Name: 이해 간체를 사용하여 초기 형성기 현장에서 하이브리드 프로토콜 아프리카 발톱 개구리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 50 s
Description: 배우세요 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) 배아에서 전체 마운트 제자리 하이브리드화를 이용한 유전자 발현 시각화 방법입니다. 이 기술은 발달생물학 연구자들이 초기 발생 단계에서 특정 유전자의 위치를 정확히 파악하는 데 활용됩니다.

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저자는 Steve Deimling의 펠로우십 지원에 대해 CIHR과 Steve Deimling, Rami Halabi 및 Stephanie Grover에 대한 지원에 대해 웨스턴 온타리오 대학교 소아과에 감사를 표합니다. 이 작업은 NSERC 보조금 R2654A11와 NSERC Discovery Accelerator Supplement의 지원을 받았습니다

<ol><li>Ninomiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-dependent+differential+cell+adhesion+in+Xenopus+causes+cell+sorting+in+vitro+but+not+in+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo.</a> J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).</li>
<li>Movassagh, M., Philpott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+differentiation+in+Xenopus+requires+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor%2C+p27Xic1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1.</a> Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+alphaA-+and+betaB1-crystallin+during+normal+development+and+regeneration%2C+and+proteomic+analysis+for+the+regenerating+lens+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis.</a> Mol Vis. 17, 768-778 (2011).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Xenopus+primordial+germ+cell+migration+depends+on+the+germplasm+mRNA+encoding+the+PDZ+domain+protein+Grip2%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2.</a> Differentiation. 76, 392-403 (2008).</li>
<li>Deimling, S. J., Drysdale, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf+is+required+to+regulate+anterior-posterior+patterning+in+the+Xenopus+lateral+plate+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm.</a> Mech Dev. , (2011).</li>
<li>Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+FGF+signaling+in+the+establishment+and+maintenance+of+mesodermal+gene+expression+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus.</a> Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis+%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cDNA+microarray+identification+of+genes+with+endodermal+organ+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression.</a> Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).</li>
<li>Horb, M. E., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoderm+specification+and+differentiation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos.</a> Dev Biol. 236, 330-343 (2001).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29+%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland Pub. (1994).</li>
<li>Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Lithium+on+the+Competence+of+the+Ectoderm+in+Ambystoma+Mexicanum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum.</a> J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+artificially+activated+ectoderm+%28Rana+pipiens+and+Ambystoma+punctatum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum).</a> Dev Biol. 6, 255-279 (1963).</li>
<li>Sato, S. M., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approach+to+dorsoanterior+development+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 137, 135-141 (1990).</li>
<li>Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPOX2-peroxidase+expression+and+the+XLURP-1+promoter+reveal+the+site+of+embryonic+myeloid+cell+development+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus.</a> Mech Dev. 117, 173-186 (2002).</li>
<li>Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+I+is+a+heart-specific+marker+in+the+Xenopus+embryo%3A+expression+during+abnormal+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis.</a> Dev Biol. 165, 432-441 (1994).</li>
<li>Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+pronephric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of pronephric development.</a> Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).</li>
<li>Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XNkx-2.5%2C+a+Xenopus+gene+related+to+Nkx-2.5+and+tinman%3A+evidence+for+a+conserved+role+in+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development.</a> Dev Biol. 162, 325-328 (1994).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).</li>
<li>Hurtado, R., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+and+stability+in+two-color+in+situ+hybridization+by+means+of+a+novel+chromagenic+substrate+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination.</a> Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).</li>
</ol>

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

특정 유전자의 발현 패턴을 시각화하는 계내 혼성화에 사용하는 능력은 제노 푸스 배아의 특정 기관 또는 세포 유형을 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법에 남아있다. 이는이 기술에 의해 제공되는 몇몇 이점이다. 유전자의 발현은 해당 셀 (18)의 명확한 경계하기 전에 심장 전구 세포에서 nkx2.5 식의 사례로 잘 분화의 조직 학적 서명하기 전에 특정 구조를 식별 할 수 있습니다. 모든 시약은 손에 이동 한 후에, 또한 매우 비용 효과적이다. 효과적으로 재사용 할 수있는 많은 개별 프로브의 세대는 약간의 여분의 시간과 관심의 유전자를 인코딩 플라스미드를 취득 이외의 비용을 투자 할 수있다. 우리의 경험에 의하면, 프로브는 각각의 사용과 함께 제공되는 피할 수없는 작은 희석에도 불구하고 활동에 약간의 손실이 년 동안 재사용 할 수있다. 마지막으로, 약간의 최적화 requi가빨간색은 다른 프로브를 사용하는 경우. <p class="jove_conten...

