두 광자 생체 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상
May 12th, 2014
살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 두 개의 광자 현미경을 통해 살아있는 쥐 피질에서 형광 표지된 시냅스 구조인 경두개 이미징을 허용하는 것입니다. 마우스 마취 후 첫 번째 단계는 얇아진 두개골 준비를 수행하는 것입니다. 다음으로, 마우스의 머리는 맞춤형 고정 플레이트를 사용하여 고정됩니다.
그런 다음 두 개의 광자 현미경을 사용하여 얇아진 두개골을 통해 이미지 스택을 획득합니다. 궁극적으로는 재배치와 이미징입니다. 이전에 이미지화된 영역을 통해 다양한 조건에서 서로 다른 기간에 걸쳐 수상돌기 가시의 역학을 추적할 수 있었습니다.
수술을 준비하기 위해 케타민과 자일라진으로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집기를 수행하여 완전한 마취를 보장합니다. 그런 다음 마우스를 가열 패드에 놓고 면도날을 사용하여 머리를 면도합니다. 알코올 패드를 번갈아 가며 피부를 닦아 면도한 부위를 소독하고 잔여 모발을 제거합니다.
또한 양쪽 눈에 안연고를 부드럽게 바릅니다. 그런 다음 두피의 정중선을 따라 직선으로 절개하고 피부를 두개골 가장자리를 향해 측면으로 움직입니다. 그런 다음 두개골에 부착된 결합 조직을 제거하여 얇아진 두개골 준비를 시작합니다.
먼저, 정중선 및 bgma에 대한 상대적 위치를 기반으로 원하는 이미징 영역을 식별합니다. 그런 다음 두개골에 식염수를 적셔 혈관 구조를 관찰하면 혈관이 큰 부위의 두개골이 얇아지는 것을 방지할 수 있습니다. 0.5에서 1mm 직경의 영역을 선택했으면 고속 마이크로 드릴을 사용하여 두개골의 원형 영역을 얇게 만듭니다.
드릴을 두개골에 대고 누르지 말고 두개골 표면과 평행하게 움직여 과열로 인한 손상을 방지하십시오. 외부의 조밀한 뼈 층과 중간 해면질 뼈 층이 모두 제거될 때까지 드릴 비트와 두개골 드릴 사이의 장기간 접촉을 피하십시오. 다음으로, 약 45도로 유지되는 미세 수술 블레이드를 사용하여 드릴 얇아진 부위 중앙의 안쪽 조밀한 뼈층을 얇게 만듭니다.
약 20-30 μm 두께의 직경 200-300 μm의 균일하게 얇아진 영역이 얻어질 때까지 두개골을 누르지 않고 두개골을 긁습니다. 두개골이 충분히 얇아지면 뼈 파편을 조심스럽게 제거합니다. 다음 단계는 날카로운 모서리가 테이프로 덮인 면도날로 만들어진 헤드 플레이트를 부착하는 것입니다.
헤드 플레이트의 중앙 개구부의 각 가장자리에 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 떨어뜨리는 것으로 시작합니다. 그런 다음 얇은 부위의 중앙에 헤드 플레이트를 놓습니다. 두개골에 단단히 대고 잡으십시오.
이제 두개골 측면에서 헤드 플레이트의 중앙 개구부 가장자리까지 피부를 부드럽게 당깁니다. 헤드 플레이트를 1-2분 동안 제자리에 고정합니다. 그런 다음 헤드 플레이트가 두개골에 잘 부착될 때까지 8-9분 더 기다립니다.
10분 후 헤드 플레이트를 고정 플레이트의 두 측면 블록에 놓습니다. 그런 다음 헤드 플레이트의 가장자리에 있는 나사를 조여 고정 플레이트에 마우스를 고정합니다. 해부 현미경을 통해 쥐의 머리를 보면서 머리가 제대로 고정되어 있는지 확인하기 위해 쥐의 등을 부드럽게 덧대십시오.
