Name: 메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 배우세요 메추라기-오리 키메라 기법을 이용하여 신경줄기세포가 두개안면 발달에서 종특이적 패턴을 생성하는 메커니즘을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 발달생물학 및 진화생물학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

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이 작품은 치과의 국립 연구소와 두개 안면 연구소 (NIDCR) F32 보조금 (DE021929) JLF 및 RAS에 NIDCR R01 부여 DE016402에 의해 투자되었다

1. 텅스텐 바늘을 준비한다 <ol><li> 로드가 구부러지지 않도록 와이어 커터를 사용하여 반으로 텅스텐 막대를 잘라. </li><li> 5 붕규산 유리의 3 / 4 파스퇴르 피펫의 테이퍼 말까지로드 실. </li><li> 유리로로드 고집의 약 3 / 4 떠나, 풀 총에 사용되는 접착제 지팡이입니다 &quot;핫 멜트 접착제&quot;(HMA)의 작은 구슬과 피펫 팁에 막대를 준수합니다. HMA는 신속하게 접착제를 태워 검은 색 연기가 발생하지 않도록주의를 복용, 알코올 불꽃에 녹아해야합니다. </li><li> 겸자의 쌍을 사용하여, 45 ° 각도에 도달 할 때까지 (약 1 / 4의 상단부로부터) 텅스텐로드의 선단을 굽혀. </li><li> 파스퇴르 피펫을 잡고, 프로판 토치의 불꽃에 텅스텐 막대의 끝 부분의 약 1 / 8을 배치합니다. 끝이 꾸준하고 화염에 정확히 수직으로 잡습니다. </li><li> 불꽃의 주사 바늘을 당겨 순간 tungs의 작은 오렌지 얼룩바늘의 오프 열 파리. </li></ol> 2. 스페 피펫을 준비 <ol><li> 곧 테이퍼 넘어 유리가 녹기 시작할 때까지 분젠 버너를 사용, 파스퇴르 피펫의 좁은 끝을 가열한다. 불꽃에서 제거하고 피펫이 봉인 될 때​​까지 끝을 당겨. 약 0.7 ~ 1.0 mm의 외경을 가지고 테이퍼 부분의 일부가 남아 있는지 확인합니다. 테이퍼에서 약 4cm 떨어져 밀봉 끝을 휴식. </li><li> 피펫의 넓은 (오픈) 끝 부분에 고무 튜브의 약 2 피트 (60cm)를 연결합니다. 공기는 파스퇴르 피펫의 테이퍼 부분을 통과하지 못하도록 보장하기 위해 고무 튜브의 타단에 불어. </li><li> 부속 연필 불꽃 토치 프로판 연료 실린더를 사용하여, 단지 테이퍼 개시 아래 피펫 한쪽 타원형 영역을 가열한다. 압력 소량의 (편지시의 시작을 말하는 데 필요한 압력의 정도 양에 고무 튜브를 매우 부드럽게 지속적으로 공기를 불어대화 수준의 R &quot;P&quot;). 유리가 한면에 부드러운되고 바깥쪽으로 버클을 시작하면 신속하게 불꽃에서 피펫을 제거하고 고무 튜브를 통해 하드와 꾸준한 타격. 이 유리의 가열 된 부분이 잘되는, 팝 수있는 소시지 모양의 거품을 형성하게됩니다. 거품이 너무 작은 경우, 용융 후 다시 유리 불고 시도. 유리의 마지막 열려있는 창 넓은 길이 (12.7 ㎜)의 0.5 (6.35 ㎜)에 0.25를 해결해야한다. </li><li> 테이퍼 단부 포인팅 위쪽으로 부드럽게 피펫 들어가는 유리 파편을 막기 위해 튜브를 통해 불고있는 동안 유리 폐기물 컨테이너로 버블을 긁어. </li><li> 프로판 불꽃을 사용하여 거품과 불 닦으 열린 창문의 양쪽의 나머지 가장자리를 구울 수 있습니다. 피펫의 축 녹지 않도록주의하십시오. </li><li> 다이아몬드 포인트 연필을 사용하여 창 (30 ㎜)의 약 1.25 피펫의 테이퍼 끝을 점수 및 팁을 해소집게로 피펫 구멍이 깨끗하게 (깨지거나 고르지 팁 폐기 피펫을) 절단되도록. </li><li> 집게를 사용하고 굴곡부가 수직 평면에 있도록 알코올 버너 화염의 가장자리는, 약 60 °의 각도로 끝에서 (9.5 mm)에 피펫 0.375의 좁은 부분을 구부릴 때 윈도우 개구 왼손 사용을 위해 오른손 사용 11:00에 대한 1시 위치에있다. 이 단계는 가장 초안없는 인클로저에 실시됩니다. </li><li> 불 닦으 해부 현미경 주류 불꽃을 사용하여 팁. 