Name: Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 배우세요 제브라피시 태아에서 조직 특이 형광을 반자동화 이미징으로 관찰하는 방법을 Danio rerio를 이용하여. 이 기술은 에스트로겐 수용체 활성을 효율적으로 연구하는 데 도움을 줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 수잔 농부와 제브라 피쉬의 치료에 대한 UAB의 제브라 피쉬 연구 시설의 직원을 감사드립니다. 약리학 및 독물학의 부에서 창업 자금에 의해 제공되는 자금.

참고 :이 프로토콜은 버밍엄 기관 동물 관리 및 사용위원회에 위치한 앨라배마 대학에 의해 승인되었습니다. 1. Zebrafish의 사육 및 계란 컬렉션 <ol><li> 사흘 화학 물질 노출을 시작하기 전에, 별도의 남성과 여성에 대한 분할을 사육 탱크를 조립합니다. 양식 시스템 물을 각 탱크의 중간을 입력합니다. 칸막이로 구분하여 각각의 탱크에 2 명의 남성과 3 명의 여성을 배치, 사육 탱크에 c262/c262 물고기 : 그물을 사용하여,의 Tg (GFP 5xERE)을 전송합니다. 각각의 탱크에 뚜껑을 배치하고 날짜와 교차하는 긴장과 레이블. </li><li> 다음날 아침, 모든 장벽을 제거하고 기울기는 사육 수조의 한쪽 끝에서 얕은 지역을 만들기 위해 배플. 제브라 피쉬의 정확한 발달 준비를하기 위해 10 분 간격으로 배아를 수집, 짝짓기를 할 수 있습니다. 배양 접시에 E3B 매체 부드럽게 세척 배아를 사용하여 차 여과기를 세척하여 청소 계란. 영구적으로 성인 물고기를 반환탱크. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 정렬, 계산, 및, 미 수정의 이상 또는 손상 배아를 제거합니다. 어두운주기 : 14시 10분 빛으로 28.5 ° C에서 E3B 매체와 집에있는 페트리 접시에있는 장소의 배아. 배아 밀도 발달에 영향을 미칠 수있다. 60 X 15mm 접시에 100 × 35mm 접시에 더 이상 100 이상의 배아를 더 이상 50 이상의 배아를 놓습니다. </li><li> 24 HPF으로, 200 μM 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU)를 포함 E3B와 미디어를 교체합니다. PTU는 색소 형성을 방지하고, 제브라 피쉬 배아 및 향상된 이미지 선명도에 대한 투명한 애벌레를 유지합니다. 주의 : 집중 PTU 주식은 위험합니다; E3B + PTU 솔루션을 할 때 장갑을 착용하십시오. </li><li> 일일 포스트 수정에 (DPF), 수동으로 미세 집게를 사용하여 각 배아에서 융모막을 제거합니다. 융모막은 에스트로겐의 침투에 영향을 나타나지 않습니다, 그러나 제거는 이미지 선명도를 향상시킵니다. 미디어 chorions를 제거 할 필요는 없다. 참고 : 수동 dechorionation에 대한 대안으로, 배아의 일괄 체 할 수 있습니다이전 11 설명한대로 mically, 1 ㎎ / ㎖ 프로 나제 치료를 사용하여 dechorionated. </li></ol> 태아의 2. 화학 처리 <ol><li> 치료 전날, 1,000 배의 DMSO의 농도 (또는 적당한 용매)에 각 화학 물질의 재고 솔루션을 준비합니다. 예를 들면, 10 μM의 비스페놀 A (BPA)으로 배아를 노출 100 % DMSO에 10mM의 BPA의 스톡 용액을 제조 하였다. 이는 각 처리에 균일 DMSO 농도를 보장하고 DMSO의 무독성 1:1,000 희석 차량 제어의 역할을 할 수있다. -20 ° C에서 매장 재고 솔루션 이 프로토콜의 경우, 태아는 1 μM과 10 μM BPA, 18.5 ㎚, 1.85 μM의 genistein, 367 nm의 에스트라 디올 (양성 대조군)와 자동차 (0.1 % DMSO, 음성 대조군)에 노출 될 것입니다. 주의 : 같은 BPA 및 에스트라 디올과 같은 화학 약품이 위험하고 인간의 태아에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 주의 호르몬을 처리하고 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다.</li><li> 치료의 날, 해동 재고 화학 솔루션을 준비했다. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 1 ㎖ E3B + PTU를 피펫 및 주식 화학 용액 1 μl를 추가하여 1:1,000 희석. 소용돌이 적극적으로. 차량 제어로 E3B + PTU에 DMSO 1:1,000 희석. 처리되지 않은 대조군으로 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 1 ㎖의 E3B + PTU를 사용합니다. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 큰 구멍 플라스틱 전송 피펫, 페트리 접시에서 전송 배아를 사용하여 당 3 배아 아니라, 조건 당 3 우물. 장기간의 치료 기간 동안 증발을 방지하기 위해 판의 바깥 쪽 행과 열 (행 A와 E, 열 1, 12)에서 배아를 생략합니다. 외부 우물 E3B + PTU 300 μL로 채워질 수있다. 적절 플레이트 뚜껑을 레이블. </li><li> 뾰족한 플라스틱 전송 피펫으로 각 우물에서 용지를 제거합니다. 배아를 건조 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다. </li><li> 잘 대응에 처리 액 200 μl를 추가합니다. unde 뚜껑을 놓습니다적절한 우물에 치료의 추가를 확인하기 위해 가이드로 판을 rneath. 와동 각 튜브 용액에 화학 물질을 분배하기 위해 피펫 팅에 앞서. 