Name: 두 광자 생체 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 두 광자 현미경과 두개골 박리법을 이용하여 생체 마우스 피질에서 시냅스 구조와 수상돌기 돌기의 동태를 관찰하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 구조적 재구성을 실시간으로 추적하는 데 활용됩니다.

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우리는 그래픽 제임스 Perna 감사합니다. 이 작품은 YZ에 정신 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다

승인은 수술 및 이미징 연구의 개시 전에 홈 기관에서 얻을 수 있어야합니다. 이 논문에 기술 된 실험은 캘리포니아 대학 산타 크루즈 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 규정에 따라 수행되었다. 1. 수술 <ol><li> 모든 수술 도구를 압력솥 철저하게 수술 전 70 % 알코올로 작업 영역을 소독. </li><li> KX 마취 용액 (200 ㎎ / kg 케타민 20 ㎎ / kg 자일 라진)을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취 마우스의 체중에 따라 주 :. KX 투여는 건강 상태는 스트레인, 연령에 따라 조절 될 수 있고, 마우스. 최적의 복용량을 결정하는 수의 상담도 추천합니다. </li><li> 마우스의 발가락을 눌러 마취 상태를 모니터링 할 수 재귀 응답을 확인하여 주기적으로 발가락 핀치 테스트를 수행합니다.마우스가 완전히 수술을 시작하기 전에 마취되어 있는지 확인합니다주의 :. 장시간 영상 세션 동안, 필요한 경우 추가 KX를 리다, 주기적으로 마우스의 마취 상태를 확인합니다. </li><li> 수술 동안 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 배치. </li><li> 두피를 노출하는 면도날을 사용하여 쥐의 머리를 면도. </li><li> 알코올 패드와 베타 딘을 교대로 피부를 닦아 면도 영역을 소독. 잔여 머리를 잘라낸를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 따라서 실험 기간 동안 탈수로 인한 영구적 인 손상을 방지, 두 눈을 윤활 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 두피의 중간 선을 따라 직선 절개를 확인하고, 두개골의 가장자리를 향해 옆으로 피부를 이동합니다. </li><li> 두개골에 부착 된 결합 조직을 제거합니다. </li></ol> 2. 시닝 두개골 준비 <ol><li> STER에 근거 촬상 영역을 식별. eotaxic 좌표 참고 : 큰 혈관, 블록 등의 침투를 방지하고 몇 군데 구조를 흐리게하십시오. 두개골은 멸균 식염수 촉촉한 때 혈관이 최고의 관찰된다. </li><li> 두개골 (0.5 ~ 1.0 mm 직경)의 얇은 원형 영역에 고속 마이크로 드릴을 사용합니다. 오히려 두개골에 대해 그것을 잡고 아래로 눌러보다 두개골 표면에 드릴 평행 이동합니다. 드릴은 외부 컴팩트 뼈의 층과 중간 해면골 층까지 모두 제거됩니다 참고 :. 과열로 인한 손상을 방지하려면, 드릴 비트와 두개골 사이의 장기간의 접촉을 피할 것. </li><li> 드릴 얇게 지역의 중심에 미세 수술 블레이드 내부 컴팩트 뼈 층을 얇게 계속합니다. 균등 대략의 두께로 작은 영역 (200 ~ 300 μm의 직경)를 얇게 할 때까지 머리에 아래로 누르지 않고 두개골을 긁어 약 45 °의 각도로 미세 수술 날을 잡고LY 20 ~ 30 μm의를 얻을 수있다. . 인해 두개골의 자동 형광으로, 두께는 이광자 현미경 주 미만의 두개골 상부 및 하부면 사이의 거리를 스캐닝함으로써 측정 될 수있다 : 20μm 미만의 두개골 두께가 좋은 화상 품질을 제공하지만 그것은 이후의 재 이미징 세션의 숱이 과정을 어렵게하기 때문에하지 않는 것이 좋습니다. 지나치게 숱이 방지하기 위해, 두개골의 두께는 (토론 참조) 수술하는 동안 정기적으로 점검 할 필요가있다. </li></ol> 3. 고정화 <ol><li> 조심스럽게 뼈 파편을 제거합니다. </li><li> 압력 가마로 소독 된 멸균 헤드 판의 중심 개구의 각 가장자리에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 방울 (그림 1 참조)를 놓습니다. . 