메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

이 절차의 전반적인 목표는 메추라기 관 키메라를 사용하여 두개골 얼굴 발달 중에 신경 지각 세포가 종 특이적 패턴을 생성하는 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이것은 먼저 9.5기 메추라기 배아의 중간 및 앞쪽 뒷뇌 영역에서 신경 주름의 스트립을 해부하고 제거함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 메추라기 기증자 신경 주름을 오리 숙주 배아로 옮기는 것입니다.

세 번째 단계는 9.5기 오리 숙주 배아의 해당 영역을 절개하고 제거하는 것입니다. 마지막 단계는 코일 신경 주름을 오리, 중뇌 및 전방 후뇌 영역에 배치하는 것입니다. 궁극적으로, 생성된 키메라 배아는 C two hybridization을 통해 유전자 발현의 신경능선 매개 변화를 정확히 찾아낼 수 있으며, 조직학적 분석을 통해 형태학적 변화를 밝힐 수도 있습니다.

이 방법에 대한 아이디어는 샌프란시스코의 오션 비치 위로 갈색 펠리컨이 날아가는 것을 보았을 때 처음 떠올랐습니다. 나는 신경능선세포(neural crest cell)가 긴 부리 골격의 뼈와 연골을 생성하기 때문에 종 특이적 패턴의 근원임에 틀림없다는 것을 깨달았다. 갈색 펠리칸 알을 추적할 수는 없었지만 흰 북경 오리를 찾을 수 있었습니다.

샌프란시스코가 아시아 밖에서 가장 큰 차이나타운을 가지고 있다는 점을 감안할 때, 메추라기와 오리의 성숙 속도와 형태학의 차이를 이용함으로써. 이 방법은 종 특이적 패턴의 기원을 이해하는 것과 같은 발생 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 수술은 박사 후 연구원인 Jennifer Fish 박사가 맡습니다. 제 연구실에서는 대학원생인 Kate Ovitz가 도움을 줄 것입니다. 빵과 버너를 사용하여 테이퍼를 따라 유리가 녹기 시작할 때까지 페이스트 피펫의 좁은 끝을 가열합니다. 화염에서 제거하고 피펫이 밀봉될 때까지 팁을 당깁니다.

테이퍼 부분의 외경이 0.7에서 1mm 사이인지 확인하십시오. 그런 다음 테이퍼에서 약 4cm 떨어진 밀봉된 끝을 떼어냅니다. 다음으로, 다른 쪽 끝에 있는 피펫 불기의 열린 끝 부분에 약 2피트의 고무 튜브를 부착합니다.

튜브에 바람을 불어 부드러운 압력을 제공하는 동안 피펫의 연결부 또는 다른 쪽 끝을 통과하는 공기가 없어야 합니다. 프로판 연필, 화염 토치를 사용하여 테이퍼 시작 부분 바로 아래에 있는 피펫 한쪽 면의 타원형 영역을 가열합니다. 유리가 바깥쪽으로 휘어지기 시작하자마자 화염에서 피펫을 제거하고 고무 튜브를 통해 부드럽게 불어냅니다.

이렇게 하면 유리의 가열된 부분이 소시지 모양의 거품을 형성합니다. 너무 많은 압력을 가하면 유리 거품이 터질 수 있으므로 피해야 합니다. 피펫의 결과 창은 너비가 약 1cm이고 길이가 1cm 반에서 2cm여야 합니다.

이제 테이퍼된 끝을 위쪽으로 향하게 하고 유리 폐기물 용기에 거품을 긁어넣으면서 튜브를 통해 부드럽게 불어 유리 파편이 피펫에 들어가는 것을 방지합니다. 그런 다음 프로판 불꽃을 사용하여 거품의 나머지 가장자리를 조심스럽게 태우고 열린 창의 측면을 불로 닦습니다. 다음으로, 다이아몬드 팁 연필을 수직 위치에 잡고 다이아몬드 팁 연필을 사용하여 테이퍼 시작에서 1cm 떨어진 피펫의 테이퍼 끝 부분에 점수를 매깁니다.

겸자를 사용하여 득점 선에서 피펫을 부드럽게 끊습니다. 팁을 제거하려면 해부 현미경으로 파손 부위가 깨끗하고 들쭉날쭉하지 않은지 확인하십시오. 끝에서 약 9.5mm 떨어진 열린 창 위로 검지 손가락으로 연필을 잡는 것처럼 피펫을 잡습니다.

피펫의 유리를 알코올 버너의 화염 가장자리에 인접하게 하여 부드럽게 합니다. 집게로 팁에 압력을 가하여 해부 범위 아래에서 피펫의 좁은 끝을 60도 각도로 구부립니다. 빠르고 조심스럽게 알코올 버너로 팁을 불로 닦았습니다.