시각 각 배아 처리 액에 확인. 배아 웰의 측면에있는 경우, 처리 용액에 잘들을 세척하는 클린 전송 피펫을 사용한다. </li><li> 28.5 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다 태아는 72 HPF에서 형광 분석됩니다. </li></ol> 96 - 웰 플레이트에있는 태아의 3. 자동 영상 <ol><li> 각 웰에 4 ㎎ / ㎖ tricaine의 10 μl를 추가하여 태아를 마취. 참고 : 이전 영상에 태아를 마취. 24-96 HPF에서 제브라 피쉬는 자발적 움직임과 이미지를 캡처하는 동안 변화하는 광원에 깜짝 놀라는 반응을 나타냅니다. 배아를 마취하는 것은 이미징 동안 운동을 감소시킨다. </li><li> 자동화 된 단계에서 96 - 웰 플레이트를 놓고 무대를 보정합니다. 혈구 선 블루 현미경 자동 2011 소프트웨어를 사용하여과 제어, 샘플 캐리어 옵션을 선택하고 멀티 웰 (96)을 선택합니다. 보정을 선택합니다. 무대를 보정하는 단계별 지시 사항을 따르십시오. 참고 :이 단계 이후에 타일 버튼의 선택을 취소하지 마십시오. 타일​​ 버튼을 선택하지 않으면 보정 설정이 손실 될 수 있으며, 96 - 웰 플레이트는 재 교정해야합니다. </li><li> 설정 (BF) 및 10X 대물 시야를 사용하여, 양성 대조군 배아를 식별하고 형광 신호는 카메라가 포화되지 않는 것을 확인하고, BF와 GFP 채널 적절 노출 설정을 설정한다. 하나의 배아에 초점을 총 3 Z-섹션, 위의 하나의 이미지 50 μm의 현재 초점면 아래 한 50 ㎛를 취득하는 현미경을 프로그램. 참고 : 다른 조직이 서로 다른 초점면을 차지하기 때문에 각 제브라 피쉬의 이미지가 초점이 심장과 간으로 캡처를 위해,이 사항을 확인합니다. </li><li> GFP 및 BF의 channe를 사용하여 타일 이미지를 얻기 위해 소프트웨어 매개 변수를 설정LS. 인수 탭에서 고급 설정을 선택합니다. 선택 타일 영역은 다음 타일. 원도 옵션을 선택합니다. 참고 : 바둑판 식 배열이 아니라 각각의 합성 이미지를 만드는 데 사용됩니다. 단일 시야 각 웰의 작은 부분만을 캡처한다. 타일​​링 기능은 자동으로 전체도의 복합 이미지를 만드는 필드 -보기 각 우물에서 여러 인접를 캡처 할 수 있습니다. 각 합성 이미지가 하나의 잘에서 수십 개의 개별 이미지가 포함 된 위치를 자동으로 접시 당 96 합성 이미지를 캡처하는 것이 가능하다. </li><li> 캐리어를 선택하고 인자에게 90 %를 입력합니다. 90 %의 충진율을 선택하면 이러한 각 웰의 면적의 90 %가 합성 화상에 표시 될 것으로 선택된 웰의 여러 이미지를 캡처 할 것이다. NOTE : 충진율을 선정 할 때, 다이어그램이 묘화되는 영역을 나타내는 표시 될 것이다. 우물의 영역을 포함하는 비율을 선택이 실험에 적합합니다. </li><li> 옵션에서 원하는 중첩의 양을 선택합니다. 참고 : 하나의 대표 이미지를 함께 타일을 바느질 할 때, 10 %의 중첩 이미지 사이에 부드러운 솔기 수 있습니다. 스티치 화상이 불필요한 경우에는, 0 % 오버랩을 사용하여 촬상 시간을 줄이는 것이다. 90 % 곡선 인자 및 5 % 오버랩을 사용하여, 단일 웰의 합성 화상 (59)에 개별 이미지로 구성된다. </li><li> 영상을 시작합니다. 현미경은 자동으로 이미지를 수집합니다. </li><li> 수동으로 조직 특이 형광 잘 각각의 합성 이미지 (그림 1)을 검사합니다. </li><li> 참고 : 화학 물질의 노출은 이전 실험적인 치료 우물을 관찰에 근무 함을 확인하는 긍정적 인 제어로 시작하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol> 96 - 웰 플레이트에있는 태아의 4. 수동 이미지 캡처 참고 : 결과를 확인 AC에 20 배 긴 작동 거리 목표를 사용하려면첩 더 자세한 이미지를 수동으로 (그림 2). <ol><li> 설정 (BF) 20 배 목표와 시야를 사용하여, 긍정적 인 제어 배아를 파악하고 형광 신호가 카메라를 포​​화되지 않은 것을 확인하고, 적절하게 BF 및 GFP 채널에 대한 노출 설정을 설정합니다. </li><li> 수동으로 개별 배아 및 캡처 이미지를 확인합니다. 참고 : 노출 설정이 양성 대조군 배아 선택하고 나면 설정을 변경하지 마십시오. 각 이미지는 균일 한 조건 하에서 촬영 된대로 이것은 형광 강도의 비교를 허용한다. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아에 자동으로 이미지 조직 특이 형광을 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 자이스의 Axio 옵저버를 사용하여 개발되었습니다. Z1은 선 블루 2011 소프트웨어와 함께, 그러나이 기술은 합성 이미지를 만들 수 타일링을 수행 할 수있는 자동화 된 무대와 현미경 제어 소프트웨어와 함께 모든 거꾸로 현미경을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 전동 무대 거꾸로 현미경을 갖추는 것은 높은 콘텐츠 심사를위한 전문 장비를 구입에 실제보다 저렴한 대안을 제공 할 수 있습니다. 전동 스테이지는 스테이지의 현미경과 품질의 제조업체와 모델에 따라 수천에서 미국 달러의 수만에 이르기까지 다양합니다. 프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 일부 화학 물질에 따라서는 치료 기간 동안 어둠 속에서 배아를 배양하는 것이 도움이 될 수 있습니다, 광 감응성. 제브라 피쉬 배아는 탈수에 민감합니다. 따라서, CHEMI에 대한칼 노출 하루 이상 지속은 증발 (프로토콜 ...