개구부의 중심 주에있는 얇아진 영역과 두개골에 단단히 머리 판을 잡고 : 접착제가 얇아진 연구를 오염 시키면사고로 egion, 미세 수술 칼날로 조심스럽게 제거합니다. </li><li> 부드럽게 헤드 판의 중심 개구의 가장자리에 두개골의 측면으로부터 피부를 당겨. </li><li> 헤드 플레이트가 아니라 두개골에 부착 될 때까지 약 10 분을 기다립니다. </li><li> (그림 1 참조) 보유 판의 두 가지 측면 블록 헤드 플레이트를 위치하게 한 후, 고정 플레이트에 마우스를 고정시키기 머리 판의 가장자리에 나사를 조입니다 참고 :. 사이에 피부 나 수염이 없는지 확인합니다 나사를 조이기 전에 머리 판과 블록. 동물의 뒤 부드럽게 쓰다듬어 때 양호한 고정화 제제 해부 현미경 두개골 전혀 관찰 움직임을 표시 안된다. </li><li> . 미 중합 접착제를 제거하기 위해 식염수로 노출 된 두개골을 씻어 주 : 미 중합 접착제 이미지를 흐리게하고 손해 목표를 현미경으로 그것은 남아있는 접착제를 제거하는 것이 중요합니다 &lt;./ 리&gt; </ol> 4. 이미징 <ol><li> (그림 2 참조) 이후의 영상 세션에서 몇 군데 지역을 재배치하는 데 사용되는지도 1로 희석 영역과 노출 된 두개골의 혈관의 사진을 가져 가라. </li><li> 영상 현미경으로 마우스를 놓습니다. 표면 형광을 사용하여 10X 공기 목적에 따라 얇아진 영역을 찾아보기의 중앙에 얇은 영역을 이동합니다. </li><li> 두개골의 상단에 식염수 한 방울을 추가하고 멸균 수로 세척 된 60X 목표로 전환. 각각의 돌기 쪽이 명확하게 수상 돌기를 따라 시각화하는 지역을 선택합니다. 식별 및 epifluorescent보기와 혈관의 사진 사이에 혈관을 비교하여지도 1에 해당하는 지역을 라벨. </li><li> 형광에 따른 튜닝 이광자 레이저 파장. 예를 들어, YFP 920 nm의; GFP에 대한 890 nm의; DsRed를하고 tdTomato 24 1,000 nm의. </li><li> 2 이미지 스택 획득60X 목표를 사용하여 Z 축을 따라 μm의 단계. 이 이미지 스택은 약 200 ㎛ × 200 ㎛의 영역 (512 X 512 픽셀)를 커버하고 (그림 2 참조) 이후의 영상 세션에서 이전에지도 2로 사용됩니다. </li><li> 배 디지털 줌을 사용하여지도 2 내에서 아홉 이미지 스택을 획득. . 각각의 이미지 스택은 z 축 주에 따라 0.7 μm의 단계를, 70 μm의 X 70 μm의 (512 X 512 픽셀)의 대략적인 지역을 커버 : 광독성을 최소화하기 위해 샘플을 측정했을 때 레이저의 강도는 40 mW의 이하이어야한다. </li></ol> 5. 복구 <ol><li> 영상에 따라 부드럽게 두개골에서 머리 판을 분리합니다. </li><li> 철저하게 두개골과 나머지 모든 접착제를 제거하기 위해 피부를 청소 참고 :. 피부에 남아있는 접착제는 자극의 원인과 두개골에 남아있는 접착제는 두개골의 침식의 원인이됩니다 동안 피부의 치유 속도를 느리게합니다ngiogenesis 새로 성장 뼈의 층에서, 이후의 재배치 및 재 이미징 어려운 만들기. </li><li> 두개골과 생리 식염수를 여러 번로 피부를 씻어. </li><li> 무균 수술 봉합과 두피를 봉합. </li><li> 별도의 케이지에 가열 패드에있는 동물을 유지. 수술 후 통증을 완화하기 위해 피하 부 프레 노르 핀의 진통 (0.1 ㎎ / ㎏)을 관리 할 수​​ 있습니다. 전체 복구 홈 케이지에 동물을 반환합니다. 절개 부위가 치유되고 봉합이 제거 될 때까지 (적어도 하루에 한 번 확인) 밀접하게 동물을 모니터링합니다. 필요한 경우 부 프레 노르 핀 진통제의 후속 주사를 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 6. 재 이미징 <ol><li> 반복 1.1-1.8 단계를. </li><li> 반복 3.1-3.6 단계를 </li><li> 1지도하는 혈관 패턴과 2를지도하는 수지상 분기 패턴을 비교하여 이전에 몇 군데 지역을 찾습니다. </li><li> 재 이미징이 일주 내에서 수행되는 경우, 박형화 재 위에 새로 자란 뼈의 얇은 층을 제거하는 단계 2.3를 반복미세 수술 블레이드를 사용하여 기온. 재 이미징 이상 일주 한 후에 수행된다면, 단계 2.2 및 2.3를 반복 모두 참고. 새로 자란 뼈 층은 축소 화상 품질 선도 일본어 치밀골 층에 비해 더 적은 응집 구조로 구성된다. 따라서, 동일한 품질을 확보하기 위해서는 이전 촬상 세션보다 약간 얇은 스컬하는 것이 필요하다. </li><li> 이전 이광자 현미경 영상 스택을 찍은 이미지와 일치 스택을 얻기 위해 위치 및 방향을 조정한다. </li><li> 단계 4.6에서와 같이 이미지를 획득. </li><li> 반복 영상 후 5.1-5.5 단계를. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