끝을 봉쇄 아니라 오프닝 라운드를 유지하고 굴곡없이 매끈하게하지 말아주십시오. </li><li> 고무 튜브의 1 (25 ㎜) 조각을 잘라 70 % 에탄올로 튜브의 조각을 살포하고, 창 개방이 완전히 덮여 때까지 피펫의 축에 튜브를 밀어 넣습니다. 이 스페 피펫의 &quot;격막&quot;로 작동합니다. </li><li> 라텍스 고무 2 ㎖ 전구를 배치피펫의 오픈 바닥에. 전구는 스페 피펫에 부정적인 압력을 유지합니다. </li><li> , 스페 피펫을 사용하여 연습을 현미경으로 다른에 표시된 지점에 하나의 배양 접시에 표시된 지점에서 직경이 약 100 ~ 200 ㎛, 크로마토 그래피 비즈를 전송합니다. </li><li> 스페 피펫을 청소하려면 바닥면 또는 거즈로 줄 지어 증류수와 유리 세제로 가득 키가 큰 비커에, 아래 팁, 고무 전구 및 장소 피펫을 제거합니다. </li></ol> 3. 계란 살균을 품다 <ol><li> 70 % 에탄올로 계란을 닦아 및 플라스틱 계란 트레이에 계란을 넣습니다. </li><li> 37.5 ° C와 85-87%에서 가열 된 인큐베이터에서 계란을 설정합니다. </li><li> 그들은 HH9.5, 메추라기와 오리 48 시간 동안 약 26 시간에 도달 할 때까지 알을 품다. </li></ol> 4. 창 계란 <ol><li> 내부 쉘 m에 구멍 않도록주의하면서, 집게로 계란의 상단에서 바깥 쪽의 작은 조각을 제거합니다embrane. </li><li> 1 인치 바늘로 18 G 주사기를 사용하여 계란의 좁은 끝 부분에 구멍을 찌르고 알부민의 약 1 ~ 2 ㎖의 철회. </li><li> 쉘에있는 구멍과 구멍 표시에 투명 테이프를 넣습니다. </li><li> 곡선 가위를 사용 (투명 테이프를 통해) 계란의 표면을 따라 &quot;창&quot;을 잘라. </li></ol> 5. 태아를 시각화 및 수술 준비 <ol><li> 유리 막대를 사용하여 부드럽게 배아 위에 중성 레드 소량 (행크의 BSS에서 0.02 g / ㎖)를 브러시. </li><li> 난황 막 컷 불꽃 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 배아에 당깁니다. </li><li> 창에 투명 테이프를 배치하여 계란을 다시 봉인. </li></ol> 6. 기증자의 배아에서 기증자의 조직을 분리 <ol><li> 기증자의 배아의 계란 창에서 테이프를 제거합니다. </li><li> 기증자의 배아 인접한 외배엽에서 신경 배를 잘라, SID 모두에 슬릿을(전술 한 바와 같이 제조 된) 화염 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용 신경관의 에스. </li><li> 그 후, 이식 원하는 전방 및 후방 수준에서 신경 튜브 가로 질러 및 신경 튜브의 나머지 부분에서 이식을 분리합니다. </li><li> 스페 피펫 또는 마이크로 피펫의 다른 유형을 사용하여 기증자의 배아에서 신경 배를 제거합니다. </li><li> 그런 다음, 호스트 계란 창에서 테이프를 제거하고 이식을받을 신경관의 영역에 인접한 호스트 배아 함께 기증자 신경 배를 배치 스페 피펫을 사용합니다. </li></ol> 7. 호스트 조직을 분리하고 기증자의 조직 이식 <ol><li> 기증자로 수행으로, 호스트 태아의 신경관에서 신경 배를 분리합니다. 기증자의 조직과 동일한 크기의 이식을 제거하기 위해주의하십시오. </li><li> 부드럽게 멀리 배아에서이 호스트 조직을 누릅니다. </li><li> 그런 다음, 무딘 텅스텐 바늘 또는 MI의 둥근 팁cropipette 부드럽게 적절한 전후면 및 dorso - 복부 방향을 유지, 기증자 신경 호스트 신경 튜브에 접어 이동합니다. 이식이 측면을 따라 자리 잡고 있습니다 있는지 확인하지만 찌를 또는 기본 조직에 손상되지 않도록해야합니다. 원래 방향 노트의 중립 레드에서 기증자의 조직 또는 차등 염색의 모든 비대칭을 추적 할 수 있도록하십시오. 또한 광 문서 수반 적출 조직뿐만 아니라 키메라와 도너 배아 즉시 수술 다음. </li><li> 호스트 배아가 건조의 흔적이있는 경우 멸균 식염수는 계란에 추가해야합니다. </li><li> 이제 조심스럽게 재 밀봉하고 알을 레이블을 조심스럽게 키메라 배아 분석을 위해 원하는 단계로 발전 할 수 습도가 높은 인큐베이터 (70-80 %)로 돌아갑니다. </li></ol> 키메라의 8. 컬렉션 <ol><li> 갓 만든 차가운 세라의 정착에 키메라 배아를 수집하고 즉시 RO에 배치해야합니다O / N 고정 용 4 ° C에서 cker. 이것은 안티 - 메추라기 항체와 메추라기 세포의 민감한 탐지를 위해 수 있습니다. </li><li> 유전자 발현은 RT-qPCR에를 통해 분석의 경우, 이전의 RNA 추출에 액체 질소에 직접 배아를 동결. </li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

