이해 간체를 사용하여 초기 형성기

다음 실험의 전반적인 목표는 온전한 배아 내에서 특정 유전자가 발현되는 위치를 보여주는 것입니다. 이는 두 번째 단계에서 배아 내에 국소화될 RNA를 제자리에 고정함으로써 달성됩니다. 관심 유전자에 특이적인 안티센스 RNA 프로브를 배아 내의 표적 RNA에 하이브리드화합니다.

이 프로브는 보통 digoxigenin과 같은 에피토프를 포함하며, 이를 통해 검출이 가능합니다. 그다음, 알칼리성 포스파타아제가 결합된 항체를 RNA 프로브의 에피토프에 하이브리드화시킨 후 발색 염색을 수행합니다. 배아 내에서 RNA가 국소화된 위치를 시각화하기 위해, 색 반응과 배아 해부학적 지식을 바탕으로 관심 유전자가 정확히 어디에서 발현되는지 보여주는 결과를 얻습니다.

기존 프로토콜과 비교하여 본 연구소 프로토콜의 주요 장점은 품질 저하 없이 더 빠르게 진행되며 더 적은 양의 시약을 사용한다는 점입니다. 이 방법은 조직이 어떻게 지정되고 패턴화되는지와 같은 배아학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 opus의 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 제브라피쉬나 초기 생쥐 배아와 같은 다른 많은 소형 배아에도 적용될 수 있습니다.

기존 방법들이 많은 시간을 소요했기 때문에 저희는 먼저 이러한 방법들을 개발하기 시작했으며, 품질을 저하시키지 않으면서 절차의 효율성을 높이기 위해 Ed 단계를 생략하는 실험을 시작했습니다. 배아 고정은 단계별로 수행됩니다. 먼저, 전체 과정 동안 배아를 모니터링할 수 있도록 배아의 최종 보관을 포함한 모든 단계에 사용할 유리 바이알을 준비하십시오.

뚜껑에 테플론 씰이 잘 처리된 투명 바이알을 사용하고, 유성 마커를 이용하여 각 바이알에 적절한 실험 정보를 표기하십시오. 실험 과정 중 라벨이 지워지는 것을 방지하기 위해 라벨 위에 투명 테이프를 붙이십시오. 알코올 및 기타 용매를 사용하므로, 프로토콜 본문에 설명된 대로 MFA 고정액을 준비하십시오.

라벨이 부착된 각 유리 바이알에 MFA 용액 3~4 mL를 채웁니다. 100% 메탄올 용액은 -20 °C에서 보관하십시오. 컷 글라스 피펫을 제작하여, 고정을 위해 Memphis 용액이 들어 있는 유리 바이알로 배아를 옮기는 데 사용합니다.

배아 배양액의 액체 전이를 최소화하여 배아를 추가합니다. 바이알당 배아 수를 20~30개 이하로 고정합니다. 배아를 Memphis 용액에 넣고 상온의 교반기에서 2시간 동안 둡니다.

파라포름알데히드 고정이 완료되면, 멤피스 용액을 약 4mL의 -20°C 100% methanol로 교체하여 배아를 보관하십시오. 프로브 합성 반응을 준비하기 전에 DNA water NTP 혼합물과 폴리머레이스 버퍼를 실온까지 가온하십시오. 이 절차의 성공을 위한 가장 중요한 단계 중 하나는 프로브 반응액을 정확하게 조제하는 것입니다.

상온에서 프로브 합성 반응액을 조제합니다. 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 다음 성분들을 순서대로 첨가합니다. 템플릿 DNA와 반응 총 부피가 20 microliters가 되도록 조절한 물, NTP mix, RNA 억제제, RNA polymerase 버퍼 및 RNA polymerase를 넣고, 37 degrees Celsius에서 2시간 동안 전사 반응을 위해 배양합니다.

2시간보다 약간 더 길게 배양하더라도 부정적인 영향은 없으나, 수율 증가 또한 거의 나타나지 않습니다. 1시간 동안 배양할 경우 수율은 감소하지만, 여전히 양질의 프로브를 제작하기에는 충분한 수준입니다. 전사 반응이 완료되면, 반응 혼합물에서 1 µL를 취해 1% agarose TAE 겔에서 확인하고, 나머지 반응 혼합물은 보관하십시오.