성공적인 얇게 두개골 준비를 얻으려면,이 프로토콜의 몇 가지 단계가 매우 중요하다. 1) 두개골의 두께. 두개골 뼈이 고밀도 치밀골의 층과 저밀도 해면골의 중간층과 함께 샌드위치 구조를 갖는다. 고속 마이크로 드릴 치밀골과 해면골의 외부 층을 제거하기에 적합한 반면, 미세 수술 블레이드 치밀골의 내부 층을 얇게 이상적이다. 개발하는 동안 두개골의 두께가 증가하고 강성으로, 성인 쥐의 촬상 좋은 품질의 이미지를 얻기 위해서 제거되어야 할 더 많은 골을 요구한다. 얇아진 영역은 투명 고체 외관을 나타내고 두개골의 두께는 약 20 ~ 30 ㎛의 경우 양호한 이미징 품질을 제공한다. 지나치게 숱이 이후의 재 이미징 세션의 숱이 어려운 과정을 만들면서 두개골의 두께는 얇아 과정 중에 주기적으로 확인해야합니다. 2) 박막화 영역의 크기.이 원추 형상의 캐비티를 실현하고 안정된 박막화 두개골 구성을 확립하는 것이 중요하다. 적당한 크기로 얇게 영역의 구조는 외피에 손상을 일으키는 것을 방지하고 후속 재 촬상 세션 얇게 돕는다. 그것은 상부...

