Name: 두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 학습하세요 발달 중인 마우스 전뇌의 interneurons를 in utero electroporation으로 표적하는 방법을. 이 기술은 피질 interneuron 하위 유형에서 선택적 유전자 발현을 가능하게 하여 신경발달 연구에 활용됩니다.

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우리는 기술 지원을 Lihong 음에 감사하고 있습니다. NVD는 NARSAD 젊은 연구자 상을받는 사람이며, 또한 NIH (5 K99 MH095825-02)에서 보조금에 의해 지원됩니다. Fishell 실험실에서 연구는 건강의 국립 연구소, 정신 건강 (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09)의 국립 연구소, 신경 질환 및 뇌졸중 (5 R01 NS081297-02의 국립 연구소에서 지원 한 P01 NS074972 -01A1)와 시몬스 재단.

모든 동물은 의학의 NYU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정 및 지침에 따라 처리 하였다. 마우스 균주 코닉 의해 제공 암컷 스위스 웹스터 마우스는이 실험에 사용 하였다. 특히 표면층의 interneurons를 타겟팅하기 위하여, E15.5 태아 사용 하였다. 주 : 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성 된 본 작업 (Dlx5 / 6.eGFP 플라스미드 3 μg / μL)에 사용 된 플라스미드. eGFP는 cDNA를 Dlx5 / 6 PMIN-polyA 플라스미드에 클로닝 하였다. 이 플라스미드를 요청 (demarn02@nyumc.org)에 따라 사용할 수 있습니다. 미세 주입 피펫의 1 준비 <ol><li> 860에 끌어 당기는 열 # 2를 설정합니다. </li><li> 놓고 필라멘트 근처 유리 모세관을 고정합니다. 피펫의 외경 (OD)이 약 30 μm의 있는지 확인합니다. </li><li> &quot;풀&quot;버튼을 눌러. </li><li> 조심스럽게 캐 필러를 제거합니다. 하단 부분은 바늘이다. 상단 부분을 폐기하십시오. </li></ol> 2 마취 절차 <ol><li> 이소 플루 란 수용 실을 준비합니다. 참고 : 아이소 플루 란으로 인해 자사의 빠른 동작과 부작용의 낮은 발생 빈도를 선호하는 마취제입니다. 펜 토바 비탈 다른 옵션입니다; 그러나,이 약의 허용 오차 변수 이소 플루 란보다 높은 사망률의 원인이됩니다. </li><li> 0.5 L / 분 O이 4-5 %의 이소 플루 란의 흐름을 설정합니다. </li><li> 헤드 어댑터의 밸브가 닫혀있는 반면, 챔버의 밸브가 열려 있는지 확인합니다. </li><li> 챔버에 임신 한 마우스를 놓습니다. </li><li> 마우스를 마취의 영향 아래에 갈 수 있습니다. 이 약 2 ~ 3 분 소요됩니다. 호흡 속도를 확인합니다. 마우스가과 호흡 시작하면, 이소 플루 란의 복용량을 낮 춥니 다. </li><li> 마우스를 마취 한 후, 즉시 챔버에서 제거합니다. 가열 패드에 복부 측면을 놓고 전수술을 통해 이소 플루 란을 공급하기 위해 계속 마스크를 머리를 nsert. 헤드 어댑터 조각을 연결하는 튜브에 챔버에서 이소 플루 란의 흐름을 전환해야합니다. 각각의 눈에서 눈 윤활유 한 방울을 넣고 눈을 닫습니다. </li><li> 저체온증을 최소화하기 위해 36 ° C 정도에 전기 패드를 설정합니다. </li><li> 뒷발과 꼬리를 집어 발과 꼬리 반사의 부재를 확인합니다. </li></ol> 3 외과 <ol><li> 70 % 에탄올로 복부를 덮는 피부를 정화. </li><li> 위쪽으로 피부를 당겨 집게를 사용합니다. 각 수술 후 세제와 물을 모든 기기를 세척하고, 72 ° CO / N 살균. </li><li> 유선의 세 번째와 네 번째 쌍 사이의 중간에 시작 정중선을 따라 수직 작은 절개 (약 2 ㎝)를 확인. 미세 수술 가위를 사용합니다. 복부 벽을 손상하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 복막으로부터 피부를 구분합니다. </li><li> 동맥을 시각화및 복벽에 정맥. 