형질 전환 제브라 피쉬는 섬유 아세포 성장 1, 레티노 산 2 인자 라이브 배아, 3 에스트로겐과 같은 경로를, 신호의 활동의 직접적인 시각화 수 있도록 개발되었다. 이러한 도구는 (형광 강도의 변화로 정량) 신호 전달 경로를 교란 화학 물질 또는 조직 특이하게 4 (형광 현지화의 변화)에 신호를 변조 화학 물질에 대한 검사를 가능하게합니다. 자동 이미지 캡처는 크게 5,6 화학 화면의 처리량을 증가시킨다. 라이브 제브라 피쉬의 자동 분석 형광 종종 고가의 전문 장비에 의존 화면. 소위 높은 콘텐츠 심사는 높은 해상도, 양적 이미징하지만, 공 초점 현미경 7,8에 장착 된 특수 플레이트 리더를 사용하는 비용의 혜택을 제공합니다. 이 방법의 목적은 제브라 피쉬 배아 자동 분석 조직 특이 형광하다표준 표면 형광 현미경을 사용하여 96 - 웰 플레이트에. 조직 특이 형광이 기술을 사용하여 구분할 수 있습니다 전문 플레이트 리더 또는 높은 콘텐츠 검사 장치에 대한 액세스를 부족 실험실을위한 합리적인 방법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 3 일 포스트 수정 (DPF)에서 조직 특정 에스트로겐 수용체 (ER) 라이브 제브라 피쉬의 효능을 감지하는 자동화 이미징을 사용합니다. 유전자 변형 라인의 Tg (5xERE : GFP) c262/c262 녹색 형광 단백질 (GFP)의 상류에 5 탠덤 에스트로겐 반응 요소의 DNA 시퀀스 (ERE)을 포함 3. 리간드의 부재에서, ER로는 일반적으로 비활성이다. 리간드 결합은 수용체가 ERE DNA를 결합하여 전사 9를 조절 할 수 있도록 구조적 변화를 트리거합니다. 5xERE : GFP 물고기 ER 변조기 화학 라이브러리를 화면으로 사용할 수 있으며, 에스트로겐 오염 물질에 대한 환경 물 샘플을 선별하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>플라스틱 이송 피펫; 넓은 구경</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 이송 피펫; 파인 팁</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>96-웰, 원형, 평평한 바닥 플레이트</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>100 x 35 mm 플레이트</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>35 x 60 mm 플레이트</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 파인</td><td>사이언스 도구</td><td>11254-20</td><td>팁 치수 0.05 x 0.01 mm, 배아에서 chorions를 수동으로 제거하기 위한</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>레시피는 제브라피쉬 책 참조 (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-페닐 2-티오우레아(PTU)</td><td>시그마 알드리치</td><td>P7629-10G</td><td>20mM 재고(100x)를 준비하고 200°C에서 사용합니다. E3B의 M&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td> 프로토콜에는 전동 스테이지 20x 긴 작동 거리 대물렌즈가 <td>있는 도립 형광 현미경이 필요합니다</td></tr>. <tr><td></td><td>Carl Zeiss</td><td></td>는 <td>0.4 NA 및 8.4mm 작동 거리가 있는 대물렌즈를 사용합니다</td></tr>. <tr><td>Axiocam HRm 디지털 카메라</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 현미경 제어 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>프로토콜은 모터화된 스테이지를 사용하여 타일 이미지를 캡처할 수 있도록 현미경 자동화 및 제어 소프트웨어를 필요로 합니다.</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25그램</td>은 <td>RO 물에 2% 용액을 만들어 E3B (아래)E3B</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>60X E3 용액에서 사용하기 위한 것입니다. 해결책: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17.2 그램 KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0.76 그램 < / > CaCl2-2H 2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2.9 그램 MgSO4-7H2O&nbsp; - 4.9 그램 또는 MgSO4- 2.39 그램 1 리터 Milli-Q 물에 용해시킵니다. 멸균 1리터 병에 보관하십시오. 1X E3B 제브라피쉬용 솔루션: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml 2% 메틸렌 블루&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &뮤; 엘&nbsp; Milli-Q water 로 9리터로 사용 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