특정 유전자의 발현 패턴은 특정 기관 또는 세포 유형의 발달에서 해당 유전자의 잠재적인 역할을 결정하는 데 중요한 정보입니다. 간단히 말해, 적절한 시기와 장소에서 표현되지 않는다면 중요한 역할을 하지 못할 것이다. 대부분의 초기 배아에서와 마찬가지로 Xenopus에서 유전자 발현을 검출하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 분석법은 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용한 전체 마운트 현장 혼성화입니다. Xenopus에서 유전자의 발현을 평가하기 위한 항체 염색의 사용은 연구자들이 일반적으로 포유류 단백질에 대해 제기된 항체를 발견함에 따라 Xenopus 상동체에 교차 반응하거나 자체 1-3을 생성함에 따라 더욱 보편화되고 있습니다. 그러나 Xenopus organogenesis에 대한 대다수의 연구는 여전히 안티센스 RNA 프로브를 사용합니다. 항체가 사용될 때, 각 개별 항체는 종종 1차 항체 농도 또는 고정 프로토콜에 대한 최적화가 필요합니다. 대조적으로, 현장 혼성화를 위한 프로토콜은 본질적으로 다른 프로브에 대해 불변합니다. 기본 개념은 비교적 간단하며 우수한 표준 프로토콜이 잘 확립되어 있습니다 4. 당사의 프로토콜은 원래 프로토콜 4의 간소화된 버전으로, 여전히 초기 배아에서 유전자 발현 패턴을 탁월하게 검출합니다. 배아는 고정된 다음 labeled antisense RNA probe를 타겟 mRNA에 매우 엄격하게 결합할 수 있도록 용액과 온도를 변경하여 혼성화를 위해 준비됩니다. 결합되지 않은 프로브는 씻겨 나가고 배아는 RNA 프로브의 표지에 대한 항체의 결합을 준비합니다. 그런 다음 과도한 항체를 씻어내고 효소 색상 반응을 사용하여 RNA 프로브가 배아에서 결합된 위치를 파악합니다. 현재 특정 조직에서 형광 단백질의 발현을 유도하는 많은 Xenopus 형질전환 세포주가 있으며, 이러한 유전자 변형 세포주는 Woods Hole의 National Xenopus Resource와 같은 Xenopus 재고 센터에서 사용할 수 있습니다. 살아있는 배아의 기관 형성을 조사해야 하는 많은 실험에 매우 유용하지만, 이 옵션은 형질전환 계통을 위한 별도의 하우징이 필요합니다. 
in situ hybridization은 초기 배아에서 특정 장기 또는 세포 유형이 형성되는 위치를 명확하게 설명할 수 있습니다(그림 1). 이 기술은 단일 배아에서 소수의 세포에서 유전자 발현을 감지할 수 있다는 점을 감안할 때 매우 민감합니다 5. 그러나 비색 염색 강도를 사용한 현장 혼성화는 색상 반응이 선형 반응이 아니기 때문에 정량화 할 수있는 것으로 간주되지 않습니다. 염색 강도를 정량화하는 데 어려움이 있음에도 불구하고 발현의 변화는 종종 매우 눈에 띄게 나타납니다. 특히 현장 혼성화가 발현 영역의 크기에서 정량화 가능한 증가 또는 감소를 보이는 경우 6,7. 
전체 마운트 in situ hybridization의 분명한 장점은 초기 발달 연구에서 중요한 분석법입니다. 그러나 며칠에 걸쳐 많은 단계를 수행해야 하는 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 이 프로토콜은 현장 결과의 품질을 저하시키지 않고 여러 단계를 제거하는 표준 프로토콜의 단순화된 버전입니다. 단순화는 또한 변동성의 원인을 제거하여 현장 하이브리드화가 최적이 아닌 경우 문제를 더 쉽게 해결할 수 있습니다. 특히, 배아의 proteinase K 및 RNAse 처리의 사용을 제거했는데, 이 두 단계는 시약 품질에 따라 달라질 수 있으며 과도하게 수행할 경우 신호 강도를 줄일 수도 있습니다. 이 프로토콜은 또한 여러 시약의 사용을 없애기 때문에 어느 정도의 비용 절감 효과를 제공합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 현장 혼성화 결과의 이미지 캡처를 개선하기 위한 몇 가지 간단한 지침도 제공합니다. 이 프로토콜은 제노푸스 배아(Xenopus embryos)에서의 작업에 최적화되어 있지만, 적어도 일부 단순화는 다른 배아 시스템에서의 현장 혼성화 작업에 적용될 수 있을 것으로 보입니다.

