두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)을 통해 발달 중인 마우스 4개의 뇌에 있는 인턴 뉴런을 표적으로 삼는 것입니다. 이것은 먼저 주사 바늘을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마취된 동물에서 배아 사슬을 제거하는 것입니다.

그런 다음 뇌에서 DNA 주입과 전기천공법이 수행됩니다. 마지막 단계는 동물이 수술에서 회복할 수 있도록 하는 것입니다. 궁극적으로, 자궁에서 전기천공법은 뉴런 간 아형을 선택적으로 표적으로 삼을 수 있도록 사용됩니다.

자궁 전기 작동의 비특이적 방식과 같은 기존 기술의 이러한 방법의 장점은 피질 간 뉴런의 하위 집합에 대한 세포 자율 분석을 수행할 수 있는 수단을 제공한다는 것입니다. GFP 표현의 상상부는 단 하나 inter.의 구상 그리고 분석을 허용한다. 이 방법은 신경 발달 분야의 근본적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 성숙 inter의 통합을 지배하는 규칙은 무엇입니까?

이 절차를 시작하려면 피펫 풀러로 유리 모세관을 당겨 미세주입 피펫을 준비합니다. 그런 다음 모세 혈관을 조심스럽게 제거하고 미세 주입을 위해 하단 바늘을 수집합니다. 이제 마취된 임산부 마우스 복부 쪽이 위로 향하게 하여 가열 패드에 놓습니다.

수술 내내 불소를 계속 공급할 마스크로 운명을 덮으십시오. 그런 다음 양쪽 눈에 눈 윤활제를 바릅니다. 나중에 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드를 섭씨 36도로 설정하십시오.

뒷발이나 꼬리를 꼬집어 발과 꼬리 반사 신경이 없는지 확인합니다. 다음으로 70% 에탄올로 복부 피부를 청소합니다. 집게를 사용하여 피부를 위로 당깁니다.

그런 다음 세 번째와 네 번째 유선의 중간에서 시작하여 정중선을 따라 2cm의 작은 수직 절개를 만듭니다. 둥근 집게를 사용하여 복벽을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 배아 사슬을 구멍에서 부드럽게 당겨 빼냅니다.

체인을 물티슈에 올려 놓습니다. 자궁의 절반을 노출시키는 것부터 시작한다. 그런 다음 다른 절반으로 이동하기 전에 배아의 전기천공을 계속합니다.

이 절차에서는 표준 maxi prep 정제 프로토콜에서 얻은 펠릿을 증류수에 용해하여 DNA 용액을 준비합니다. 그런 다음 주입 중에 시각화할 수 있도록 DNA 용액에 1:20의 비율로 빠른 녹색을 추가합니다. 다음으로, 어깨 시작에서 팁 끝까지 6mm를 남겨 두기 위해 미리 당겨진 마이크로 피펫의 끝을 미세한 집게로 자릅니다.

그 후, 마이크로 피펫에 1마이크로리터의 DNA 용액을 주입을 위해 빠른 녹색으로 로드합니다. 둥근 핀셋으로 배아의 머리를 잡습니다. 정중선 근처에 위치한 외심실을 목표로 45도로 뇌에 피펫을 삽입합니다.

바늘이 심실을 관통하면 피펫을 천천히 집어넣습니다. 심실은 용액이 심실을 채우기 시작할 때 녹색으로 변해야 합니다. 이 시점에서 피펫 이동을 멈추고 1마이크로리터의 DNA를 주입합니다.

그런 다음 피펫을 부드럽게 빼냅니다. ECM 8 30 ator를 950밀리초 인터 펄스 간격으로 50밀리초 간격의 5 45볼트 펄스로 설정합니다. 효율적인 전류 전송을 보장하기 위해 5mm 패들 전극을 PBS에 담그십시오.

그런 다음 DNA 용액이 들어 있는 심실에 양극 패들로 배아의 머리 주위에 전극 패들을 놓습니다. 포지티브 패들을 음수 패들보다 약간 낮게 배치하여 신경절 돌출부를 통해 복부 전류를 생성합니다. 이것은 parametal 세포에서 이소성 발현을 최소화합니다.

이제 풋 페달을 한 번 눌러 펄스를 전달한 다음 전극을 제거하고 깨끗하게 닦습니다. 각 배아에 대해 단계를 반복합니다. 모든 배아를 전기 pering 후.

PBS 3ml를 복강에 붓고 배아를 복강으로 되돌립니다. 다음으로, 구부러진 바늘과 5개의 실크 봉합사로 복벽을 봉합한 다음 피부를 봉합합니다. 상처에 리도카인을 바르고 진통제를 위해 아스피린 1kg당 120mg을 투여합니다.

마취 튜브에서 동물을 제거하고 종이 닦음의 가열 패드에서 회복할 수 있도록 합니다. 그런 다음 동물을 우리로 되돌립니다. 섭씨 37도의 발열 패드에 보관하고 건강 상태를 모니터링하십시오.

이 실험에서, 전기천공된 인터 뉴런은 CGE E 유래 아형 마커의 발현에 의해 묘사됩니다. 이 이미지는 CGE 유래 inter neuron이 DLX five six EGFP 플라스미드로 전기천공되었음을 보여줍니다. 이 이미지는 VIP가 P 8에서 인터 뉴런을 발현하는 것을 보여줍니다.

EGFP 발현은 단일 뉴런의 전체 수지상 나무와 축삭 아버를 묘사하며, 다음은 P 8에서 뉴런 사이를 발현하는 NPY입니다. NP y 발현은 신경교세포를 나타냅니다. 마지막으로, 다음은 P 15에서 인터 뉴런을 발현하는 NPY입니다.

이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 20분 안에 완료할 수 있습니다. 특정 플라스미드와 유전자 변형 마우스 라인의 사용을 결합함으로써 관심 유전자의 발현에서 시간적이고 특별한 제어를 달성할 수 있습니다. 일부 실험에서는 A-D-L-X-T-T-A 플라스미드를 사용하여 AU 의존성 전이유전자의 발현을 유도합니다.

이 실험에서 우리는 독시사이클린을 투여하여 전이유전자의 조용한 발현을 수행합니다.