제브라 피쉬 배아는 작은 분자의 대규모 스크리닝을위한 강력한 도구입니다. 형광 리포터 단백질을 표현 형질 전환 지브라 피쉬 자주 유전자 발현을 조절하는 물질을 식별하는 데 사용된다. 라이브 제브라 피쉬에서 형광을 분석 실험 화학의 화면은 종종 높은 콘텐츠 심사를 위해 고가의 전문 장비에 의존하고 있습니다. 우리는 모터 단계 자동으로 이미지 제브라 피쉬 배아에 함께 표준 표면 형광 현미경을 사용하여 프로 시저를 설명하고 조직 특이 형광을 감지합니다. GFP의 발현을 통해 에스트로겐 수용체의 활동을보고 형질 전환 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 조직 특정 방식으로 기자를 활성화 에스트로겐 수용체 리간드에 대한 화면으로 반 자동화 된 절차를 개발했다. 이 비디오에서 우리는 96 - 웰 플레이트에 24-48시간 포스트 수정 (HPF)에서 제브라 피쉬 배아으로 배열 및 에스트로겐 수용체를 바인딩 작은 분자를 추가하는 절차에 대해 설명합니다. 72-96 HPF에서, 각각의 이미지를 잘에서전체 판을 자동으로 수집 및 수동으로 조직 특이 형광을 위해 검열된다. 이 프로토콜은 아니지만 간에서의 심장 판막의 수용체를 활성화 에스트로겐을 감지하는 능력을 보여준다.