<table><tbody><tr><td>Labguake 튜브 쉐이커</td><td>VWR</td><td>17-08-2011</td><td></td></tr><tr><td>VWR 바이알</td><td>VWR</td><td>10-07-2012</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>BioShop</td><td>CYS342.500</td><td></td></tr><tr><td>리보 뉴클레오 시드 트리 포스페이트 세트, 100mM</td><td>Roche</td><td>11277057001</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Rnase inhibator (Rnase OUT)</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소</td><td>발효as</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA 중합효소</td><td>발효as</td><td>EPO101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA 중합효소</td><td>fermentas</td><td>EPO131</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>18047-019</td><td></td></tr><tr><td>양 혈청</td><td>&nbsp; Wisent</td><td>31150</td><td></td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>BM 보라색 Ap 기질</td><td>Roche</td><td>11442094001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ap Feb 단편</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>CAMX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>EM&nbsp;</td><td>7910</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioShop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioShop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>EM&nbsp;</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>시그마</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Mops</td><td>BioShop</td><td>MOP001.250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E-3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>BioShop</td><td>PAR070.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>&nbsp; 폭스바겐&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAFX0420-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td><td>로슈</td><td>10109223001</td><td></td></tr><tr><td>말레산</td><td>&nbsp; 폭스바겐&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CAMX0100-3</td><td></td></tr><tr><td>삼중나트륨 시트레이트</td><td>BioShop</td><td>CIT001</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 (30% 용액)</td><td>EM&nbsp;</td><td>HX0635-2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.100</td><td></td></tr><tr><td>PVP-40</td><td>ICN</td><td>195451</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>시그마</td><td>B-1042</td><td></td></tr><tr><td>벤질 벤조에이</td>트 <td>시그마</td><td>B-6630</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 아가로스&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td>16500-500</td><td></td></tr></tbody></table>년

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis는 장기가 어떻게 지정되고 발달 과정에서 특정 모양과 기능을 획득하는지에 대한 연구입니다. Xenopuslaevis 배아는 크기가 커서 기관 형성의 초기 단계에서 장기를 식별하는 데 매우 적합하기 때문에 기관 형성을 연구하는 데 매우 유용합니다. 현재 특정 장기 또는 원시를 식별하는 데 사용되는 주요 방법은 관심 기관에서 발현되는 유전자에 특이적인 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용한 전체 마운트 제자리 혼성화입니다. 또한, Xenopus에서 유전자 또는 신호 전달 경로를 조작하는 것은 비교적 쉬우며, in situ hybridization을 통해 표적 기관의 존재 또는 형태의 변화를 분석할 수 있습니다. 전체 마운트 현장 하이브리드화는 많은 단계가 포함된 여러 날에 걸친 프로토콜입니다. 여기에서는 일상적인 분석에 잘 작동하는 사용되는 단계 및 시약 수를 줄인 단순화된 프로토콜을 제공합니다. 현장 하이브리드화 로봇은 프로세스를 크게 촉진했으며 프로세스에서 해당 기술을 언제 어떻게 활용하는지 자세히 설명합니다. 현장 하이브리드화가 완료되면 결과의 최상의 이미지를 캡처하는 것이 어려울 수 있습니다. in situ hybridization 결과의 이미징을 최적화하는 방법에 대한 조언을 제공합니다. 프로토콜은 Xenopus laevis의 기관 형성 평가를 설명하지만, 동일한 기본 프로토콜이 Xenopus tropicalis 및 기타 모델 시스템에 거의 확실하게 적용될 수 있습니다.