신경 능선은 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 두개 안면 골격에 기여 연골 세포와 조골 세포 등 다양한 세포 유형으로 분화 과도 배아 세포 집단이다. 메추라기 오리 키메라 시스템에 신경 능선을 이식하면 두개 안면 골격의 발달을 조절하는 조직의 상호 작용과 신호 전달 경로에 대한 우리의 이해에 크게 기여하고있다. 그러나, 또한 평활근 세포, 지방 세포, 멜라닌 세포, 슈반 세포 및 신경 세포를 생성하는 신경 능선의 거대한 잠재력 주어진 메추라기 오리 키메라 시스템은 특히 줄기 세포 생물학의 급속한 발전과 함께 미래의 응용 프로그램에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 재생 의료. 메추라기와 오리는 모두 상업적으로 사육 종 때문에, 상대적으로 저렴한 수정란의 준비가 공급 농장의 다양한 사용할 수 있습니다. 따라서,이 기술은 researc에 액세스 할 수 있어야합니다그녀는 예산 및 설비 공간의 넓은 범위 내에서 동작. 이 기술은 매우 강력하지만, 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다. 다른 수술 기법과 마찬가지로, 메추라기 오리 키메라의 질과 생존은 연구원의 수술 기술에 의존하고, 따라서, 그 이용하여 마우스와 같은 다른 모델에 비해 실험 사이에 더 많은 상호 및 개인 내 변화가있을 것입니다 유전학. 또한, 재현성 및 각 이식의 성공에 기여 개발 및 개별 배아 단계의 비율의 변화도있다. 조류 배아는 탈수에 매우 민감하고 수술하는 동안 따라서 중요한 단계는 최소한으로 현미경, 낮은 시간을 가벼운 수준을 유지하는 등, 가능한 한 많은 테이프로 밀봉 달걀, 수술 후 인큐베이터에서 높은 습도 건조를 방지. 키메라의 생존, U의 측면에서이 비율은 나이가에게 수집 단계를 줄일 수 있지만 sually 사이 50-75%는 남아있다. 수술의 일반적인 4 ~ 6 시​​간 세션에서, 숙련 된 외과 의사가 15 키메라를 생성 할 수 있습니다. 이식의 성공은 또한 도구의 품질에 크게 의존한다. 좋은 도구는 더 일관성, 재생 가능한 결과로 이어집니다. 텅스텐 바늘을 만들기 위해 프로판 토치를 사용하는 것은 매우 날카로운 바늘이 될 수 있습니다. 그것은 불꽃의 크기를 제어하기 때문에 사용되는 토치의 종류는 큰 차이가 있습니다. 전해 샤프닝도 사용될 수 있지만,이 방법도 같은 날카로운 바늘을 제조 부근에 오지 않는다. 바늘을 똑바로 할 수 있도록하는 대신 스풀 와이어 텅스텐 막대를 사용하십시오. 스페의 마이크로 피펫은, 시간 소모적이고 어려운하게는, 조직 입금위한 이상적인 계기된다. 피펫은 서로 다른 크기의 구멍으로 정의 할 수 있고, 반복적으로 사용할 수 있습니다. 저기서을위한 중요한 요소조지아 스페의 마이크로 피펫은 배아의 표면에 끝을 만지기 전에 피펫에 약간의 액체를하는 것입니다. 접촉이 배아에 메 니스 커스 (meniscus)에 성공하면 유체의 일부가 유출됩니다. 약간 다이어프램에 최대시키는 것은 부드럽게 피펫에 기증자의 이식 조직을 빨아 반면 다이어프램에 누르면, 유체 및 이식 조직은 매우 정밀하게 배출 할 수 있습니다. 다이어프램에 긍정적 인 압력의 비트를 유지하는 것은 전송 중에 피펫의 끝에 기증자 이식 조직을 유지하고, 다이어프램에 약간의 추가 압력은 기증자의 이식 조직이 의도적으로 호스트에 배치 할 수 있습니다. 저장 및 살균 동안 스페 피펫의 보호를 위해, 넓은 끝에서 전구를 제거하고 조심스럽게 전구에 테이퍼 끝을 삽입합니다. 알루미늄 호일로 상단을 커버하고, 수술 전에 압력솥, 유리 시험관에 스페 피펫을 놓습니다. 여러 피펫은 다시가되면수술을 다시 멸균 할 ADY는 피펫을 반전 증류수 유리 세제의 동일한 솔루션에 종기에 약을 가열 한 후 증류수로 반복하여 씻어. 