섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다. 단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 신경 성장과 복구를 지원하는 다면적인 환경을 조성하는 것입니다. 이것은 먼저 분해 가능한 미세구 내에서 성장 인자를 캡슐화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 대부분의 환경에 대한 지지 재료를 준비하는 것입니다.

다음으로, 미세구와 지지 물질이 결합되고 정렬된 섬유질 골격으로 전기 방사됩니다. 마지막 단계는 병아리 등뿌리 신경절 뉴런으로 골격을 테스트하는 것입니다. 궁극적으로 면역형광 현미경 검사는 대조군에 비해 신경돌기의 성장과 방향이 가속화된다는 것을 보여주는 데 사용됩니다.

이 시스템은 사용되는 단백질과 물질에 약간의 변화가 있는 신경 조직을 위해 설계되었지만 심장, 폐 및 뼈를 포함한 다양한 조직 유형에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 전에 필요한 시약, 탈 이온수에 폴리 비닐 알코올 또는 PVA의 부피 당 2 % 및 0.5 % 중량 용액, 부피 당 2 % 부피의 용액, 이소 프로필 알코올 및 탈 이온수 및 원하는 친수성 단백질의 수용액을 준비합니다. 장소. 0.5%PVA 용액 40ml를 50ml 원심분리기 튜브에 넣고 65-35 폴리락틱 co glycolic acid 또는 PLGA 300mg과 디클로로 메탄 3ml를 용해시킨 작은 바이알에 따로 보관합니다.

와류 믹서는 200 마이크로 리터의 단백질 용액과 4 마이크로 리터의 2 % PVA 용액을 결합하여 PLGA 용해를 가속화하는 데 사용할 수 있습니다. 단백질 PVA 혼합물을 PLGA 용액에 붓습니다. 솔루션은 대부분 분리된 상태로 유지됩니다.

약 10와트의 와트를 사용하여 바이알을 얼음물이 담긴 비이커에 넣고 균일한 크림 같은 흰색 에멀젼이 생성될 때까지 5-10초 동안 용액을 교반합니다. 0.5%PVA가 포함된 미리 준비된 50밀리리터 튜브에 에멀젼을 붓습니다. 약 20초 동안 와류 믹서에서 용액을 고속으로 혼합합니다.

솔루션이 흐린 모양으로 나타납니다. 에멀젼을 200ml 비커에 옮기고 350RPM의 교반 플레이트에 2분 동안 놓습니다. 50ml의 2% 이소프로필 알코올을 교반 플레이트의 비커에 추가합니다.

클로로 메탄이 증발하고 PLGA가 굳을 수 있도록 혼합물을 최소 1시간 동안 계속 교반하도록 합니다. 다음으로, 마이크로스피어 용액을 원심분리기 튜브로 옮기고 425배 G에서 3분 동안 원심분리합니다. 미세구는 튜브 바닥에 모여 흰색으로 보입니다.미세구 위의 튜브에서 상등액을 조심스럽게 제거하고 500ml 병에 보관하십시오.

각 튜브를 4분의 3 정도 채우고 흔들어 액체의 미세구를 재분배하여 탈이온수로 미세구를 헹굽니다. 상층액의 원심분리 제거를 반복하고 최종 헹굼 후 탈이온수로 미세구를 4회 헹굽니다. 상층액을 제거하고 다른 샘플과 함께 500ml 병에 넣습니다.

원심분리기 튜브에 수집된 미세구를 하룻밤 동안 섭씨 영하 20도에서 동결한 다음 최소 24시간 동안 동결 건조합니다. 다음 전기 방사 용액은 탈 이온수, 부피 당 2 % 중량, 메스 관련 히알루 론산 또는 부피 당 3 % 중량, 900 킬로달톤 폴리에틸렌 옥사이드 또는 PEO 및 부피 당 0.05 % 중량의 miha에서 미리 준비해야합니다. Photo initiator 솔루션.

원하는 부피의 전기 방사 용액을 만든 후 원하는 농도로 밀리리터당 최대 400mg의 마이크로스피어를 추가합니다. 미세구가 용액에 고르게 분포될 때까지 와류 혼합기에서 용액을 혼합합니다. 용액을 주사기에 옮기고 6인치 18게이지 뭉툭한 팁 바늘을 부착합니다.

사기를 주사기 펌프에 넣고 시간당 1.2밀리리터로 투약하도록 설정합니다. 맨드릴에 알루미늄 호일 층을 테이프로 붙입니다. 이를 통해 완성 된 비계를 쉽게 청소하고 보관할 수 있습니다.