조직 특이 적 프로브의 사용은 특정 기관에 대한 개발의 상태에 관해서 뛰어난 정보를 제공 할 수있다. 다음 예에서, 배아 단계는 Nieuwkoop 및 파버 스테이징 테이블 (11)에 기초한다. 하나는 프로브 형태 분화 후 유전자 발현, 단계 28-30에서 심장 트로포 닌 I (예를 들어,도 1C), 차별화 된 장기의 존재 또는 크기를 사용하는 경우, 어느 단계 포스트 분화에서 평가 될 수있다. 몇 년 전, embryologists 초기 배아 12, 13의 조직학의 놀라운 지식을 바탕으로 이러한 분석을 수행 할 수 있었다하지만 전문 지식은 크게 embryologists의 현재 세대에 손실되었습니다. 하지만이 전문 손실은 연구원에 사용할 특정 조직을 식별하게 보체 기법의 신뢰성 및 사용의 용이성, 유감 고려 될 수있다. 상대적으로 눈에 띄지있는 조직, t배아 단계 25 예 (그림 1A)에서 선을 부화...

Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다. 이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

다음 실험의 전반적인 목표는 온전한 배아 내에서 특정 유전자가 발현되는 위치를 보여주는 것입니다. 이는 두 번째 단계에서 배아 내에 국소화될 RNA를 제자리에 고정함으로써 달성됩니다. 관심 유전자에 특이적인 안티센스 RNA 프로브를 배아 내의 표적 RNA에 하이브리드화합니다.이 프로브는 보통 digoxigenin과 같은 에피토프를 포함하며, 이를 통해 검출이 가능합니다. 그다음, 알칼리성 포스파타아제가 결합된 항체를 RNA 프로브의 에피토프에 하이브리드화시킨 후 발색 염색을 수행합니다. 배아 내에서 RNA가 국소화된 위치를 시각화하기 위해, 색 반응과 배아 해부학적 지식을 바탕으로 관심 유전자가 정확히 어디에서 발현되는지 보여주는 결과를 얻습니다.기존 프로토콜과 비교하여 본 연구소 프로토콜의 주요 장점은 품질 저하 없이 더 빠르게 진행되며 더 적은 양의 시약을 사용한다는 점입니다. 이 방법은 조직이 어떻게 지정되고 패턴화되는지와 같은 배아학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 opus의 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 제브라피쉬나 초기 생쥐 배아와 같은 다른 많은 소형 배아에도 적용될 수 있습니다.기존 방법들이 많은 시간을 소요했기 때문에 저희는 먼저 이러한 방법들을 개발하기 시작했으며, 품질을 저하시키지 않으면서 절차의 효율성을 높이기 위해 Ed 단계를 생략하는 실험을 시작했습니다. 배아 고정은 단계별로 수행됩니다. 먼저, 전체 과정 동안 배아를 모니터링할 수 있도록 배아의 최종 보관을 포함한 모든 단계에 사용할 유리 바이알을 준비하십시오.뚜껑에 테플론 씰이 잘 처리된 투명 바이알을 사용하고, 유성 마커를 이용하여 각 바이알에 적절한 실험 정보를 표기하십시오. 실험 과정 중 라벨이 지워지는 것을 방지하기 위해 라벨 위에 투명 테이프를 붙이십시오. 알코올 및 기타 용매를 사용하므로, 프로토콜 본문에 설명된 대로 MFA 고정액을 준비하십시오.라벨이 부착된 각 유리 바이알에 MFA 용액 3~4 mL를 채웁니다. 100% 메탄올 용액은 -20 °C에서 보관하십시오. 컷 글라스 피펫을 제작하여, 고정을 위해 Memphis 용액이 들어 있는 유리 바이알로 배아를 옮기는 데 사용합니다.배아 배양액의 액체 전이를 최소화하여 배아를 추가합니다. 바이알당 배아 수를 20~30개 이하로 고정합니다. 배아를 Memphis 용액에 넣고 상온의 교반기에서 2시간 동안 둡니다.파라포름알데히드 고정이 완료되면, 멤피스 용액을 약 4mL의 -20°C 100% methanol로 교체하여 배아를 보관하십시오. 프로브 합성 반응을 준비하기 전에 DNA water NTP 혼합물과 폴리머레이스 버퍼를 실온까지 가온하십시오. 이 절차의 성공을 위한 가장 중요한 단계 중 하나는 프로브 반응액을 정확하게 조제하는 것입니다.상온에서 프로브 합성 반응액을 조제합니다. 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 다음 성분들을 순서대로 첨가합니다. 