개별 튜브의 오토 클레이브 피펫. 그들은 어둡게 표시하고 뻣뻣한 될 때 다이아 프램 및 고무 전구를 형성하는 고무 튜브는 몇 가지 불임 후 대체 될 것이다. 이 프로토콜의 구성 요소의 대부분은 위험한 장비를 포함한다. 예를 들어, 스페 마이크로 피펫 만들기위한 과정을 3 화염의 종류뿐만 아니라 난방, 당기 불고, 굽힘, 절단, 유리 연마를 포함한다. 따라서, 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하는 고글 등의 안전을 증가하고 실험실 코트 중요하다. 또한, 많은 사람들이 고통, 또는, 계란 알레르기를 개발 계란을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에. 마음에 이러한주의 사항은, 메추라기 오리 키메라 시스템으로 전많은 미래의 응용 프로그램이 SA, 안전하고 효율적이며 비교적 접근 방법.

얼굴 골격은 외배엽과 내배엽 상피 층 1-11으로 둘러싸인 신경 능선과 중배엽 중간 엽으로 구성되어 여러 얼굴 프로세스의 성장과 융합에서 개발하고 있습니다. 각 프로세스 내에서 형태 발생 이벤트는 중간 엽과 주변 상피 12 ~ 16 사이의 뚜렷한 신호의 상호 작용에 의해 적용됩니다. 이러한 신호의 상호 작용 및 / 또는 하류 이펙터 변경은 질병 표현형에 기여하고 또한 두개 안면 골격 (17, 18)의 진화와 관련이있을 수 있습니다. 따라서 조직의 상호 작용의 타이밍과 성격을 해명하는 안면 골격의 발달과 진화 생물학에 대한 우리의 이해를 높이기 위해 큰 잠재력이있다. 조직의 상호 작용을 조사하기 위해 키메라 배아의 사용은 발달 생물학의 오랜 역사를 가지고 있습니다. 이 방법은 한스 스페 만과 그의 실험실에 의해 개척되었다다른 양서류 종의 배아 사이의 조직을 이식하여 배아 &quot;조직&quot;을 발견 한 사람. 스페 손으로 기술 전문 도구, 특히 스페 피펫 자신의 개발에 의해 보완 된 마이크로 수술 기법의 주인이었다. 빅토르 햄버거 스페의 노벨상을 주도 원래의 이식 실험을 수행 할 때, 이는 1920 년대 프라이 부르크에있는 한스 스페 만의 실험실에서 대학원생이었다. 햄버거는 1935 년 세인트 루이스의 워싱턴 대학으로 이동했을 때, 그는 실험 발생학 19 일 자신의 매뉴얼에 스페의 마이크로 피펫을 만드는 과정을 자세히 설명합니다. 드류 Noden 매사추세츠 애 머스트 대학에 다음 코넬 대학으로 이동 한 후, Noden는 제조와 메추라기 - 병아리 키메라를 포​​함하는 자신의 수술 이식 스페의 마이크로 피펫을 사용하여 계속했다. 1,972까지 워싱턴 대학에서 햄버거의 실험실에서 대학원생이었다. &amp;# 160;. 대학원생, 1995-1998 코넬에서 드류 Noden과 훈련 저자 (서식 슈나이더) 중 하나 스페의 마이크로 피펫을 만들기위한 다음과 같은 프로토콜이 햄버거 Noden 작성한 설명을 기반으로하고 만든 이후의 변경을 포함하는 동안 슈나이더. 두개 안면 개발의 연구에 특히 신경 능선 세포의 기여를 이해하기위한 메추라기 - 병아리 키메라의 사용은 르 Douarin 등 20에서 검토, 1970 년대 초에 Noden로와 르 Douarin에 의해 개척되었다. 이 방법은 광범위하게 많은 연구 및 많은 다른 연구자 1, 4, 5, 21-38에 의해 채택되었다. 성장과 메추라기와 병아리의 형태의 상당 비율은 세포의 운명과 혈통 추적 연구에 대한 그 안에 이식에 적합하다. 그러나, 메추라기와 여자 사이의 유사성, 형태 학적 변화는 산업사공여 세포로 uced는 해독하기가 어렵다. 반면, 다른 조류 키메라 시스템은 39-50 배아는 해부학 적으로 구별 할 메커니즘을 연구하는 방법으로 국내 오리를 포함했다. 보다 구체적으로, 메추라기 오리 키메라 시스템은 호스트, 그 반대의 도너의 효과 조건에 대한 여러 이점을 제공한다. 첫째, 메추라기와 오리 배아는 유전자 발현 (그림 1 A와 B)의 차동 도메인에 대한 시금에 의해 패턴 형성의 기증자 또는 호스트 고유의 메커니즘을 탐구하는 직접적인 방법을 제공 신체의 크기와 모양에서 구분된다. 둘째, 메추라기와 오리 배아는 메추라기 17 일 부화 오리 2​​8 일 부화와 성숙의 상당히 다른 비율이있다. 