포유류의 피질 감각 지각과 운동 제어에서 추상적 인 정보 처리 및 인식, 많은 뇌 기능에 참여하고 있습니다. 다양한 대뇌 피질의 기능은 신경 세포의 다른 종류의 통신 및 개별 시냅스에서 정보를 교환하기로 구성되어 다른 신경 회로에 구축 할 수 있습니다. 시냅스의 구조 및 기능은 일관 경험 및 병리에 대한 응답으로 수정되고있다. 성숙한 뇌에서 시냅스 가소성 형성과 기능적 신경 회로의 유지에 중요한 역할을 수행, 강도 변화와 시냅스의 추가 / 제거를 두의 형태를 취한다. 돌기 쪽은 포유류 뇌의 흥분성 시냅스의 대부분의 시냅스 구성 요소입니다. 지속적인 매출 및 척추의 형태 학적 변화는 시냅스 연결 1-7 수정의 좋은 지표 역할을 것으로 추정된다. 이광자 레이저 스캐닝 마이크로SCOPY 두꺼운 불투명 준비하고 그대로 뇌 8 라이브 영상에 적합하게 낮은 광독성을 통해 깊은 침투를 제공합니다. 형광 표시와 함께, 두 광자 영상은 살아있는 뇌 들여다 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 개별 시냅스의 구조 개편을 수행 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 다양한 방법은 실시간 이미징 9-13 생쥐를 제조하는데 사용되었다. 여기, 우리는 마우스 피질에서 시냅스 돌기 쪽의 구조적 가소성을 조사하기 위해 생체 내 두 광자 이미징 얇게 두개골 준비에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 우리의 최근의 연구는 형광 표지 된 신경 세포의 하위 집합 및 생체 표지 기술의 급속한 발전과 함께 형질 전환 동물의 증가 가용성 학습 운동 기능에 대한 응답으로 돌기 척추 변화의 동적 인 그림을 묘사 한, 여기에 설명 된 절차와 유사한 절차도 적용 할 수 있습니다 investiga하기TE 다른 세포 유형 및 피질 영역, 다른 조작과 결합뿐만 아니라, 16-23은 질병 모델에서 사용했다.

<table><tbody><tr><td>케타민</td><td>Bioniche Pharma</td><td>67457-034-10</td><td>마취를 위해 자일라진과 혼합</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd laboratories</td><td>139-236</td><td>마취를 위해 케타민과 혼합</td></tr><tr><td>식염수</td><td>Hospira</td><td>0409-7983-09</td><td>주입 및 이미징 용 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72000</td><td>양날 스테인레스 스틸 면도날</td></tr><tr><td>알코올 패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>멸균 알코올 준비 패드</td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Henry Schein</td><td>102-9470</td><td>바셀린 안과 연고 멸균 안구 윤활제</td></tr><tr><td>고속 마이크로 드릴</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>고속 마이크로 드릴은 조밀한 뼈의 바깥 층을 얇게하고 작은 면적의</td></tr><tr><td>마이크로 드릴 스틸 버</td><td>를 대상으로하는 데 적합합니다.Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td>1.4 mm 지름</td></tr><tr><td>미세수술 블레이드</td><td>Surgistar</td><td>6961</td><td>미세수술 블레이드는 조밀한 뼈의 내부 층과 스폰지 뼈의 중간 층을 얇게 하는 데 적합합니다</td></tr><tr><td>. 시아노아크릴레이트 접착제</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9062131</td><td>두개골에 헤드 플레이트를 고정</td></tr>합니다. <tr><td>봉합</td>사 <td>Havard 장치</td><td>510461</td><td>비흡수성, 멸균 실크 봉합사, 6-0 모노필라멘트</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>SZ61</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>인피니티</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이광자 현미경</td><td>Prairie Technologies</td><td></td><td>Ultima IV</td></tr><tr><td>10X 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td></td><td>NA 0.30, 공기</td></tr><tr><td>60X 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td></td><td>NA 1.1, IR 투과성,</td></tr><tr><td>침수 Ti-sapphire 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>마이 타이 HP</td></tr></tbody></table>

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

포유류의 피질에서 신경 세포는 매우 복잡한 네트워크와 시냅스에서 정보 교환을 형성한다. 시냅스 강도뿐만 아니라, 시냅스의 추가 / 제거의 변화, 신경 가소성의 구조적 기초를 제공하고, 환경 의존적으로 발생한다. 피질에서 가장 흥분성 시냅스의 시냅스 구성 요소로, 돌기 쪽은 시냅스의 좋은 프록시로 간주됩니다. 마우스 유전학과 형광 라벨 기법, 개별 뉴런과 자신의 시냅스 구조의 촬영 장점은 그대로 뇌에 표시 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 시간이 지남에 형광 표지 시냅스 돌기 쪽을 따라 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 두개 영상 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 그대로 두개골을 유지하고 수막의 노출과 피질에 의한 염증 효과를 방지 얇게 두개골 준비를 활용합니다. 따라서, 이미지는 SU 직후에 취득 할 수있다rgery이 수행된다. 실험 절차는 시간부터 년까지 다양한 시간 간격들에 걸쳐 반복하여 수행 될 수있다. 이 혼합물을 또한 생리적 및 병리 적 조건에서, 다른 피질 영역과 층뿐만 아니라, 다른 세포 유형을 조사하기 위해 확장 될 수있다.

