두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

본 절차의 전반적인 목표는 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 통해 발달 중인 생쥐 뇌의 중간 뉴런을 표적으로 삼는 것입니다. 이를 위해 먼저 주입용 바늘을 준비합니다. 두 번째 단계는 마취된 동물로부터 배아 체인을 제거하는 것입니다.

그 다음으로 뇌에 DNA 주입과 전기천공술을 수행합니다. 마지막 단계는 동물이 수술로부터 회복되도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 자궁 내 전기천공술은 중간 뉴런 서브타입의 선택적 타겟팅을 가능하게 하는 데 사용됩니다.

비특이적 자궁 내 전기천공법과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이러한 방법의 장점은, 피질 인터뉴런의 일부 집단에 대해 세포 자율적 분석을 수행할 수 있는 수단을 제공한다는 점입니다. 높은 수준의 GFP 발현을 통해 단일 인터뉴런의 시각화 및 분석이 가능합니다. 이 방법은 성숙해지는 인터뉴런의 통합을 조절하는 규칙은 무엇인가와 같이 신경발달 분야의 근본적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면, 피펫 풀러(pipette puller)를 사용하여 유리 모세관을 당겨 미세주입 피펫을 준비하십시오. 다음으로, 모세관을 조심스럽게 분리하여 미세주입용 바늘 끝 부분을 수집합니다. 이제 마취된 임신 마우스를 가열 패드 위에 복측이 위로 향하도록 놓으십시오.

수술 내내 이소플루레인(isoflurane)을 계속 공급할 수 있도록 마스크로 안면부를 덮습니다. 그 다음 양쪽 눈에 안구 윤활제를 도포합니다. 수술 후 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드를 36 °C로 설정합니다.

뒷발이나 꼬리를 꼬집어 발과 꼬리의 반사가 없는지 확인합니다. 다음으로, 복부 피부를 70% ethanol로 닦아냅니다. 핀셋을 사용하여 피부를 위로 당깁니다.

그 다음, 세 번째와 네 번째 유선 쌍의 중간 지점에서 시작하여 정중선을 따라 2cm의 작은 수직 절개를 가합니다. 라운드 포셉을 사용하여 복벽이 손상되지 않도록 주의하십시오. 배아 체인을 체강에서 조심스럽게 끌어냅니다.

체인을 물티슈 위에 올려둡니다. 먼저 자궁의 한쪽 절반을 노출시킵니다. 그런 다음 다른 쪽 절반로 이동하기 전에 배아의 전기천공법을 진행합니다.

본 절차에서는 표준 maxi prep 정제 프로토콜을 통해 얻은 펠렛을 증류수에 녹여 DNA 용액을 준비합니다. 그 다음, 주입 중 시각화가 가능하도록 DNA 용액에 fast green을 1:20 비율로 첨가합니다. 이어서, 미리 당겨진(pre pulled) 마이크로 피펫의 팁 끝부분을 미세 핀셋으로 잘라 어깨 부분의 시작점부터 팁 끝까지의 길이가 6 mm가 되도록 합니다.

그 후, 주입을 위해 fast green이 포함된 DNA 용액 1 µL를 마이크로 피펫에 채웁니다. 라운드 핀셋으로 배아의 머리 부분을 고정합니다. 피펫을 45도 각도로 뇌에 삽입하며, 정중선 근처에 위치한 외측 뇌실을 겨냥합니다.

바늘이 뇌실을 관통했다면, 피펫을 천천히 후퇴시키십시오. 용액이 뇌실을 채우기 시작하면 뇌실이 녹색으로 변해야 합니다. 이 시점에서 피펫의 이동을 멈추고 1 µL의 DNA를 주입하십시오.

그런 다음 피펫을 조심스럽게 제거합니다. ECM 830 전압 발생기를 50밀리초 지속 시간과 950밀리초의 펄스 간 간격을 갖는 45V 펄스 5회로 설정합니다. 효율적인 전류 전달을 위해 5mm 패들 전극을 PBS에 담급니다.

그런 다음 전극 패들을 배아의 머리 주변에 배치하며, DNA 용액이 들어 있는 뇌실에 양극 패들을 놓습니다. 신경절 융기(ganglionic eminences)를 통해 복측 전류가 흐르도록 양극 패들을 음극 패들보다 약간 낮게 배치하십시오. 이렇게 하면 파라메탈 세포(parametal cells)에서의 이異위성 발현을 최소화할 수 있습니다.

이제 풋 페달을 한 번 눌러 펄스를 가한 다음, 전극을 제거하고 깨끗이 닦아내십시오. 각 배아에 대해 이 단계를 반복하십시오. 모든 배아에 전기천공법을 수행한 후,

복강 내에 PBS 3 mL를 붓고 배아를 다시 복강으로 되돌려 놓습니다. 다음으로 곡선 바늘과 5-0 실크 봉합사를 사용하여 복벽을 봉합한 후 피부를 봉합합니다. 상처 부위에 리도카인을 도포하고, 초기 진통제로 kg당 120 mg의 아스피린을 투여합니다.

동물을 마취 튜브에서 분리하고, 페이퍼 와이프가 깔린 가열 패드 위에서 회복하도록 합니다. 그 후, 동물을 케이지로 돌려보냅니다. 37 °C의 가열 패드 위에 두고 건강 상태를 모니터링합니다.

본 실험에서는 전기천공법으로 도입된 중간뉴런을 CGE 유래 서브타입 마커의 발현을 통해 구분합니다. 이 이미지는 CGE 유래 중간뉴런에 DLX5/6 EGFP 플라스미드가 전기천공되었음을 보여줍니다. 이 이미지는 P8 단계의 VIP 발현 중간뉴런을 보여줍니다.

EGFP 발현은 단일 뉴런의 전체 수지상 돌기 나무와 축삭 분지 구조를 나타내며, 여기 P 8 단계의 NPY 발현 인터뉴런이 있습니다. NPY 발현은 신경교세포 형태의 세포들을 나타냅니다. 마지막으로, 여기 P 15 단계의 NPY 발현 인터뉴런이 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 특정 플라스미드와 유전자 변형 마우스 라인의 사용을 결합함으로써, 관심 유전자의 발현을 시간적 및 공간적으로 조절하는 것이 가능합니다. 일부 실험에서는 AU 의존적 트랜스진의 발현을 유도하기 위해 A-D-L-X-T-T-A 플라스미드를 사용합니다.

본 실험에서는 doxycycline을 투여하여 트랜스유전자의 발현을 억제하였습니다.