이식 된 신경 능선은 호스트 환경 내에서 극한 성숙 율을 유지하고, 따라서, 시간적 유전자 발현의 변화, 조직 상호 작용 histogenesis 및 형태 형성의 식별이 가능하다51-57. 마지막으로, 안티 - 메추라기 핵 항체 (PN ¢ Q)는 기증자와 호스트 세포 기여 재하 메추라기 세포에서 발현하지만 오리 세포에서 존재하는 단백질을 인식하여 서로 영구적으로 구별 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>텍</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>행크 s BSS w/o 페놀 레드</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>중립 레드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 &마이크로; m 필터 멸균</td></tr><tr><td>18G 바늘</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No. 5 Dumont 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>곡선 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Spemann 피펫</td><td></td><td></td><td>실험실에서 손으로 만든</td></tr><tr><td>계란 홀더</td><td></td><td></td><td>유리 재떨이 및 모델링 점토</td></tr><tr><td>알코올 버너</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>투명 테이프</td><td>3M 스카치</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>유리 교반 막대</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td> 팁은 화염 텅스텐 와이어 (0.004 x 3 인치) A-M 시스템 7190<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>을 사용하여 좁고 둥글게 만듭니다.팁은 프로판 토치에서 화염 연마</td></tr><tr><td>Bunsun 버너</td><td>Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9인치(229mm)</td></tr><tr><td>고무 튜빙</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>호박색, 얇은 벽 천연 고무; 벽 두께: 0.0625인치/1.6mm; O.D.: 0.375인치/9.5mm; I.D.: 0.25 in/6.4 mm</td></tr><tr><td>프로판 연료 실린더</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9, 나사식 황동 "연필 불꽃" 토치가 있는 토치 스타일 "A"</td></tr><tr><td>다이아몬드 포인트 펜슬</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-268912</td><td></td></tr><tr><td>고무 전구</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

키메라 배아의 생성은 세포의 운명, 조직의 상호 작용 및 조직 학적 및 척추 동물의 배아의 형태 개발에 종 특정 기여를 연구하는 광범위하고 강력한 방법입니다. 특히, 키메라 배아의 사용은 두개 안면 복합체의 종 특이 형태를 연출 신경 능선의 중요성을 설치했다. 여기에서 설명하는 방법은 매우 다른 두개 안면 형태로, 두 조류 종, 오리와 메추라기를 사용합니다. 이 방법은 크게 두개 안면 복잡한의 종 - 특정 패턴의 분자 및 세포 규제의 조사를 용이하게한다. 메추라기와 오리 키메라 배아 실험은 이미 신경 능선 매개 조직의 상호 작용과 두개 안면 골격, 근육, 및 외피에있는 종의 특정 패턴을 조절하는 세포 자율적 인 행동을 계시했다. 신경 능선 파생 상품의 다양성은 상당한 잠재력을 제안합니다척추 동물의 개발, 질병, 진화를 이해하는 메추라기 오리 키메라 시스템의 미래 응용 프로그램에 대한.