그림 1은 96 - 웰 플레이트의 각각의 우물에서 합성 이미지를 보여줍니다. 각 합성 이미지는 5 % 이미지 중첩 59 개별 이미지로 구성되어 있습니다. 라이브 제브라 피쉬가 아니라 각 내에서 무작위로 지향, 아직 우리가 간에서 중심에 형광을 구별 할 수있게되어 있습니다. 시야 이미지는 제브라 피쉬의 방향을 평가하고, 형태 학적 이상 (그림 1A와 1C)를 시각화에 대한 참조로서 유용하다. 10 배 목표를 사용하여 자동화 된 영상이 화학 물질을 화면과 높은 배율에서 수동 평가 보증을 결정하는 데 사용된다. 2도 더 자세한 분석을 위해 20 배 긴 작동 거리 목표로 촬영 한 이미지를 보여줍니다. 이러한 이미지는 현미경 스테이지에서 플레이트를 제거하지 않고도 1에 도시 된 자동화 된 주사 직후 촬영했다. 20 배 목표를 사용하여 마음에 형광 정확하게 심장 발을 지역화 할 수 있습니다VES (그림 ...

제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피쉬 치어에서 에스트로겐 반응성 세포를 자동으로 검출하는 것입니다. 이는 먼저 5마리의 X-E-R-E-G-F-P 성어들을 교배하여 에스트로겐 리포터 제브라피쉬 배아를 생성함으로써 수행됩니다. 그다음, 배아들을 96웰 플레이트의 개별 웰에 배치합니다.그런 다음 배아가 담긴 플레이트에 에스트로겐을 첨가합니다. 마지막으로, 전동 스테이지가 장착된 에피 형광 현미경을 사용하여 플레이트의 형광을 스캔합니다. 궁극적으로, 형광 현미경 관찰을 통해 에스트로겐 수용체의 조직 특이적 활성을 보여줍니다.고처리량 스크리닝(high throughput screening)이나 고함량 스크리닝(high content screening)과 같은 다른 전통적인 기법들에 비해 이 기술을 사용할 때 얻을 수 있는 주요 장점은, 제브라피시 치어의 조직 특이적 형광을 표준 에피 형광 현미경만으로 영상화할 수 있다는 점입니다. 전동 스테이지가 갖춰져 있다면 별도의 특수 플레이트 리더가 필요하지 않습니다. 주의: BPA 및 에스트라디올(estradiol) 성분이 포함된 화학 물질은 위험하며 태아에게 해로운 영향을 미칠 수 있습니다.내분비 교란 물질은 주의해서 다루어야 하며 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하십시오. 본 시연에서는 제브라피쉬를 교배하고 알을 수집 및 균등 분배한 후, 수정 후 48시간부터 다양한 용량의 에스트로겐인 17 beta estradiol, bisphenol A 및 genine에 노출시킵니다. 본문에 따라 처리 당일에 해동된 스톡 화학 용액을 E3 B+ PTU 1 mL에 1:1000 비율로 희석한 후 격렬하게 볼텍싱하십시오.대조군으로 사용합니다. 대구경 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 E3B 및 PTU에 DMSO를 1:1000 비율로 희석합니다. 조건당 3개의 웰을 준비하여 96웰 플레이트의 각 웰에 배아 3개씩 옮깁니다.장시간 처리 과정 중 배지의 증발을 방지하기 위해 배아를 바깥쪽 웰에 배치하지 마십시오. 배아가 건조되는 것을 방지하기 위해 신속하게 작업하며, 각 웰에서 배지를 제거하고 잘 혼합된 처리 용액 200 microliters를 첨가하십시오. 모든 배아가 용액에 잠겨 있는지, 그리고 웰 벽면에 붙어 있지 않은지 육안으로 확인하십시오.배아를 28.5 °C에서 72시간 동안 배양합니다. 수정 후, 4 mg/mL 농도의 trica 10 µL를 첨가하여 배아를 마취시킵니다. 96-well 플레이트의 각 well에 배아를 배치하고, 이를 전동 스테이지 위에 올린 후 Zeiss Zen Blue 2011 소프트웨어를 사용하여 관찰합니다.샘플 캐리어 옵션을 선택하고 multi well 96을 선택하여 스테이지를 보정하십시오. 그 다음 보정을 선택하고 단계별 지침을 따르십시오. 10 x 대물렌즈와 명시야 또는 BF 설정을 사용하여 양성 대조군 배아를 식별하고, 형광 신호가 카메라에서 포화되지 않도록 BF 및 GFP 채널의 노출 설정을 적절하게 설정하십시오. 단일 배아에 초점을 맞추고, 현재 초점 평면의 50 micrometers 위와 50 micrometers 아래의 이미지를 각각 하나씩 포함하여 총 3개의 Z-section을 획득하도록 현미경을 프로그래밍하십시오.다음으로, GFP 및 BF 채널을 사용하여 타일 이미지를 획득하도록 소프트웨어 파라미터를 설정합니다. 획득(acquisition) 탭에서 고급 설정(advanced setup)을 선택하고, 타일 영역(tile regions)을 선택한 다음 타일(tiles)을 선택하십시오. 원형(circle)을 선택합니다.Well 옵션에서 캐리어와 채움 인자(fill factor) 90%를 선택하여 선택한 웰의 여러 이미지를 캡처합니다. 이렇게 하면 각 웰 면적의 90%가 합성 이미지에 표시됩니다. 옵션에서 5~10%와 같이 원하는 중첩(overlap) 정도를 선택하면 이미지 간의 경계가 매끄럽게 처리됩니다. 그런 다음 20x 대물렌즈와 BF 설정을 사용하여 수동으로 이미지 캡처를 시작하고, 양성 대조군 배아를 식별합니다.이전과 동일하게 BF 및 GFP 설정을 지정하고 이미지를 촬영합니다. 이 그림은 96-well 플레이트의 개별 well에서 얻은 합성 이미지를 보여줍니다. 각 이미지는 5%의 이미지 중첩이 포함된 59개의 개별 이미지로 구성됩니다.살아있는 제브라피시는 각 웰 내에서 무작위로 배치되어 있음에 유의하십시오. 그럼에도 불구하고 우리는 심장의 형광과 간의 형광을 구별할 수 있습니다. 명시야 이미지는 제브라피시의 방향을 평가하고 형태학적 이상을 시각화하는 참조 자료로 유용합니다.여기에 표시된 이미지들은 더 상세한 분석을 위해 20 x 장작동거리(long working distance) 대물렌즈로 캡처되었으며, 플레이트를 현미경 스테이지에서 제거하지 않고 방금 보여드린 자동 스캔 직후에 촬영되었습니다. 20 x 대물렌즈를 사용하면 심장의 형광이 화살표로 표시된 심방심실판막과 화살표 머리로 표시된 대동맥판막에 정확하게 국소화되어 있음을 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 하루에 3개의 96-웰 플레이트 이미지를 캡처할 수 있습니다.내분비 교란 화합물을 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 등 항상 적절한 예방 조치를 취하십시오.