다음으로, 이전에 이미지화된 영역을 재배치하기 위해 중합되지 않은 접착제를 제거하기 위해 식염수로 두개골을 노출시켰습니다. 후속 이미징 세션에서 노출된 두개골의 얇아진 영역의 혈관 구조를 촬영하여 맵 1로 지정합니다. 그런 다음 마우스를 이미징 현미경 아래에 놓고 10 x air 대물렌즈 아래에서 얇아진 부분을 찾습니다.
에피 형광을 사용하여 가장 얇은 영역을 뷰의 중앙으로 이동합니다. 이제 두개골 상단에 식염수 한 방울을 추가하고 60 x 대물렌즈로 전환합니다. 개별 수상돌기 가시가 수상돌기를 따라 명확하게 시각화되는 영역을 선택합니다.
epi fluorescent view와 vasculature photo 사이의 혈관 구조를 비교하여 map one에서 해당 영역을 식별하고 레이블을 지정합니다. 다음으로, 플루오로 4에 따라 두 광자 레이저 파장을 조정합니다. 그런 다음 60 x 대물렌즈를 사용하여 Z축을 따라 약 200마이크로미터 x 200마이크로미터 영역을 커버하는 2마이크로미터 스텝의 이미지 스택을 획득합니다.
이것은 맵 2로 지정되며 후속 이미징 세션 동안 이미지 수지상 세그먼트를 재배치하는 데 사용됩니다. 이제 3개의 x 디지털 줌을 사용하여 맵 2 내에서 9개의 이미지 스택을 획득합니다. 각 이미지 스택은 Z축을 따라 0.7마이크로미터 단계로 70마이크로미터 x 70마이크로미터의 대략적인 영역을 커버합니다.
이미징 후 두개골에서 헤드 플레이트를 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 미세 수술 블레이드를 사용하여 두개골에 남아 있는 접착제를 제거합니다. 그런 다음 두개골과 피부를 식염수로 여러 번 헹구고 멸균 수술 봉합사로 두피를 봉합합니다.
회복하는 동안 동물을 별도의 케이지에 있는 발열 패드에 보관하고 수술 후 통증을 위해 부프레노르핀 진통제를 피하로 투여합니다. 완전히 회복된 후 동물을 집 게이지로 되돌립니다.다른 날 수상돌기를 다시 이미지화하려면 동물을 마취하고 두개골을 노출시킵니다. 이전과 마찬가지로 헤드 플레이트를 장착하고 고정 플레이트에 부착하여 헤드 고정을 반복합니다.
그런 다음 혈관 구조 패턴을 비교하여 1을 매핑하고 수지상 가지 패턴을 2를 매핑하여 이전에 이미지화된 영역을 찾습니다. 일주일 이내에 재이미징을 수행하면 새로 자란 뼈의 얇은 층을 미세 수술 블레이드로 제거할 수 있습니다. 일주일 이상 경과한 후 재이미징을 수행하는 경우 먼저 마이크로 드릴을 사용한 다음 마이크로 수술 블레이드를 사용하여 두개골을 얇게 만듭니다.
이제 두 개의 광자 현미경 아래에서 위치와 방향을 조정하여 이전에 촬영한 이미지 스택과 일치하는 이미지 스택을 얻습니다. 이미지를 획득한 후 마우스가 이전과 같이 회복하여 케이지로 되돌릴 수 있도록 하고, 맵 1로 지정된 얇은 두개골 영역을 둘러싼 혈관 패턴의 이미지를 사용하여 모든 후속 이미징 세션을 참조합니다. 블랙 박스는 두 개의 광자 생체 내 이미지가 획득된 영역을 나타냅니다.
생후 1개월 된 쥐의 운동 피질에 있는 이 수상돌기 가지 이미지는 맵 2로 지정됩니다. 흰색 상자는 이미징을 위해 선택한 수지상 세그먼트를 보여줍니다. 시간이 지남에 따라 동일한 수지상 분절에 대해 0일차, 2일차, 4일차 및 8일차에 대해 두 개의 광자 이미징이 수행되었습니다.