완성된 개구부는 둥글고 장애물이 없어야 합니다. 팁이 수축되어 화염 속에 너무 오래 있으면 사용할 수 없게 됩니다. 이제 2.5cm 길이의 고무 튜브에 70% 에탄올을 윤활합니다.

열린 창을 덮기 위해 아래에서 위로 피펫 샤프트 위로 밀어 넣습니다. 그런 다음 2밀리리터 라텍스 전구를 피펫의 열린 끝 부분에 놓습니다. 내부 기압을 유지하려면 먼저 숙주 알을 준비합니다.

화염 날카롭게 한 텅스텐 바늘을 사용하여 Vitale 멤브레인을 자르고 멤브레인을 배아 위로 당깁니다. 그런 다음 기증자 난자에 대해 했던 것처럼 테이프로 난자를 다시 밀봉합니다. 기증자 난자의 창에서 테이프를 제거하여 기증자 배아에서 신경 주름을 자릅니다.

화염 날카롭게 한 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 양쪽에 슬릿을 만듭니다. 그런 다음 이식편의 원하는 전방 및 후방 수준에서 신경관을 가로질러 절단하고 이식편을 신경관의 나머지 부분과 분리시킵니다. 이식편의 전방 대 후방 모양과 같은 특정 해부학적 세부 사항에 주의를 기울여 기증자 조직이 올바른 방향을 잡을 수 있도록 합니다.

호스트에 넣을 때 텅스텐 바늘이 매우 날카 롭지 않은지 확인하십시오. 조직을 완전히 제거하고 한 조각으로 샤먼 피펫을 사용하여 기증자 배아에서 신경 주름을 제거하기 위해 빠르고 신중한 스트로크를 사용하십시오. 가능한 한 적은 액체를 끌어올리지 않으면 조직이 전사 시 떠다닐 수 있습니다.

이제 숙주 난자의 창에서 테이프를 제거하고 샤먼 피펫을 사용하여 이식을 받을 신경관 영역에 인접한 숙주 배아와 함께 기증자 신경 주름을 배치합니다. 이제 기증자와 마찬가지로 숙주 배아의 신경관에서 신경 주름을 분리합니다. 기증자 조직과 같은 크기의 이식편을 제거하도록 주의하십시오.

이 숙주 조직을 배아에서 멀리 부드럽게 밀어냅니다. 그런 다음 뭉툭한 텅스텐 바늘이나 마이크로 피펫의 둥근 끝을 사용하여 공여자 신경 주름을 숙주 신경관으로 부드럽게 이동하여 적절한 전방 후방 및 배쪽 배쪽 방향을 유지합니다. 이식편이 측면을 따라 끼워져 있는지 확인하되 밑에 있는 조직을 찌르거나 손상시키지 않도록 하십시오.

멸균 식염수는 숙주 배아에 신중하고 부드럽게 도포해야 합니다. 건조의 징후가 있으면 이제 난자를 조심스럽게 다시 밀봉하고 라벨을 붙인 다음 키메라 배아가 원하는 단계로 발달할 수 있는 습도가 높은 인큐베이터로 부드럽게 되돌려 놓습니다. 분석용.

분석을 위해 갓 만든 차가운 Sarah's fixative에 키메라 배아를 수집합니다. 그런 다음 즉시 섭씨 4도의 로커에 올려 놓고 하룻밤 동안 고정하십시오. 이를 통해 항 메추라기 항체로 메추라기 알을 보다 민감하게 검출할 수 있습니다.

Real-Time 정량 PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위한 또 다른 중요한 단계는 RNA에 앞서 배아와 액체 질소를 동결하는 것입니다. 추출 코일과 오리는 크기와 모양에 상당한 차이를 보이기 때문에 배아는 키메라 시스템을 만드는 데 이상적으로 적합합니다. C 두개안면 발달을 연구합니다.

특히 이 시스템은 신경능선세포의 역할을 조사하는 데 유용합니다. 키메라 qua 배아 기증자의 얼굴 골격을 패턴화할 때 메추라기 신경 능선 세포는 숙주 오리 하악궁으로 이동합니다. 오리와 같은 패턴에서 녹색의 메추라기 기증자 세포는 복부 보기에서 항 메추라기 항체로 보입니다.

12기 키메라 배아에서 기증자 신경능선은 크기와 모양이 메추라기와 같은 하악 골격을 생성합니다. 일단 숙달되면 각 이식은 약 5분 안에 완료될 수 있습니다. 더 이상 제대로 수행되면 배아가 건조될 위험에 처하게 되고 생존율이 감소합니다.

이 절차를 수행하는 동안 자세를 인식하고 어깨를 이완하며 좋은 손 위치를 유지하는 것이 중요합니다. 또한 루틴을 개발하고 수술 도구와 시약을 매번 같은 장소에 두어 현미경을 주시하고 자동화된 방식으로 손을 움직일 수 있도록 하십시오.