앞서 추가 분석으로, 이식의 효율을 정량 할 필요가있다. 조직 학적를 들어, 형태, 또는 유전자 발현이 조직 샘플에 대한 분석, 메추라기 세포는 36 바와 같이 Q ¢ PN 항체를 이용하여 면역 조직 화학 염색에 의해 감지해야합니다. RNA 분석의 경우, 그 조직에 종 특이 포스팅은 PCR-기반 전략 (58)을 사용하여 계산 될 수있다. 이식의 효과를 검증 한 후, 추가로 형태 학적 또는 분자 결과 측정은 키메라에서 평가 될 수있다. 기증자 신경 능선 세포와 적절한 histogenesis 및 두개 안면 복합의 형태 형성의 기초가 주변 호스트에서 파생 된 조직 사이의 상호 작용은 이전에 광범위하게 연구되고있다. 특히, 신경 능선 중간 엽 얼굴의 종 특이 형태 7, 13, 51, 59, 깃털 패턴 (52), 근육의 패턴 (56)을 지시 </s<html> 업&gt;, 및 연골 (53), 호스트 유전자 발현의 조절을 통해 57. 예를 들어, 신경 능선 중간 엽 시간적 BMP4 식 (55)를 조절하여 하악의 경우 뼈의 형태를 지시한다. 최근 조사는 초기 두개 안면 개발에서 발생하는 조직의 상호 작용을 중심으로했다. 이와 관련, 메추라기 오리 키메라를 활용 실험은 호스트 배아 형태의 경계를 결정하여 신경 능선 마이그레이션에 영향을 보여 주었다. 즉, 키메라 quck 배아 기증자 메추라기 신경 능선 세포가 오리와 같은 패턴 (그림 1D)의 호스트 오리 하악 아치로 마이그레이션합니다. 신경 능선 인구의 크기에이 호스트에 기여에도 불구하고, 기증자 신경 능선 메추라기와 같은 크기와 모양 (그림 1E)에있는 하악 골격을 생성하고 있습니다. 전자 1 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot; &quot;FO : SRC =&quot;6 인치 / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 메추리 오리 키메라 시스템. 생성 (A) 메추라기와 (B) 오리 두개골 크기와 모양에 상당한 차이를 표시하고, 따라서, 이상적 (TOKIA 등. 56에서 수정) 두개 안면 개발을 연구하는 키메라 시스템을 사용에 적합합니다. (C) 실험 디자인 무대 일치 HH9.5 메추라기와 오리의 배아에서 일방적 인 키메라 배아 quck. 신경 배 메추라기 배아의 한쪽에서 제거하고 오리 배아에 이식 신경 배의 동등한 조각 후 제거되었습니다. (D) 메추라기 공여 세포 (녹색) 항 메추라기 항체 (Q를 사용하여 키메라에 따라 할 수있다 HH12 키메라 배아의 복부보기 참조) PN을 ¢. (F) HH38에서 quck 턱에서 메추라기는 메켈에게 기증자의 유래7;의 연골이 크고 만곡 반대측 오리 호스트 유래 메켈의 연골, 관찰보다 짧고 곧은입니다. 재판 토 키타 외., 개발. 바이오. 306, 377 (2007) 엘스 비어의 허가.

이 문서에서는 두개 안면 개발에 신경 능선 및 / 또는 기타 조직의 종 특정 기여를 테스트하기 위해 설계 키메라 배아를 생성하는 방법을 설명합니다.