복강을 노출 (선박을 피) 복막을 통해 다른 2cm 수직 절개를합니다. </li><li> 동맥을 클램핑 피하는 양쪽에있는 피부와 복부 벽을 클램프. 주 : 동맥이 실수로 구멍이있는 경우, 자궁 경부 전위 또는 이소 플루 란 과다 복용을 수행하여 동물을 즉시 희생. </li><li> 37 ° C로 멸균 PBS를 따뜻하게 사전. 김 물티슈 촉촉한 PBS와 클램프를 커버. </li><li> PBS와 노출 복강 보습. 수술을 수행하는 동안이 단계를 여러 번 반복합니다. </li><li> 라운드 집게를 사용하여 부드럽게 떨어져 공간에 배아 체인 (E15.5)을 당깁니다. 물티슈의 체인 휴식을 보자. 첫번째 자궁의 절반을 노출함으로써 시작합니다. 그 안에 배아 전기 천공되면, 내부를 돌아 오게 한 후 하반기에 작동합니다. </li></ol> 4 일렉트로 <ol><li> 배아를 조작하는 라운드 집게를 계속 사용합니다. </li><li> 바이올렛측면 심실을 sualize. 중간 선 (그림 1b)을 따라 실행 측면 심실. </li><li> 빠른 그린 (주식을 10 % / w V) 추가 1:20 혼합물에 대한 DNA 용액에 주입하는 동안 시각화 할 수 있습니다. 증류수 표준 맥시 프렙 정제 프로토콜로부터 얻어진 펠릿을 용해시킴으로써 DNA 용액을 준비한다. </li><li> 빠른 그린으로 DNA 용액 (Dlx5 / 6-eGFP는, 3 μg / μL) 1 ㎖를 주입하는 플런저 미리 뽑아 마이크로 피펫을 사용합니다. 피펫을 넣기 전에 바늘의 팁 단부에 어깨의 선두로부터 6mm 길이를 남겨 미세 forcep # 5 (듀)를 마이크로 피펫의 선단을 잘라. 라운드 핀셋으로 태아의 머리를 잡아. 중간 선 근처에있는 뇌실 목표로하는 45 ° 각도로 피펫 뇌를 입력합니다. 바늘이 뇌실을 관통하는 경우가 DNA를 주입 플런저를 사용할 때, 천천히 피펫을 철회. 심실이 녹색해야 할 때솔루션을 작성하기 시작합니다. 이 시점에서, 피펫을 움직이는 멈추고 DNA 1 ㎖를 주입. 조심스럽게 피펫을 철회. </li><li> 950 밀리 초 간격으로 50 밀리의 오 45V 펄스 CUY21의 electroporator을 설정합니다. </li><li> E15.5 배아에 대한 5mm 패들 전극을 사용합니다. 효율적인 전류 전송을 보장하기 위해 PBS에 전극을 담근다. </li><li> DNA 솔루션을 포함하는 심실에 긍정적 인 패들과 태아의 머리 주위에 전극 패를 놓습니다. 약간 신경절 eminences을 통해 복부 전류를 만들 수있는 음의 일의 대한 긍정적 인 패를 내립니다. 이 조작은 피라미드 세포에서 이소 식을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 전극을 배치 한 후, 한 번 풋 페달을 눌러 펄스를 제공한다. </li><li> 전극을 제거하고 깨끗하게 닦아주십시오. 반복 각 배아와 4.6-4.9 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 배아를 electroporating 후 복강에 PBS 3 ㎖를 부어 복강에 반환. </li><li>제 봉합사 곡선 바늘과 5-0 실크 봉합사 후 피부 복벽. 상처에 리도카인 (4 %)을 적용합니다. 진통제 아스피린 내 복막의 120 ㎎ / ㎏을 관리 할 수​​ 있습니다. 주 : 전체 절차는 20 분 이하로 수행되어야한다. 그것은 초보자는 짧은 수술 시간을 유지하기 위해 몇 배아를 electroporate하는 것이 좋습니다. 장시간 수술 배아의 생존율을 감소한다. </li><li> 마취 튜브에서 동물을 제거하고 종이에 가열 패드에 복구를 닦아 수 있습니다. </li><li> 케이지에 동물을 돌려 37 ° C에서 가열 패드에 그것을 유지하고 건강 상태를 모니터링 할 수 있습니다. 동물은 일반적으로 수술을 잘 견딜 그들이 마취 튜브에서 제거 된 직후 서서히 이동하기 시작합니다. 과도한 출혈이나 혼수가 관찰되는 경우, IACUC는 자궁 경부 전위 또는 마취 과다 복용으로 안락사 절차를 승인 수행하여 즉시 동물을 희생. </li><li> 비바에 케이지를 반환rium. 여성은 분만 자연적으로 줄 것이다. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
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<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