회전하는 맨드릴은 정렬된 섬유를 만드는 데 사용됩니다. 높은 볼륨의 접지선을 연결하십시오.tage 전원을 수집 장치에 연결합니다. 성공적인 전기 회전을 보장하기 위해 양극 리드를 바늘에 연결하십시오.

모든 연결 및 설정이 올바른지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 폴리머 펌핑을 시작하고 주사기 끝에 용액이 보이면 전압 소스를 켜고 전압을 24 킬로 설정하십시오. 원하는 스캐폴드 두께에 도달할 때까지 솔루션을 실행합니다.

완료되면 전압 소스와 주사기 펌프를 끕니다. 이 절차를 시작하려면 전기 방사 전에 탈착식 양면 테이프를 사용하여 전기 스피너의 수집 영역에 관련 커버 슬립을 부착합니다. 커버 슬립으로 회전하면 원하는 두께로 전기 회전 후 취급 및 보기가 쉬워집니다.

이전 비디오 세그먼트에서 설명한 것처럼 맨드릴에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 비계 코팅된 덮개 슬립을 투명한 질소 챔버에 넣고 모든 산소가 퍼지되었는지 확인합니다. 챔버와 골격을 10밀리와트 제곱 365나노미터 조명 아래에 15분 동안 놓습니다.

가교 장소 후 덮개가 적절한 크기의 웰 플레이트에 끼워집니다. 비계 쪽이 위를 향하도록 합니다. 웰 플레이트의 각 골격에 100-200마이크로리터의 매체를 놓습니다. 신중히.

배지 액적의 각 골격에 하나의 등쪽 뿌리 신경절 또는 DRG를 놓습니다. 두꺼운 스캐폴드의 경우 더 많은 미디어가 필요할 수 있습니다. DRG는 완전히 잠겨야 하며 떠 있지 않아야 합니다.

세포가 골격에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 4시간 동안 골격과 DRG를 배양합니다. 다음으로, 우물에 적합한 수준까지 매체를 채웁니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 배양 기간 후 4-6일 동안 배양합니다.

각 웰에서 미디어를 조심스럽게 제거하고 PBS로 한 번 부드럽게 씻습니다. 부피당 30%의 무게를 사용하여 4분 동안 셀을 고정합니다. 파라 포름알데히드는 확립된 프로토콜에 따라 신경 필라멘트와 핵을 위해 세포를 염색합니다.

형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화하려면 웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 dpi에 대한 필터 및 여기 설정을 사용하여 세포 질량을 찾습니다. 셀이 식별되면 필터를 zi로 전환합니다. 확장된 신경돌기를 시각화하려면 현미경의 스티치 기능을 사용하여 전체 구조를 보는 데 필요한 만큼 이미지를 수집하고 결합합니다.

dpi, fite 및 brightfield microsphere에 대해 반복합니다. 85% 이상의 단백질 캡슐화와 함께 직경 50개 이상 또는 최소 14마이크로미터가 일관되게 생성되었으며 이 프로토콜에 의해 전기가 골격으로 회전했습니다. 이 형광 이미지는 PLGA 쉘에 Rod Domine이 있고 그 안에 캡슐화된 BSA 맞춤이 있는 대표적인 마이크로스피어를 보여줍니다.

캡슐화를 평가하기 위해 미세구를 BSA로 채우고 Bradford 단백질 분석으로 60일 이상 단백질 방출 테스트를 수행했습니다. 방출은 초기 버스트로 시작하여 전기 방사 후 미세구가 분해됨에 따라 계속됩니다. 미세구는 3D 섬유질 구조 전체에서 볼 수 있습니다.

전체 골격의 이 SEM 이미지에서. 구는 화살표로 표시된 여러 레이어에서 볼 수 있습니다. 이 고배율 이미지는 그 위에 있는 골격의 나노 섬유가 있는 하나의 마이크로스피어입니다.

등뿌리 신경절(Dorsal root ganglia) 또는 DRG를 사용하여 골격 내의 미세구에서 신경 성장 인자 또는 NGF의 생존 능력을 테스트했습니다. 다음은 미세구를 포함하는 스캐폴드에 앉아 있는 DRG입니다. NGF가 적재된 것은 더 긴 신경돌기 내에 단백질이 없는 하나의 미세구 옆에 표시되며, NGF 골격의 DRG에서 확장되는 확장은 NGF가 실행 가능하고 성장을 촉진할 수 있음을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 단백질을 미세구로 캡슐화하고 섬유질 골격에 통합하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.