템플릿 DNA와 반응 총 부피가 20 microliters가 되도록 조절한 물, NTP mix, RNA 억제제, RNA polymerase 버퍼 및 RNA polymerase를 넣고, 37 degrees Celsius에서 2시간 동안 전사 반응을 위해 배양합니다.2시간보다 약간 더 길게 배양하더라도 부정적인 영향은 없으나, 수율 증가 또한 거의 나타나지 않습니다. 1시간 동안 배양할 경우 수율은 감소하지만, 여전히 양질의 프로브를 제작하기에는 충분한 수준입니다. 전사 반응이 완료되면, 반응 혼합물에서 1 µL를 취해 1% agarose TAE 겔에서 확인하고, 나머지 반응 혼합물은 보관하십시오.1% SDS/TE 완충액 80 µL, 5 M 아세트산 암모늄 10 µL 및 차가운 에탄올 220 µL를 첨가합니다. 혼합물을 강하게 볼텍싱한 후, RNA 품질 확인 결과가 나올 때까지 얼음에 보관합니다. 침전 전 분리해 둔 1 µL의 RNA에 증류수와 표준 로딩 다이(loading dye)를 첨가한 후, 에티듐 브로마이드(EtBr)가 포함된 1% 아가로스 TAE 겔에서 RNA 전기영동을 수행합니다.UV 트랜실루미네이터를 사용하여 겔 상의 에티듐 브로마이드로 표지된 RNA를 관찰하여 프로브의 품질을 확인합니다. 위아래로 번짐(smearing)이 없는 단일 밴드가 보여야 합니다. RNA의 품질이 확인되면, 얼음에 보관해 두었던 나머지 RNA를 마이크로 원심분리기로 10~15분 동안 최대 속도로 회전시켜 침전시킵니다.길게 뽑아낸 유리 피펫으로 상층액을 제거하고 RNA를 잠시 동안 건조시킵니다. 그 후, 프로브를 RNA 하이브리다이제이션 완충액에 재현탁하여 -20 °C의 15 milliliter 스크류 캡 폴리스티렌 튜브에 보관합니다. 이 절차를 시작하려면 -20 °C 메탄올에 보관했던 배아를 꺼내어 실온까지 따뜻하게 합니다.전체 과정은 유리 바이알 내에서 수행됩니다. 한 그룹의 서로 다른 배아들을 서로 다른 프로브로 검사할 예정이라면, 프로브를 첨가하기 직전까지 배아들을 하나의 바이알에 보관하십시오. 프로브 첨가 준비를 위해 첫째 날의 변동성과 노동력을 줄이려면, 이 표에 설명된 대로 메탄올 시리즈를 통해 배아를 재수화하십시오. 이 단계에서 배아가 쉽게 손상될 수 있으므로, 유리 피펫을 사용하여 각 용액을 조심스럽게 제거하고 첨가하십시오.액체를 옮길 때, 캡 내부에 배아가 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 배아가 용기 벽면이나 서로에게 달라붙지 않도록 액체를 교체할 때마다 부드럽게 회전시켜 섞어줍니다. 그리고 RNA hybridization buffer와 probe를 65 °C로 미리 가온한 후, vials를 mutator에 장착하여 배아를 흔들어 줍니다.배아를 프로브 용액에 넣고 65 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 하이브리드화한 후 다음 날 확인합니다. 프로브 용액을 제거하고 날짜와 사용 횟수를 표시한 15 mL 스크류 캡 폴리스티렌 튜브에 보관합니다. 프로브 용액은 -20 °C에서 보관하십시오.프로브를 제거한 후, 여기에 설명된 일련의 세척 과정을 통해 프로브에 대한 항체 염색을 위해 배아를 준비하십시오. 배아가 담긴 바이알이 부착된 뮤테이터를 적절한 온도로 설정된 하이브리다이제이션 오븐으로 직접 이동시켜 필요에 따라 온도를 변경하십시오. 배아를 블로킹 용액에서 배양하는 동안, 항체를 배아에 첨가하기 전 블로킹이 이루어질 수 있도록 적절한 부피의 블로킹 용액과 anti-D dig 항체 혼합액을 조제하십시오. 항체 용액 내에서 배아를 4°C로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날에 회수하십시오.항체 용액을 제거하고 말레산과 염화나트륨이 포함된 용액인 mab로 세척합니다. 상온에서 록킹(rocking)하며 최소 1~30분 동안 세척을 수행합니다. 마지막 세척 용액을 알칼리성 인산분해효소 기질로 교체합니다.다음 날 실온에서 오버나이트로 쉐이킹하며 염색 반응을 수행합니다. 