1% SDS/TE 완충액 80 µL, 5 M 아세트산 암모늄 10 µL 및 차가운 에탄올 220 µL를 첨가합니다. 혼합물을 강하게 볼텍싱한 후, RNA 품질 확인 결과가 나올 때까지 얼음에 보관합니다. 침전 전 분리해 둔 1 µL의 RNA에 증류수와 표준 로딩 다이(loading dye)를 첨가한 후, 에티듐 브로마이드(EtBr)가 포함된 1% 아가로스 TAE 겔에서 RNA 전기영동을 수행합니다.

UV 트랜실루미네이터를 사용하여 겔 상의 에티듐 브로마이드로 표지된 RNA를 관찰하여 프로브의 품질을 확인합니다. 위아래로 번짐(smearing)이 없는 단일 밴드가 보여야 합니다. RNA의 품질이 확인되면, 얼음에 보관해 두었던 나머지 RNA를 마이크로 원심분리기로 10~15분 동안 최대 속도로 회전시켜 침전시킵니다.

길게 뽑아낸 유리 피펫으로 상층액을 제거하고 RNA를 잠시 동안 건조시킵니다. 그 후, 프로브를 RNA 하이브리다이제이션 완충액에 재현탁하여 -20 °C의 15 milliliter 스크류 캡 폴리스티렌 튜브에 보관합니다. 이 절차를 시작하려면 -20 °C 메탄올에 보관했던 배아를 꺼내어 실온까지 따뜻하게 합니다.

전체 과정은 유리 바이알 내에서 수행됩니다. 한 그룹의 서로 다른 배아들을 서로 다른 프로브로 검사할 예정이라면, 프로브를 첨가하기 직전까지 배아들을 하나의 바이알에 보관하십시오. 프로브 첨가 준비를 위해 첫째 날의 변동성과 노동력을 줄이려면, 이 표에 설명된 대로 메탄올 시리즈를 통해 배아를 재수화하십시오. 이 단계에서 배아가 쉽게 손상될 수 있으므로, 유리 피펫을 사용하여 각 용액을 조심스럽게 제거하고 첨가하십시오.

액체를 옮길 때, 캡 내부에 배아가 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 배아가 용기 벽면이나 서로에게 달라붙지 않도록 액체를 교체할 때마다 부드럽게 회전시켜 섞어줍니다. 그리고 RNA hybridization buffer와 probe를 65 °C로 미리 가온한 후, vials를 mutator에 장착하여 배아를 흔들어 줍니다.

배아를 프로브 용액에 넣고 65 °C에서 흔들어주며 하룻밤 동안 하이브리드화한 후 다음 날 확인합니다. 프로브 용액을 제거하고 날짜와 사용 횟수를 표시한 15 mL 스크류 캡 폴리스티렌 튜브에 보관합니다. 프로브 용액은 -20 °C에서 보관하십시오.

프로브를 제거한 후, 여기에 설명된 일련의 세척 과정을 통해 프로브에 대한 항체 염색을 위해 배아를 준비하십시오. 배아가 담긴 바이알이 부착된 뮤테이터를 적절한 온도로 설정된 하이브리다이제이션 오븐으로 직접 이동시켜 필요에 따라 온도를 변경하십시오. 배아를 블로킹 용액에서 배양하는 동안, 항체를 배아에 첨가하기 전 블로킹이 이루어질 수 있도록 적절한 부피의 블로킹 용액과 anti-D dig 항체 혼합액을 조제하십시오. 항체 용액 내에서 배아를 4°C로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날에 회수하십시오.

항체 용액을 제거하고 말레산과 염화나트륨이 포함된 용액인 mab로 세척합니다. 상온에서 록킹(rocking)하며 최소 1~30분 동안 세척을 수행합니다. 마지막 세척 용액을 알칼리성 인산분해효소 기질로 교체합니다.

다음 날 실온에서 오버나이트로 쉐이킹하며 염색 반응을 수행합니다. 이 표에 설명된 대로 액체를 교체하여 염색 반응을 중단하고 배아를 보관 및 이미징 단계로 준비합니다. 배아를 재수화한 후, MFA로 30분 동안 염색물을 고정합니다.