YFP-H 라인 쥐 25에서 노란색 형광 단백질이 대뇌 피질의 표면 층에 자신의 혀끝의 수상 돌기를 돌출 레이어 V 피라미드 신경의 부분 집합에 표현한다. 얇게 두개골 준비를 통해, 형광 표지 된 수지상 세그먼트 반복적 시간에서 달에 이르기까지, 다양한 영상 간격을 통해 두 광자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 여기에서 우리는 개인의 척추뿐만 아니라 filopodia 명확하게 수상 돌기를 따라 시각화 할 수있는 1 개월 마우스의 운동 피질에있는 8 일 동안 같은 수상 돌기의 네 시간 영상의 예를 보여줍니다. 일반적으로, 화상 스택 깊이 pial 표면으로부터 약 100 내지 200 μM이다. 각종 분석은 이러한 이미지에 기초하여 수행 될 수있다. 예를 들어, 척추 형성, 제거 및 회전율은 다른 세션에서 이미지를 비교함으로써 정량화 될 수있다. 척추 밀도는 dendrit의 길이에 의해 가시의 수를 나누어 계산 될 수있다IC 세그먼트. 척추의 운동성 및 형태의 변화도 분석 할 수 있습니다. <p class=...

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

본 절차의 전반적인 목표는 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 마우스 피질 내의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 영상화하는 것입니다. 마우스 마취 후 첫 번째 단계는 얇게 만든 두개골(thinned skull) 표본을 준비하는 것입니다. 다음으로, 맞춤 제작된 고정 플레이트를 사용하여 마우스의 머리를 고정합니다.그 후, 이광자 현미경을 사용하여 얇게 만든 두개골을 통해 이미지 스택을 획득합니다. 최종적으로, 이전에 이미징한 영역을 다시 찾아 이미징함으로써 다양한 조건에서 서로 다른 기간 동안 수지상 돌기 가시의 역동성을 추적할 수 있었습니다.수술 준비를 위해 케타민과 자일라진으로 마우스를 마취시키고, 발가락 꼬집기 테스트를 통해 완전 마취 여부를 확인합니다. 그런 다음 마우스를 가열 패드 위에 올리고 면도날을 사용하여 머리 부분을 삭모합니다. 알코올 솜으로 피부를 번갈아 닦아 삭모 부위를 멸균하고 남아 있는 털 부스러기를 제거합니다.또한, 양쪽 눈에 안연고를 부드럽게 도포하십시오. 다음으로, 두피의 정중선을 따라 직선으로 절개한 후 피부를 두개골 가장자리 방향으로 외측으로 젖힙니다. 그 후 두개골에 부착된 결합 조직을 제거하여 박층 두개골(thinned skull) 제작을 시작합니다.먼저, 정중선 및 bgma에 대한 상대적 위치를 기반으로 원하는 이미징 영역을 식별합니다. 그다음, 혈관을 관찰하기 위해 식염수로 두개골을 적시는데, 이는 큰 혈관이 있는 부위에서 두개골을 얇게 만드는 것을 방지하기 위함입니다. 혈관은 빛의 투과를 방해하고 이미지 구조를 흐리게 만들기 때문입니다. 직경 0.5에서 1mm의 영역이 선택되면, 고속 마이크로 드릴을 사용하여 두개골의 원형 영역을 얇게 깎아냅니다.과열로 인한 손상을 방지하기 위해 드릴을 두개골에 밀착시켜 아래로 누르지 말고 두개골 표면과 평행하게 이동시키십시오. 외부 치밀골 층과 중간 해면골 층이 모두 제거될 때까지 드릴 비트와 두개골 드릴 사이의 장시간 접촉을 피하십시오. 다음으로, 미세수술용 칼날을 약 45도 각도로 유지하여 드릴로 얇게 만든 영역의 중앙에 있는 내부 치밀골 층을 얇게 깎아내십시오.지름 200 to 300 µm, 두께 약 20 to 30 µm의 균일하게 얇아진 영역이 형성될 때까지 두개골을 강하게 누르지 말고 긁어냅니다. 두개골이 충분히 얇아지면 골 파편을 조심스럽게 제거합니다. 다음 단계는 날카로운 면을 테이프로 감싼 면도날로 제작된 헤드 플레이트를 부착하는 것입니다.먼저 헤드 플레이트 중앙 개구부의 각 가장자리에 시아노아크릴레이트 접착제를 소량씩 도포합니다. 그다음 헤드 플레이트를 얇게 만든 부위의 중앙에 맞춥니다. 이를 두개골에 밀착시켜 단단히 고정합니다.이제 두개골 측면의 피부를 헤드 플레이트 중앙 개구부의 가장자리까지 조심스럽게 당깁니다. 