기술의 한계 이 기술은 셀 프로세스 셀 자율적 분석이 가능하지만,이 집단 분석에 적합하지 않다. electroporations 뇌 당 electroporation하여보다 천 세포와 매우 드물다. 결과적으로, 기술은 CGE의 interneurons 유래의 유전자 조작으로 인한 행동 결과를 평가하기 위해 사용될 수 없다. electroporations가 E13.5-E14.5 대상 MGE에서 파생 된 하위 유형에서 수행하지만, 효율이 낮은 10입니다. 우리는 Dlx5 / 6 증강 적어도 에피 솜 표현의 맥락에서 postmitotic MGE의 하위 유형이 덜 활성화되어 있음을 추측. 기존 방법에 대한 의의 이 기술의 interneurons의 연구 이전에 전기 천공 법 (electroporatio...

대뇌 피질의 GABA 성의의 interneurons의 대부분은 중간과 꼬리 신경절 eminences (각각 MGE 및 CGE)을 명명 된이 과도 배아 구조에서 발생 4. Parvalbumin 및 소마토스타틴 (somatostatin) 표현의 interneurons는의​​ interneurons는 CGE에서 발생 표현 Calretinin 반면 MGE 크롬 (Cr), Vasointestinal 펩티드 (VIP) 및 Reelin (재)에서 발생. 이 interneuron 하위 유형은 자신의 생일에 의해 구별 될 수있다. MGE 파생 된 하위 유형은 배아 일 9.5 (E9.5)와 e16.5 5,6 사이에서 태어난다. 반면, CGE 유래의 interneurons는 생산이 E15.5 6 고점으로 E18.5 통해 E12.5에서 태어난다. 늦게 태어난 인구의 유전자 타겟팅은, 그러나, 어려운 남아있다. 쥐의 말초없는 (DLX) 유전자를 독점적으로 개발 복부 전뇌 3 표현됩니다. GABA 성의 선조체의 interneurons 및 투영 아니라 피질 뉴런 피라미드 세포 Dlx1 표현할초기 발달 단계 3에서 2,5, 6 유전자. 실제로, DLX 유전자는 모든 GABA 성 전구 세포의 MGE 및 CGE 뇌실 영역 (SVZ)로 표현된다. 이들 유전자의 발현은 postmitotic 단계 7-9에서 서브 타입을 선택하도록 제한된다. 이전 실험적 증거는 Dlx5 / 6 인핸서 요소가 형질 전환 마우스 모델 2에서 GABA 성 계통의 선택 타겟팅을 허용 것으로 나타났다. 우리는 현상 마우스 뇌에서 에피 솜 발현의 문맥에서 이들 인핸서 요소 중 하나의 사용을 시험 하였다. 우리는 최소한의 발기인 및 bluescript (BS) 백본 플라스미드의 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) (그림 1)과 함께 Dlx5 / 6 증강 요소를 복제 서브. 우리는 선택적으로 CR-, VIP를 대상으로 E15.5에서 자궁 일렉트로에 의해 플라스미드를 도입 재는 3,8,10을 아류. 우리의 기술은 용이 스파 스 일렉트로, 수 있습니다그을음 세포의 형태 학적 특징의 재건입니다. 또한, 피질 GABA 성 뉴런의 유전자 발현의 예외적으로 높은 수준의 기능 연구를 허용한다. 우리는 손실과 여러 야생 유형 및 지배적 인 부정적인 유전자 11를 사용하여 기능 연구의 이득을 실시했다.