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

본 절차의 전반적인 목적은 메추라기 도관 키메라를 이용하여 두개안면 발달 과정 중 신경 능선 세포가 종 특이적 패턴을 생성하는 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이를 위해 먼저 9.5단계 메추라기 배아의 중뇌 및 전후뇌 영역에서 신경 접힘의 일부를 절제하여 제거합니다. 두 번째 단계에서는 공여체인 메추라기의 신경 접힘을 수용체인 오리 배아로 이식합니다.세 번째 단계에서는 9.5단계 오리 호스트 배아의 해당 부위를 절개하여 제거합니다. 마지막 단계로, 코일 신경절을 오리의 중뇌 및 후뇌 전방 부위에 배치합니다. 최종적으로, 이렇게 생성된 키메라 배아는 in situ hybridization을 통해 신경능선에 의한 유전자 발현 변화를 정확히 파악할 수 있으며, 조직학적 분석을 통해 형태학적 변화 또한 확인할 수 있습니다.저는 샌프란시스코의 오션 비치 위로 갈색 펠리컨들이 날아가는 모습을 보았을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 저는 신경능세포가 펠리컨의 긴 부리 골격을 구성하는 뼈와 연골을 형성하기 때문에, 이 세포들이 종 특이적 패턴의 기원이 됨을 깨달았습니다. 비록 갈색 펠리컨의 알을 구할 수는 없었지만, 흰색 페킨 오리의 알은 구할 수 있었습니다.샌프란시스코는 아시아 이외의 지역에서 가장 큰 차이나타운을 보유하고 있습니다. 메추라기와 오리 사이의 성숙 속도 및 형태학적 차이를 이용함으로써, 이 방법은 종 특이적 패턴의 기원을 이해하는 것과 같은 발생 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 수술은 제 실험실의 박사후 연구원인 Jennifer Fish 박사가 수행하며, 대학원생인 Kate Ovitz가 보조할 예정입니다. 분젠 버너를 사용하여 파스퇴르 피펫의 좁은 끝부분을 유리 테이퍼를 따라 녹기 시작할 때까지 가열하십시오. 불꽃에서 떼어낸 후, 피펫 끝이 밀봉될 때까지 당기십시오.테이퍼진 부분의 일부 외경이 0.7에서 1mm 사이인지 확인하십시오. 그런 다음 테이퍼 부분에서 약 4cm 떨어진 밀봉된 끝단을 부러뜨려 제거하십시오. 다음으로, 피펫의 개방된 끝단에 약 2피트 길이의 고무 튜브를 연결하고 반대쪽 끝단에는 블로우 장치를 부착하십시오.튜브를 통해 부드럽게 바람을 불어넣는 동안 피펫의 연결 부위나 반대쪽 끝으로 공기가 새어 나오지 않아야 합니다. 프로판 펜슬이나 화염 토치를 사용하여 테이퍼(taper)가 시작되는 바로 아래쪽 피펫의 한쪽 면에 타원형 영역을 가열하십시오. 유리가 바깥쪽으로 팽창하기 시작하는 즉시 피펫을 불꽃에서 떼고 고무 튜브를 통해 부드럽게 바람을 불어넣으십시오.이렇게 하면 유리의 가열된 부분이 소시지 모양의 기포를 형성하게 됩니다. 너무 많은 압력을 가하면 유리 기포가 터질 수 있으므로 주의해야 합니다. 결과적으로 피펫에 형성된 창의 너비는 약 1cm, 길이는 1.5~2cm가 되어야 합니다.이제 가늘어지는 끝부분이 위를 향하게 한 뒤, 튜브를 통해 부드럽게 바람을 불어 유리 파편이 피펫 내부로 들어가는 것을 방지하면서 기포 부분을 긁어내어 유리 폐기물 용기에 버립니다. 그런 다음 프로판 토치 화염을 사용하여 기포의 남은 가장자리를 조심스럽게 태워 없애고, 열린 창의 측면을 화염 연마(fire polish)합니다. 다음으로 다이아몬드 팁 펜슬을 수직으로 세워 잡고, 피펫의 가늘어지는 부분이 시작되는 지점에서 1cm 떨어진 곳에 금을 긋습니다.핀셋을 사용하여 표시선 부분의 피펫을 조심스럽게 부러뜨립니다. 팁을 제거한 후, 해부 현미경으로 확인하여 절단면이 거칠지 않고 깨끗하게 부러졌는지 확인하십시오. 피펫 팁에서 약 9.5 millimeter 떨어진 개방된 창 부분 위에 검지 손가락을 올려 연필을 잡듯 피펫을 잡습니다.피펫을 알코올 램프의 불꽃 가장자리에 대어 유리 부분을 부드럽게 만듭니다. 해부 현미경 하에서 핀셋으로 팁 부분에 압력을 가해 피펫의 좁은 끝부분을 60도 각도로 구부립니다. 알코올 램프를 사용하여 팁 부분을 빠르고 조심스럽게 화염 연마합니다.완성된 개구부는 둥글고 막힘이 없어야 합니다. 화염에 너무 오래 두면 팁이 수축되어 사용할 수 없게 되므로 주의하십시오. 이제 2.5 centimeter 길이의 고무 튜브에 70%ethanol을 도포하여 윤활합니다.피펫의 샤프트 아래쪽부터 위쪽으로 밀어 올려 열린 창 부분을 덮습니다. 