이 표에 설명된 대로 액체를 교체하여 염색 반응을 중단하고 배아를 보관 및 이미징 단계로 준비합니다. 배아를 재수화한 후, MFA로 30분 동안 염색물을 고정합니다.고정이 완료되면 MFA를 제거하고 배아를 25%methanol로 세척합니다. 내인성 색소 제거가 필요한 경우, 25%methanol을 제거하고 표백액을 첨가합니다. 표백 과정은 비교적 빠르게 진행되므로 면밀히 관찰하며, 원하는 효과에 따라 표백 정도를 조절할 수 있습니다.장기 보관을 위해서는, 단기 보관 및 이후 영상 촬영을 위한 표백 과정에 이어 메탄올 시리즈를 통해 배아를 100% methanol까지 탈수하십시오. 이후 배아를 PBS로 옮깁니다. 투명화되지 않은 배아는 1% aros 배경에서 관찰 및 촬영하는 것이 가장 좋습니다. aros 용액을 준비하려면, 물에 aros를 넣고 aros가 완전히 용해될 때까지 끓입니다. aros가 50 °C로 식으면, 페트리 접시에 약 2 mm 깊이로 붓습니다.aros 디쉬가 준비되면, 투명화 처리되지 않은 배아를 디쉬에 놓고 이미징을 진행합니다. aros는 배아 및 염색 반응의 푸른색과 대비가 잘 되는 청회색 배경을 제공합니다. 또한 시선을 배아로부터 분산시키는 그림자와 반사를 확산시켜, 복측과 같은 다른 각도에서 배아를 이미징하는 데 도움을 줍니다.미세 핀셋을 사용하여 배아가 들어갈 수 있도록 어로스(aros)에 절개선을 만듭니다. 배아의 방향을 잡기 위해 해당 채널에 배아를 배치합니다. 배아는 쉽게 손상될 수 있으므로 취급 시 주의하십시오.광섬유 광원을 사용하여 배아를 낮은 각도에서 비추면, 배아에 그림자가 생겨 이미지에 입체감이 부여되고 표면 구조를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이는 표백 과정에서 유용한 지표가 되는 색소가 제거될 수 있기 때문입니다. 강하게 표백된 배아의 경우 그림자 효과를 활용하십시오. 투명화된 배아는 척수, 폐 또는 뇌의 특정 영역과 같이 배아 내부 깊숙이 위치한 염색 상태를 촬영하는 데 사용됩니다.본 프로토콜에서는 배아의 염색 상태를 시각화하기 위해 서로 다른 수준의 표백 과정이 사용됩니다. 염색이 강한 경우에는 색소를 일부 남기는 가벼운 표백을 통해 배아의 발달 단계 확인 및 방향 설정을 더 용이하게 할 수 있습니다. 반면, 신장과 같이 색소 침착 수준이 높은 부위에 염색이 된 경우에는 더 강한 표백을 수행하는 것이 더 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.ARO 베이스를 조작하면 배아의 방향 설정에 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, ARO에 미세한 채널을 컷팅함으로써, 옆으로 누워 있는 올챙이 단계의 배아를 복측에서 관찰할 수 있으며, 양질의 이미지를 캡처할 수 있을 만큼 충분한 안정성을 확보할 수 있습니다. 이 배아는 복측이 위로 향하도록 위치를 안정시키는 작은 구멍에 배치되었으며, 이를 통해 관심 유전자의 발현 패턴을 전체적으로 관찰할 수 있었습니다.PAX2로 염색된 불투명한 비투명화 배아와 투명화 배아 모두에서 내부 기관을 관찰할 수 있습니다. 34단계에서는 신경관뿐만 아니라 시신경stalk도 시각화할 수 있습니다. 하지만 세부 사항이 선명하지는 않습니다. 배아를 투명화함으로써 시신경stalk를 포함한 발현 부위의 경계가 더 선명해집니다.투명화 정도는 이 배아의 양쪽 눈이 모두 보이는 것으로 확인할 수 있습니다. 하지만 투명화된 배아에서 흔히 발생하는 문제는 일부 염색약이 내부 강에 축적된다는 점입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 더 적은 시약으로 빠르게 whole mount in situ를 수행하고 고품질의 이미지를 캡처하는 방법을 충분히 익히게 될 것입니다.

understanding-early-organogenesis-using-simplified-situ-hybridization

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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