헤드 플레이트를 1~2분 동안 제자리에 고정합니다. 그 다음, 헤드 플레이트가 두개골에 잘 부착될 때까지 8~9분 더 기다립니다.10분 후, 헤드 플레이트를 홀딩 플레이트의 양측 블록 위에 놓습니다. 다음으로, 헤드 플레이트 가장자리의 나사를 조여 생쥐를 홀딩 플레이트에 고정합니다. 해부 현미경을 통해 생쥐의 머리를 관찰하면서 생쥐의 등을 가볍게 두드려 머리가 제대로 고정되었는지 확인합니다.다음으로, 이전에 이미징한 영역을 다시 찾기 위해 노출된 두개골을 식염수로 헹구어 중합되지 않은 접착제를 제거합니다. 이후의 이미징 세션에서는 노출된 두개골의 얇아진 영역의 혈관 사진을 찍으며, 이를 지도 1로 지정합니다. 그런 다음 마우스를 이미징 현미경 아래에 두고 10x 공기 렌즈 대물렌즈를 사용하여 얇아진 영역을 찾습니다.에피 형광(epi fluorescence)을 사용하여 가장 얇은 부위를 시야 중앙으로 이동시킵니다. 이제 두개골 상단에 생리식염수를 한 방울 떨어뜨리고 60 x 대물렌즈로 전환합니다. 수상돌기를 따라 개별 수상돌기 가시(dendritic spines)가 명확하게 보이는 영역을 선택합니다.에피 형광 뷰와 혈관 사진의 혈관 구조를 비교하여 지도 1에서 해당 영역을 식별하고 표시하십시오. 다음으로 형광체에 맞춰 이광자 레이저 파장을 조정하십시오. 그 후 60 x 대물렌즈를 사용하여 Z축 방향으로 2 µm 간격의 이미지 스택을 획득하며, 약 200 µm x 200 µm 영역을 촬영하십시오.이 영역은 맵 2로 지정되며, 이후의 이미징 세션 동안 수지상 돌기 분절의 이미지를 재위치시키는 데 사용됩니다. 이제 3배 디지털 줌을 사용하여 맵 2 내에서 9개의 이미지 스택을 획득하십시오. 각 이미지 스택은 Z축을 따라 0.7 µm 간격으로 약 70 µm x 70 µm의 영역을 커버합니다.영상을 촬영한 후, 두개골에서 헤드 플레이트를 조심스럽게 분리합니다. 다음으로, 미세 수술용 칼을 사용하여 두개골에 남아 있는 접착제를 제거합니다. 그런 다음 생리식염수로 두개골과 피부를 여러 번 헹구고, 멸균 수술용 봉합사로 두피를 봉합합니다.회복 기간 동안 동물을 별도의 케이지 내 가열 패드 위에 두고, 수술 후 통증 완화를 위해 부프레노르핀(buprenorphine) 진통제를 피하 투여하십시오. 완전히 회복되면 동물을 원래의 케이지로 돌려보냅니다. 다른 날에 수지상 돌기를 다시 촬영하려면 동물을 마취하고 두개골을 노출시키십시오. 이전과 동일하게 헤드 플레이트를 장착하고 이를 홀딩 플레이트에 고정하여 머리 고정 과정을 반복합니다.그다음, 혈관 패턴을 지도 1과 비교하고 수지상 분지 패턴을 지도 2와 비교하여 이전에 이미징한 영역을 찾습니다. 일주일 이내에 재이미징을 수행하는 경우, 새로 성장한 얇은 뼈 층을 미세 수술용 칼로 제거할 수 있습니다. 일주일 이후에 재이미징을 수행하는 경우에는 먼저 마이크로 드릴을 사용한 후, 미세 수술용 칼을 사용하여 두개골을 얇게 만듭니다.이제 이전에 촬영한 이미지 스택과 일치하는 이미지 스택을 얻기 위해 이광자 현미경 아래에서 위치와 방향을 조정하십시오. 이미지 획득 후, 마우스가 회복될 수 있도록 하고 이전과 동일하게 케이지로 돌려보내며, 맵 1로 지정된 얇은 두개골 영역 주변의 혈관 패턴 이미지를 이후의 모든 이미징 세션의 참조용으로 사용합니다. 검은색 상자는 이광자 생체 내(in vivo) 이미지를 획득한 영역을 나타냅니다.생후 1개월 된 마우스의 운동 피질 내 수지상 돌기 분지를 나타낸 이 이미지는 지도 2로 지정되었습니다. 흰색 상자는 이미징을 위해 선택된 수지상 분절을 보여줍니다. 시간이 경과함에 따라, 0일, 2일, 4일, 그리고 8일째에 동일한 수지상 분절에 대해 이광자 이미징을 수행하였습니다.새롭게 형성된 가시(spine). 이전 이미징 세션에서 관찰되지 않았던 가시는 화살촉으로 표시하며, 이미징 세션 사이에 소실된 가시는 화살표로 표시합니다. 필립 포디아(Philip Podia)는 별표로 표시하며, 마스터링이 완료된 상태를 나타냅니다.이 기술은 적절하게 수행될 경우 1~2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