그런 다음 피펫의 열린 끝부분에 2 mL 라텍스 벌브를 장착합니다. 내부 공기압을 유지하기 위해, 먼저 숙주란을 준비합니다.화염으로 날카롭게 만든 텅스텐 바늘을 사용하여 Vitale 막을 절단하고, 해당 막을 배아 위로 당겨 덮습니다. 그 후 공여란에서 했던 것과 동일하게 테이프로 알을 다시 밀봉합니다. 공여란 윈도우 부분의 테이프를 제거하여 공여 배아로부터 신경배절(neural fold)을 절단합니다.화염으로 끝을 날카롭게 만든 텅스텐 바늘을 사용하여 신경관의 양측에 절개선을 만듭니다. 그런 다음 이식편의 원하는 전방 및 후방 수준에서 신경관을 가로질러 절단하고, 이식편을 나머지 신경관으로부터 조심스럽게 분리합니다. 공여 조직이 올바르게 정렬될 수 있도록 이식편의 전방 및 후방 모양과 같은 구체적인 해부학적 세부 사항에 주의하십시오.호스트에 배치할 때, 텅스텐 바늘이 매우 날카로운지 확인하십시오. 조직을 완전히 그리고 한 덩어리로 제거하기 위해 빠르고 신중하게 절개하십시오. 샴안 피펫(shaman pipette)을 사용하여 공여 배아에서 신경배(neural fold)를 제거하십시오. 액체를 최대한 적게 흡입해야 조직이 전이 과정에서 떠내려가는 것을 방지할 수 있습니다.이제 호스트 알 창문의 테이프를 제거하고, 샤만 피펫을 사용하여 공여체 신경절(neural fold)을 이식받을 신경관 부위의 인접한 호스트 배아 옆에 배치합니다. 그런 다음 공여체에서 수행했던 것과 동일하게 호스트 배아의 신경관에서 신경절을 분리합니다. 이때 공여체 조직과 동일한 크기의 이식편을 제거하도록 주의하십시오.이 숙주 조직을 배아로부터 조심스럽게 밀어냅니다. 그 다음, 뭉툭한 텅스텐 바늘이나 마이크로 피펫의 둥근 팁을 사용하여, 적절한 전후 및 배복 방향을 유지하며 공여 신경절(neural fold)을 숙주 신경관(neural tube) 내부로 부드럽게 이동시킵니다. 이식편이 측면을 따라 잘 삽입되었는지 확인하되, 하부 조직을 찌르거나 손상시키지 않도록 주의하십시오.멸균 식염수를 숙주 배아 위에 조심스럽고 부드럽게 도포해야 합니다. 건조 징후가 보이면, 이제 알을 조심스럽게 다시 밀봉하고 라벨을 부착한 뒤, 키메라 배아가 분석에 필요한 단계까지 발달할 수 있도록 고습도 인큐베이터에 부드럽게 되돌려 놓으십시오.분석을 위해, 갓 제조한 차가운 Sarah's 고정액에 키메라 배아를 수집하십시오. 그 후 즉시 4 °C의 로커(rocker)에 올려두고 하룻밤 동안 고정시키십시오. 이렇게 하면 항-메추라기 항체(anti quail antibody)를 이용한 메추라기 세포의 검출 감도를 높일 수 있습니다.실시간 정량 PCR을 이용한 유전자 발현 분석의 또 다른 중요한 단계는 RNA 추출 전에 배아를 액체 질소에 급속 냉동하는 것입니다. 코일피시와 오리피시는 크기와 형태에서 상당한 차이를 보이므로, 이들의 배아는 두개안면 발달을 연구하기 위한 키메라 시스템을 구축하는 데 매우 적합합니다.구체적으로, 이 시스템은 신경능선세포의 역할을 조사하는 데 유용합니다. 키메라 qua 배아의 안면 골격 형성 과정에서, 기증자인 메추라기의 신경능선세포가 수용자인 오리의 하악궁으로 이동합니다. 복측 뷰에서 항-메추라기 항체를 통해 관찰하면, 메추라기 기증 세포가 녹색으로 나타나며 오리와 유사한 패턴을 보입니다.12단계 키메라 배아에서 공여된 신경능은 크기와 모양이 메추라기와 유사한 하악 골격을 생성합니다. 숙련되면 각 이식은 약 5분 내에 완료할 수 있습니다. 적절하게 수행하더라도 시간이 이보다 더 길어지면 배아가 건조해질 위험이 있으며 생존율이 감소하게 됩니다.이 절차를 수행하는 동안 자세에 유의하고, 어깨의 힘을 뺀 상태에서 적절한 손 위치를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 일관된 루틴을 만들어 수술 도구와 시약을 항상 같은 위치에 배치함으로써, 현미경에서 시선을 떼지 않고 자동화된 방식으로 손을 움직일 수 있도록 하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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배우세요 메추라기-오리 키메라 기법을 이용하여 신경줄기세포가 두개안면 발달에서 종특이적 패턴을 생성하는 메커니즘을 연구하는 방법입니다. 이 기법은 발달생물학 및 진화생물학 연구에 중요한 도구를 제공합니다.

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