고정이 완료되면 MFA를 제거하고 배아를 25%methanol로 세척합니다. 내인성 색소 제거가 필요한 경우, 25%methanol을 제거하고 표백액을 첨가합니다. 표백 과정은 비교적 빠르게 진행되므로 면밀히 관찰하며, 원하는 효과에 따라 표백 정도를 조절할 수 있습니다.

장기 보관을 위해서는, 단기 보관 및 이후 영상 촬영을 위한 표백 과정에 이어 메탄올 시리즈를 통해 배아를 100% methanol까지 탈수하십시오. 이후 배아를 PBS로 옮깁니다. 투명화되지 않은 배아는 1% aros 배경에서 관찰 및 촬영하는 것이 가장 좋습니다. aros 용액을 준비하려면, 물에 aros를 넣고 aros가 완전히 용해될 때까지 끓입니다. aros가 50 °C로 식으면, 페트리 접시에 약 2 mm 깊이로 붓습니다.

aros 디쉬가 준비되면, 투명화 처리되지 않은 배아를 디쉬에 놓고 이미징을 진행합니다. aros는 배아 및 염색 반응의 푸른색과 대비가 잘 되는 청회색 배경을 제공합니다. 또한 시선을 배아로부터 분산시키는 그림자와 반사를 확산시켜, 복측과 같은 다른 각도에서 배아를 이미징하는 데 도움을 줍니다.

미세 핀셋을 사용하여 배아가 들어갈 수 있도록 어로스(aros)에 절개선을 만듭니다. 배아의 방향을 잡기 위해 해당 채널에 배아를 배치합니다. 배아는 쉽게 손상될 수 있으므로 취급 시 주의하십시오.

광섬유 광원을 사용하여 배아를 낮은 각도에서 비추면, 배아에 그림자가 생겨 이미지에 입체감이 부여되고 표면 구조를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이는 표백 과정에서 유용한 지표가 되는 색소가 제거될 수 있기 때문입니다. 강하게 표백된 배아의 경우 그림자 효과를 활용하십시오. 투명화된 배아는 척수, 폐 또는 뇌의 특정 영역과 같이 배아 내부 깊숙이 위치한 염색 상태를 촬영하는 데 사용됩니다.

본 프로토콜에서는 배아의 염색 상태를 시각화하기 위해 서로 다른 수준의 표백 과정이 사용됩니다. 염색이 강한 경우에는 색소를 일부 남기는 가벼운 표백을 통해 배아의 발달 단계 확인 및 방향 설정을 더 용이하게 할 수 있습니다. 반면, 신장과 같이 색소 침착 수준이 높은 부위에 염색이 된 경우에는 더 강한 표백을 수행하는 것이 더 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.

ARO 베이스를 조작하면 배아의 방향 설정에 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, ARO에 미세한 채널을 컷팅함으로써, 옆으로 누워 있는 올챙이 단계의 배아를 복측에서 관찰할 수 있으며, 양질의 이미지를 캡처할 수 있을 만큼 충분한 안정성을 확보할 수 있습니다. 이 배아는 복측이 위로 향하도록 위치를 안정시키는 작은 구멍에 배치되었으며, 이를 통해 관심 유전자의 발현 패턴을 전체적으로 관찰할 수 있었습니다.

PAX2로 염색된 불투명한 비투명화 배아와 투명화 배아 모두에서 내부 기관을 관찰할 수 있습니다. 34단계에서는 신경관뿐만 아니라 시신경stalk도 시각화할 수 있습니다. 하지만 세부 사항이 선명하지는 않습니다. 배아를 투명화함으로써 시신경stalk를 포함한 발현 부위의 경계가 더 선명해집니다.

투명화 정도는 이 배아의 양쪽 눈이 모두 보이는 것으로 확인할 수 있습니다. 하지만 투명화된 배아에서 흔히 발생하는 문제는 일부 염색약이 내부 강에 축적된다는 점입니다. 이 영상을 시청하고 나면, 더 적은 시약으로 빠르게 whole mount in situ를 수행하고 고품질의 이미지를 캡처하는 방법을 충분히 익히게 될 것입니다.