<table><tbody><tr><td>페달이 있는 Electroporator&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5mm 패들 전극&nbsp;</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>히팅 패드&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-15</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Instruments P30 풀러&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>3282322</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac 마취 시스템</td><td>하버드 장치</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 운영 가위 4.75" 스트레이트 샤프/샤프</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 실크 블랙 브레이드 18" C-1 박스 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 클립 적용 펜치 5.5"</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 클램프 가위</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>홀딩 펜치&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 튜빙&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID</td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

중추 신경계 (CNS) 성숙의 연구는 신경 세포 집단의 유전자 타겟팅에 의존한다. 그러나, 특정 신경 세포 아형의 관심의 유전자의 발현을 제한하는 작업으로 인해 특정 프로모터 요소의 상대적 부족에 현저 도전 입증되었다. GABA 성의의 interneurons 광범위한 유전 적, 형태 적 다양성을 가진 신경 세포의 인구를 구성한다. 실제로, GABA 성의의 interneurons의 11 개 이상의 서로 다른 하위 유형 마우스 피질 한 것을 특징으로하고있다. 여기에서 우리는 GABA 성 인구의 표적으로 선택에 대한 적응 프로토콜을 제시한다. 우리는 호 메오 박스 (homeobox) 전사의 증강 요소를 사용하여 GABA 성의의 interneurons의 하위 표적으로 선택 달성 자궁 일렉트로 특정 유전자의 발현을 통해 운전 Dlx5 및 Dlx6, 초파리 말초없는 (DLL) 유전자 2,3의 상 동체를, 요인.

우리는 성숙 뉴런 세포 유형 특정한 타겟팅을 달성하기에 자궁 일렉트로 기법을 적응. CGE 유래의 interneurons에서 eGFP는의 발현을 구동하기 위해, 우리는 Dlx5 / 6 증강 요소를 사용 E15.5에 우리의 주사를 제한, 무대 CGE 유래의 interneurons의 대부분이 발생하는 경우. 우리는 P8에서 분석을 수행하고 P15 (11) (도 1 및도 2). 우리는 E15.5에서 몰 농도에서 CAG-mCherry 및 Dlx5 / 6 eGFP는 플라스미드를 electroporating 공동으로 electroporation하여 신경 세포의 복부 출처를 확인했다. 이 실험에서, 우리는 뇌실 영역 (SVZ)의 공동에있는 유일한 복부 전구 세포가 모두 단백질 11을 표명 것을 관찰했다. 형광 단백질의 발현이 시공 시간은 심실하지만 subventr 표현되지 Dlx5 6 유전자...

