Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 유충에서 에스트로겐 반응 세포를 자동으로 감지하는 것입니다. 이것은 먼저 5 마리의 X-E-R-E-G-F-P 성어를 번식시켜 에스트로겐 리포터 제브라 피쉬 배아를 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로, 배아를 96웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다.

그런 다음 에스트로겐이 배아 플레이트에 추가됩니다. 마지막으로, 전동 스테이지가 있는 epi 형광 현미경을 사용하여 플레이트를 형광으로 스캔합니다. 궁극적으로 형광 현미경은 에스트로겐 수용체의 조직 특이적 활성을 보여주는 데 사용됩니다.

따라서 높은 처리량 또는 높은 함량 스크리닝과 같은 다른 기존 기술에 비해 이 기술을 사용하는 주요 이점은 제브라피시 유충의 조직 특이적 형광을 표준 에피 형광 현미경을 사용하여 이미지화할 수 있다는 것입니다. 전동 스테이지가 장착되어 있어 특수 플레이트 리더가 필요하지 않습니다. 주의: BPA와 에스트라디올이 함유된 화학 물질은 위험하며 인간 태아에게 해로운 영향을 미칠 수 있습니다.

내분비 교란 물질을 주의해서 다루고 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오. 이 시연에서 제브라피쉬는 제브라피시를 사육하고 난자를 수집하고 동일시한 후 수정 후 48시간부터 다양한 용량으로 에스트로겐 17 베타 에스트라디올, 비스페놀 A 및 게닌에 노출됩니다. 치료 당일의 텍스트에 따르면, 1 밀리리터의 E 3 B 플러스 PTU 와류에 1에서 1000까지 원료 화학 용액을 격렬하게 해동합니다.

차량 제어로. 큰 구멍 플라스틱 이동을 사용하여 E 3 B 및 PTU에서 DMSO를 1에서 1000 희석하여 사용합니다. 피펫은 웰당 3개의 배아를 96웰 플레이트로 옮겨 조건별로 3개의 웰을 준비합니다.

장기간 치료 중 배지의 증발을 방지하기 위해 외부 웰에 배아를 두지 마십시오. 배아가 건조되지 않도록 신속하게 작업하여 각 웰에서 배지를 제거하고 200마이크로리터의 웰 혼합 처리 용액을 추가합니다. 모든 배아가 용액에 잠겨 있고 웰 측면에 달라붙지 않았는지 육안으로 확인합니다.

72시간에 섭씨 28.5도에서 배아를 배양합니다. 수정 후 트리카 1밀리리터당 4밀리그램 10마이크로리터를 첨가하여 배아를 마취합니다. 각각에 96웰 플레이트를 전동 스테이지에 잘 놓고 Zeiss Zen Blue 2011 소프트웨어를 사용합니다.

샘플 캐리어 옵션을 선택하고 multi well 96을 선택하여 스테이지를 보정합니다. 그런 다음 10 x 대물렌즈와 명시야 또는 BF 설정을 사용하여 단계별 지침을 따르기 전에 보정을 선택하고, 양성 대조군 배아를 식별하고, BF 및 GFP 채널에 대한 노출 설정을 적절하게 설정하여 형광 신호가 카메라를 포화시키지 않는지 확인합니다. 단일 배아에 초점을 맞추고 현재 초점면에서 50마이크로미터 위, 50마이크로미터 아래에 있는 이미지 1개를 포함하여 총 3개의 Z 단면을 획득하도록 현미경을 프로그래밍합니다.

다음으로, GFP 및 BF 채널을 사용하여 타일링 이미지를 획득하도록 소프트웨어 매개변수를 설정합니다. Acquisition 탭에서 Advanced setup을 선택하고 tile regions를 선택한 다음 tiles를 선택합니다. 서클을 선택합니다.

웰 옵션은 캐리어 및 채우기 계수 90%를 선택하여 선택한 웰의 여러 이미지를 캡처하여 각 웰 영역의 90%가 합성 이미지에서 표시되도록 합니다. 옵션에서 원하는 겹침 양을 선택합니다(예: 5%에서 10%까지).그러면 이미지 사이의 이음새가 매끄럽게 됩니다. 그런 다음 이미징을 시작하여 20 x 대물렌즈와 BF 설정을 사용하여 수동으로 이미지를 캡처하고 양성 대조 배아를 식별합니다.

이전과 같이 BF 및 GFP 설정을 지정하고 이미지를 촬영합니다. 이 그림은 96웰 플레이트의 개별 웰에서 얻은 복합 이미지를 보여줍니다. 각 이미지는 5%의 이미지가 겹치는 59개의 개별 이미지로 구성됩니다.

살아있는 제브라피쉬는 각 우물 내에서 무작위로 방향을 잡고 있습니다. 그러나 우리는 심장의 형광과 간의 형광을 구별할 수 있습니다. 명시야 이미지는 제브라피시의 방향을 평가하고 형태학적 이상을 시각화하기 위한 참조로 유용합니다.

여기에 표시된 이미지는 보다 자세한 분석을 위해 20배의 긴 작동 거리 대물렌즈로 캡처한 것이며, 현미경 스테이지에서 플레이트를 제거하지 않고 방금 표시된 자동 스캔 직후에 촬영한 것입니다. 20 x objective를 사용하면 심장의 형광을 화살표로 표시된 심방 심실 판막과 화살촉으로 표시된 대동맥 판막에 정확하게 국한시킬 수 있습니다. 이 기술을 마스터하면 하루에 3,96개의 월 플레이트에서 이미지를 캡처할 수 있습니다.

내분비 교란 화합물을 사용하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 적절한 예방 조치를 취하십시오.