수행하고 리간드의 EC 50 값을 측정하기 위해 희석 시리즈를 준비합니다.

분석 중에 컴파운드 플레이트에서 50마이크로리터의 리간드가 셀 플레이트에 100마이크로리터의 세척 버퍼가 있는 웰로 전달되므로 원하는 최종 농도의 3배로 화합물을 준비합니다. 다음으로, 화합물 플레이트의 해당 웰에 70 마이크로 리터의 리간드를 삼중으로 첨가합니다. 각 플레이트에 포지티브 및 네거티브 컨트롤을 포함합니다.

셀 플레이트에서 로딩 버퍼를 버리고 각 웰에 100마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 빛에 노출되는 것을 방지합니다. 접시를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 셀 플레이트에서 세척 버퍼를 버리고 각각에 100마이크로리터의 새 세척 버퍼를 추가합니다.

세포 플레이트, 복합 플레이트 및 팁 랙을 15분 동안 잘 배양합니다. 섭씨 37도에서 소프트웨어를 사용하여 원하는 프로토콜 파일을 생성 및 로드하고 여기에서 판독실의 온도 제어 장치를 활성화합니다. 칼슘 반응은 섭씨 37도에서 2분 동안 한 번에 한 줄씩 측정되며 525나노미터에서 연속 판독 사이에 1.52초 간격으로 측정됩니다.

독감의 흥분을 488 나노 미터로 설정하고 총 부피 50 마이크로 리터의 화합물을 세포 플레이트로 옮깁니다.판독 후 18 초. 투주 속도를 초당 26마이크로리터로 설정하고 파이펫 높이를 135마이크로리터로 설정하여 시작합니다.

화합물과 셀 플레이트, 팁 랙을 스테이션 장치의 해당 서랍에 배치합니다. 플렉스 모드에서 실제 화면을 시작하기 전에 엔드포인트 모드에서 동일한 여기 및 방출 파장에서 셀 플레이트를 한 번 판독합니다. 분석을 시작하고 표시된 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행합니다.

다음은 doofus short NPF one concentration series의 3 가지 복제본 중 하나에 해당하는 그래프입니다. 음성 대조군은 형광 신호를 유도하지 않았습니다. 양성 대조군은 내인성 프로테아제 활성화 수용체의 강력한 활성화를 유도하여 높은 형광 신호로 이어졌습니다.

이 소프트웨어를 사용하면 수식을 입력하여 활성화 비율 또는 다른 농도의 표준 오류를 결정할 수 있습니다. 결과 데이터는 4개의 식도 단락 NPF 펩타이드에 대해 표시된 대로 EC 50 값을 추정하기 위한 예비 농도 반응 곡선을 구성하는 데 사용됩니다. 곡선에는 음성 대조군에 대한 데이터도 포함되어 있으며, 여기서 초파리 쇼트 NPF 펩타이드의 농도 계열은 빈 벡터로 transfection된 세포에서 테스트되었습니다.

결과는 이러한 세포에 펩타이드를 추가하는 것이 내인성 수용체에 영향을 미치지 않지만 실제로 관심 수용체를 활성화한다는 것을 나타냅니다. 형광 기반 칼슘 동원 분석법의 예비 농도 반응 곡선을 수행하고 테스트된 농도를 곡선의 동적 범위를 포함하도록 조정했습니다. 초파리 쇼트 npf 1, 2, 3 및 4의 EC 50 값은 유사하며, 이는 이 절차에 따라 수용체를 활성화하는 데 동등하게 강력함을 나타냅니다.

구조 활동, 관계 연구와 같은 다른 방법은 펩타이드의 어떤 아미노산이 수용체 활성화에 중요한지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 G 단백질 결합 수용체의 기능적으로 활성화된 리간드를 식별하기 위해 fluer sense 기반 칼슘 동원을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에는 태양 발현 시스템의 유지 관리에 이어 관심 수용체에 의한 세포 시스템의 트랜스젠더 형질주입이 포함됩니다.

경직 후 칼슘 동원 분석이 이루어질 수 있습니다.