새로 형성된 척추. 즉, 이전 이미징 세션에 존재하지 않았던 척추는 이미징 세션 사이에 제거된 화살촉 가시가 화살표로 표시됩니다. 필립 포디아(Philip Podia)는 마스터링되면 별에 의해 표시됩니다.
이 기술은 적절하게 수행되면 1-2시간 안에 완료할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 생쥐 뇌피질의 형광 표지된 시냅스 구조의 경두개 영상화 방법을 2광자 현미경을 사용하여 제시합니다. 박피 두개골 준비법을 통해 시간에 따른 온전한 뇌의 구조 재조직화를 상세하게 관찰할 수 있습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 영상 기술
- 시냅스 동태학
배경
- 시냅스 구조를 이해하는 것은 신경과학 연구에 중요합니다.
- 기존 영상 방법은 생체 내 관찰을 허용하지 않을 수 있습니다.
- 2광자 현미경은 고해상도 영상 촬영 능력을 제공합니다.
- 박피 두개골 준비법은 이러한 영상 촬영을 위한 새로운 접근 방법입니다.
연구 목적
- 생쥐의 시냅스 구조에 대한 경두개 영상 촬영을 가능하게 합니다.
- 시간에 따른 수지상 가시의 동태를 관찰합니다.
- 뇌의 구조 재조직화 연구를 촉진합니다.
사용된 방법
- 생쥐에게 마취를 시킵니다.
- 박피 두개골 준비를 수행합니다.
- 맞춤형 고정 플레이트로 생쥐의 머리를 고정합니다.
- 2광자 현미경을 사용하여 박피 두개골을 통해 이미지 스택을 획득합니다.
주요 결과
- 형광 표지된 시냅스 구조의 성공적인 영상 촬영.
- 시간에 따른 수지상 가시의 동태를 추적할 수 있습니다.
- 생쥐 뇌피질의 구조적 변화에 대한 통찰력.
- 박피 두개골 준비법의 효과성 입증.
결론
- 박피 두개골 준비법은 신경과학 연구에 유용한 기술입니다.
- 2광자 현미경은 상세한 생체 내 영상 촬영을 허용합니다.
- 이 방법은 시냅스 동태학에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
High-resolution two-photon in vivo imaging of dendritic spines in the mouse cortex enables direct observation of synaptic structural dynamics over time, supporting mechanistic de-risking in neurobiology discovery. This approach provides predictive confidence for target validation and pathway interrogation in CNS drug discovery portfolios. The method's repeatability and minimal invasiveness facilitate longitudinal studies critical for translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of synaptic remodeling, informing target engagement and pathway relevance.
- Supports functional validation of synaptic plasticity mechanisms in disease-relevant neural circuits.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing repeated, quantitative assessment of dendritic spine dynamics.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for evaluating compound effects on synaptic structure.
- Enables reproducible, quantitative imaging outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Supports assay standardization by mapping and relocating identical dendritic segments over multiple sessions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling imaging in various cortical regions and cell types under physiological and pathological states.
- Facilitates longitudinal biomarker studies by tracking synaptic changes over extended periods.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, repeatable in vivo measurements.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational research in CNS portfolios.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of synaptic changes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging data for compound evaluation in live neural tissue.
- Analytics: Provides high-content image stacks and quantitative spine turnover metrics for statistical comparison.
- Translational Research: Enables continuity by allowing repeated imaging in the same animal across time points and conditions.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS targets, cell types, and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in synaptic target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust longitudinal data collection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy and small animal surgical techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and custom head immobilization hardware.
- Necessitates rigorous cross-session mapping and standardization for longitudinal studies.
- Adaptable to various cortical regions, layers, and cell types as supported by the protocol.
- Limited by the need for precise skull thinning and potential regrowth of bone over time.