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

본 절차의 전반적인 목표는 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 통해 발달 중인 생쥐 뇌의 중간 뉴런을 표적으로 삼는 것입니다. 이를 위해 먼저 주입용 바늘을 준비합니다. 두 번째 단계는 마취된 동물로부터 배아 체인을 제거하는 것입니다.그 다음으로 뇌에 DNA 주입과 전기천공술을 수행합니다. 마지막 단계는 동물이 수술로부터 회복되도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 자궁 내 전기천공술은 중간 뉴런 서브타입의 선택적 타겟팅을 가능하게 하는 데 사용됩니다.비특이적 자궁 내 전기천공법과 같은 기존 기술과 비교했을 때 이러한 방법의 장점은, 피질 인터뉴런의 일부 집단에 대해 세포 자율적 분석을 수행할 수 있는 수단을 제공한다는 점입니다. 높은 수준의 GFP 발현을 통해 단일 인터뉴런의 시각화 및 분석이 가능합니다. 이 방법은 성숙해지는 인터뉴런의 통합을 조절하는 규칙은 무엇인가와 같이 신경발달 분야의 근본적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차를 시작하려면, 피펫 풀러(pipette puller)를 사용하여 유리 모세관을 당겨 미세주입 피펫을 준비하십시오. 다음으로, 모세관을 조심스럽게 분리하여 미세주입용 바늘 끝 부분을 수집합니다. 이제 마취된 임신 마우스를 가열 패드 위에 복측이 위로 향하도록 놓으십시오.수술 내내 이소플루레인(isoflurane)을 계속 공급할 수 있도록 마스크로 안면부를 덮습니다. 그 다음 양쪽 눈에 안구 윤활제를 도포합니다. 수술 후 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드를 36 °C로 설정합니다.뒷발이나 꼬리를 꼬집어 발과 꼬리의 반사가 없는지 확인합니다. 다음으로, 복부 피부를 70% ethanol로 닦아냅니다. 핀셋을 사용하여 피부를 위로 당깁니다.그 다음, 세 번째와 네 번째 유선 쌍의 중간 지점에서 시작하여 정중선을 따라 2cm의 작은 수직 절개를 가합니다. 라운드 포셉을 사용하여 복벽이 손상되지 않도록 주의하십시오. 배아 체인을 체강에서 조심스럽게 끌어냅니다.체인을 물티슈 위에 올려둡니다. 먼저 자궁의 한쪽 절반을 노출시킵니다. 그런 다음 다른 쪽 절반로 이동하기 전에 배아의 전기천공법을 진행합니다.본 절차에서는 표준 maxi prep 정제 프로토콜을 통해 얻은 펠렛을 증류수에 녹여 DNA 용액을 준비합니다. 그 다음, 주입 중 시각화가 가능하도록 DNA 용액에 fast green을 1:20 비율로 첨가합니다. 이어서, 미리 당겨진(pre pulled) 마이크로 피펫의 팁 끝부분을 미세 핀셋으로 잘라 어깨 부분의 시작점부터 팁 끝까지의 길이가 6 mm가 되도록 합니다.그 후, 주입을 위해 fast green이 포함된 DNA 용액 1 µL를 마이크로 피펫에 채웁니다. 라운드 핀셋으로 배아의 머리 부분을 고정합니다. 피펫을 45도 각도로 뇌에 삽입하며, 정중선 근처에 위치한 외측 뇌실을 겨냥합니다.바늘이 뇌실을 관통했다면, 피펫을 천천히 후퇴시키십시오. 용액이 뇌실을 채우기 시작하면 뇌실이 녹색으로 변해야 합니다. 이 시점에서 피펫의 이동을 멈추고 1 µL의 DNA를 주입하십시오.그런 다음 피펫을 조심스럽게 제거합니다. ECM 830 전압 발생기를 50밀리초 지속 시간과 950밀리초의 펄스 간 간격을 갖는 45V 펄스 5회로 설정합니다. 효율적인 전류 전달을 위해 5mm 패들 전극을 PBS에 담급니다.그런 다음 전극 패들을 배아의 머리 주변에 배치하며, DNA 용액이 들어 있는 뇌실에 양극 패들을 놓습니다. 신경절 융기(ganglionic eminences)를 통해 복측 전류가 흐르도록 양극 패들을 음극 패들보다 약간 낮게 배치하십시오. 이렇게 하면 파라메탈 세포(parametal cells)에서의 이異위성 발현을 최소화할 수 있습니다.이제 풋 페달을 한 번 눌러 펄스를 가한 다음, 전극을 제거하고 깨끗이 닦아내십시오. 각 배아에 대해 이 단계를 반복하십시오. 모든 배아에 전기천공법을 수행한 후,복강 내에 PBS 3 mL를 붓고 배아를 다시 복강으로 되돌려 놓습니다. 다음으로 곡선 바늘과 5-0 실크 봉합사를 사용하여 복벽을 봉합한 후 피부를 봉합합니다. 상처 부위에 리도카인을 도포하고, 초기 진통제로 kg당 120 mg의 아스피린을 투여합니다.동물을 마취 튜브에서 분리하고, 페이퍼 와이프가 깔린 가열 패드 위에서 회복하도록 합니다. 그 후, 동물을 케이지로 돌려보냅니다. 37 °C의 가열 패드 위에 두고 건강 상태를 모니터링합니다.본 실험에서는 전기천공법으로 도입된 중간뉴런을 CGE 유래 서브타입 마커의 발현을 통해 구분합니다. 이 이미지는 CGE 유래 중간뉴런에 DLX5/6 EGFP 플라스미드가 전기천공되었음을 보여줍니다. 이 이미지는 P8 단계의 VIP 발현 중간뉴런을 보여줍니다.EGFP 발현은 단일 뉴런의 전체 수지상 돌기 나무와 축삭 분지 구조를 나타내며, 여기 P 8 단계의 NPY 발현 인터뉴런이 있습니다. NPY 발현은 신경교세포 형태의 세포들을 나타냅니다. 마지막으로, 여기 P 15 단계의 NPY 발현 인터뉴런이 있습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 특정 플라스미드와 유전자 변형 마우스 라인의 사용을 결합함으로써, 관심 유전자의 발현을 시간적 및 공간적으로 조절하는 것이 가능합니다. 일부 실험에서는 AU 의존적 트랜스진의 발현을 유도하기 위해 A-D-L-X-T-T-A 플라스미드를 사용합니다.본 실험에서는 doxycycline을 투여하여 트랜스유전자의 발현을 억제하였습니다.