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.

Zebrafish의 단세포 운명 매핑

출처: Zhang, X., et al. 생체 재료 관련 황색포도상구 균 감염의 생체 내 시각화 및 생체 내 분석을 위한 제브라피쉬 배아 모델. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 황색포도상구균을 주입한 제브라피쉬 배아의 형광 이미징을 보여주며, 감염 진행 및 박테리아 분포를 정량화하여 생체 내 숙주-병원체 상호 작용에 대한 생체 재료 마이크로스피어의 영향을 평가할 수 있습니다.

 제브라피쉬 배아에서 생체 재료 관련 세균 감염의 형광 이미징

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

Zebrafish 태아 그리고 애벌레의 microinjection 많은 zebrafish 모델에서 사용 되는 중요 하지만 어려운 기술 이다. 여기, 우리 미 도구 안정화에 도움의 범위와 microinjection 및 이미징 zebrafish의 방향 제시.

최적화 된 Microinjection 및 Zebrafish 애벌레의 이미징 microstructured 장치

이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

이 프로토콜은 광시트 이미징을 활용하여 제브라피시 유충의 심장 수축 기능을 조사하고 세포 추적 및 대화형 분석을 통해 심장 역학에 대한 통찰력을 얻습니다.

제브라피시 심장 수축의 4D 광시트 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 제브라피시 태아에서 조직 특이 형광을 반자동화 이미징으로 관찰하는 방법을 Danio rerio를 이용하여. 이 기술은 에스트로겐 수용체 활성을 효율적으로 연구하는 데 도움을 줍니다.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

더 많은 동영상 탐색