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연구

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신경과학

이 비디오 및 보충 자료에서 우리는 만성에 대한 프로토콜을...

Thinned - 해골 준비를 사용하여 마우스 시각 피질의 만성 이미징

우리는 mm에 걸쳐하고 뇌의 염증없이 몇 달 동안 안정 마우스 두개골에 이미지 창을 형성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 잘 두 광자 현미경을 사용하여 혈류, 세포 역학 및 세포 / 혈관 구조의 종방향 연구에 가장 적합합니다.

마우스 뇌의 장기 이미징을위한 세련된와 철근 Thinned-해골 창

광택 및 강화 된 얇은 두개골 (포트) 두개골 창 glioblastoma (GBM) 세포 주입을 결합함으로써, 우리는 glioma의 개시와 길이 방향 라이브 마우스의 뇌에 주입 GBM 세포의 성장을 관찰 할 수 있습니다.

이미징 Glioma 개시<em&gt; 생체 내</em&gt; 연마하고 강화 얇은 두개골 두개골 창을 통해

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)는 뮤린 해마의 수지상 척추를 이미지 및 분석하기 위해 적용된다.

수지상 척추 연구를 위한 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBEM)

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

이 프로토콜은 형광 스티렌 미세구를 이용한 생 체 내 2광자 현미경 영상에 최적화된 만성 두개골 창문 및 미세혈관 색전증 마우스 모델에 대한 단계별 접근법을 상세히 설명하고 있습니다.

형광 폴리스티렌 미세구를 이용한 생체 내 2광자 현미경용 미세혈관 색전증 마우스 모델

배우세요 두 광자 현미경과 두개골 박리법을 이용하여 생체 마우스 피질에서 시냅스 구조와 수상돌기 돌기의 동태를 관찰하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 구조적 재구성을 실시간으로 추적하는 데 활용됩니다.

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