subtype-selective-electroporation-of-cortical-interneurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

이 비디오는 다양한 체외 해마 절편 배양에서 흥분성 및 억제성 뉴런 모두에 있는 유전자의 단세포 전기천공을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 기술은 세포 자율 메커니즘 및 시냅스 전달 단백질 상호 작용을 포함하여 뉴런의 특정 분자 및 생리학적 기능을 검사하는 데 유용합니다.

Organotypic Brain Slice Cultures의 Single Cell Electroporation: An In Vitro Technique to Deliver Plasmids inside Targeted Neurons in Brain Hippocampal Slices(유기형 뇌 슬라이스 배양에서의 단세포 전기천공법: 뇌 해마 슬라이스의 표적 뉴런 내부에 플라스미드를 전달하는 체외 기술)

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

여기에서는 전기천공법에 의한 절쇄된 인간 피질 오가노이드의 급성 유전자 조작을 제시합니다. 이러한 피질 오가노이드 모델은 절단 후 심실과 같은 구조를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 특히 주입이 용이하여 인간의 피질 발달, 신경 발달 장애 및 피질 진화에 대한 기능적 연구를 가능하게 합니다.

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

학습하세요 발달 중인 마우스 전뇌의 interneurons를 in utero electroporation으로 표적하는 방법을. 이 기술은 피질 interneuron 하위 유형에서 선택적 유전자 발현을 가능하게 하여 신경발달 연구에 활용됩니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

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